CN117187434A - 一种青花菜kasp分子标记、引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青花菜KASP分子标记、引物组及其应用，所述KASP分子标记基于甘蓝基因组和重测序KASP技术，还开发了青花菜的KASP引物组，根据所开发的SNP位点以及设计的引物可以用于构建所选群体的DNA指纹图谱、品种鉴定及种子纯度鉴定等，实现了对青花菜种质资源和种子纯度的快速、准确、有效地鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种青花菜KASP分子标记、引物组及其应用。
背景技术
青花菜(Brassica oleracea var.italica)营养全面，营养成分含量位居同类蔬菜之首，还含有防癌抗癌物质莱菔硫烷，花球状似皇冠，被誉为“蔬菜皇冠”。随着国民对青花菜的食用方法和营养价值认识逐步深化，青花菜消费得到了较大发展，种植面积逐年增加。近年来，国内很多育种单位积极开展青花菜遗传育种研究工作，培育出了大量优良品种，这也导致了市场上同名异物及同物异名的情况出现，甚至一些不合格种子混入市场造成重大经济损失，因此对青花菜种质资源的快速准确鉴定对于假种辨别和解决产权纠纷具有重要意义。
近年来，随着分子标记技术的迅速发展，使品种鉴定以及种子纯度鉴定进入了DNA水平，因其具有较高的准确性、稳定性和重复性，为作物品种纯度分析提供了更为准确、可靠的结果。RFLP标记在于呈现共显性，能够区分纯合型和杂合型，在基因组中应用范围广泛但其DNA模板量需求过大，操作过程技术难度较高，多态性的灵敏程度不高，且检测时必须用到放射性元素，对环境造成污染。SSR标记是共显性标记可鉴别纯合型和杂合型，所需的DNA样品量少，对DNA的要求不高，操作简单，可靠性强，具有大量的等位差异性，无需使用放射性同位素，但必须明确重复基序两端的DNA序列，如果不能直接在DNA数据库中查找到则需要再次进行测序，成本高。
单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因组内单个核苷酸改变而引起的DNA序列多态性。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allelespecific PCR，KASP)是一种以SNP为基础的第三代新型基因分型技术，该技术能够精确区分双等位基因。KASP-SNP标记是由KASP技术转化后用于植物遗传育种的一种SNP标记，具有数量丰富、密度高、遗传相对稳定、精确性和效率更高、在基因组中分布范围广以及易于实行自动化、规模化的分析等优势。KASP技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels***和缺失，采用2个荧光探针、2个通用淬灭探针再加多个位点特异探针来检测多个SNP位点，采用全自动荧光定量PCR平台，读取数据，进行基因分型。准确性KASP的特异性引物片段长度通常为24～26bp，相比较一般采取8～12bp长度的Taqman探针会有更高的特异性，SNP的准确性也会更高。在进行配置KASP反应体系时，只需要加入非常少量的样本DNA，100ng/μL的样本DNA在配置10μL的反应体系时只需要加入1μL，从而减少了试剂的消耗，极大地降低了成本，而且反应不需要进行常规的凝胶电泳，在试验结束时就可以观察到基因的分型情况。KASP检测平台也可以同时检测大量位点、少量样本或者少量位点、大量样本等低、中、高通量研究以及单个实验。
发明内容
本发明的目的是提供一种青花菜KASP分子标记、引物及其应用，可实现对青花菜种质资源和种子纯度能够快速、准确、有效地鉴定。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：
一种青花菜KASP分子标记，所述分子标记包括以下中的至少一个：A01_3094927A/C，A01_3842008A/T，A01_4265358T/C，A01_6357104G/A，A01_11115570T/G，A02_4516825C/G，A02_15912500G/T，A02_19891434C/T，A02_31451277A/T，A02_31459473C/T，A02_35442443G/C，A02_52870426C/A，A03_194735A/G，A03_17277365G/C，A03_21841464G/A，A03_23315341A/G，A03_26267190A/C，A04_17751632T/C，A05_6673288C/G，A05_51262859T/C，A06_7964853C/T，A07_30545769A/G，A07_41422657A/G，A08_19117011A/G，A08_32458241C/T，A09_51531182A/T，A05_19534233C/T，A05_39660832T/G，A06_4137036G/T，A06_26279196A/G，A06_39685055A/T，A07_21825990G/A，A07_48699362G/C，A08_45812224A/G，A08_49976809G/A，A09_3229095C/T，A09_17283492C/T，A09_66305140T/C，A03_11121340T/C，A03_11351714T/A，A03_11871947G/C，A03_28446819C/A，A03_30492535T/A，A03_60864739A/G，A03_67910447G/C，A03_71281157T/C，A03_72433966T/G，A04_1537694G/A，A04_6100592T/C，A04_8619968T/C，A04_10843478A/G，A04_13090388T/C，A04_15728660A/T，A04_16222652T/C，A01_1890299T/C，A01_9011904T/G，A01_9931508A/G，A01_38066952T/C，A02_4513465T/C，A02_9066005A/T，A02_26114498C/A，A02_33106778A/G，A02_43062531G/C，A02_53072585T/C，A02_56173024A/C，A02_59470911T/A，A02_61720722G/A，A03_3305462G/T，A03_3893711C/T，A03_9449082A/G。
本发明的另一目的是提供用于扩增所述的KASP分子标记的引物组，A01_3094927A/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.1所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.3所示；A01_3842008A/T的正向引物F1的序列如SEQ IDNO.4所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.6所示；A01_4265358T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.7所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.8所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.9所示；A01_6357104G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.10所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物R的序列如SEQ IDNO.12所示；A01_11115570T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.13所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.14所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.15所示；A02_4516825C/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.16所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.18所示；A02_15912500G/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.19所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.20所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.21所示；A02_19891434C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.22所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.23所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.24所示；A02_31451277A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.25所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.26所示，反向引物R的序列如SEQ IDNO.27所示；A02_31459473C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.28所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.29所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.30所示；A02_35442443G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.31所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.32所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.33所示；A02_52870426C/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.34所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.35所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.36所示；A03_194735A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.37所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.38所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.39所示；A03_17277365G/C的正向引物F1的序列如SEQID NO.40所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.41所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.42所示；A03_21841464G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.43所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.44所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.45所示；A03_23315341A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.46所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.47所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.48所示；A03_26267190A/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.49所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.50所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.51所示；A04_17751632T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.52所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.53所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.54所示；A05_6673288C/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.55所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.56所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.57所示；A05_51262859T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.58所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.59所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.60所示；A06_7964853C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.61所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.62所示，反向引物R的序列如SEQ IDNO.63所示；A07_30545769A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.64所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.65所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.66所示；A07_41422657A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.67所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.68所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.69所示；A08_19117011A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.70所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.71所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.72所示；A08_32458241C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.73所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.74所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.75所示；A09_51531182A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.76所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.77所示，反向引物R的序列如SEQ IDNO.78所示；A05_19534233C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.79所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.80所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.81所示；A05_39660832T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.82所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.83所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.84所示；A06_4137036G/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.85所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.86所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.87所示；A06_26279196A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.88所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.89所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.90所示；A06_39685055A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.91所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.92所示，反向引物R的序列如SEQ IDNO.93所示；A07_21825990G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.94所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.95所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.96所示；A07_48699362G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.97所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.98所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.99所示；A08_45812224A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.100所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.101所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.102所示；A08_49976809G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.103所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.104所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.105所示；A09_3229095C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.106所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.107所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.108所示；A09_17283492C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.109所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.110所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.111所示；A09_66305140T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.112所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.113所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.114所示；A03_11121340T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.115所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.116所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.117所示；A03_11351714T/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.118所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.119所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.120所示；A03_11871947G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.121所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.122所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.123所示；A03_28446819C/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.124所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.125所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.126所示；A03_30492535T/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.127所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.128所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.129所示；A03_60864739A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.130所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.131所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.132所示；A03_67910447G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.133所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.134所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.135所示；A03_71281157T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.136所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.137所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.138所示；A03_72433966T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.139所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.140所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.141所示；A04_1537694G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.142所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.143所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.144所示；A04_6100592T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.145所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.146所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.147所示；A04_8619968T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.148所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.149所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.150所示；A04_10843478A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.151所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.152所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.153所示；A04_13090388T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.154所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.155所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.156所示；A04_15728660A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.157所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.158所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.159所示；A04_16222652T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.160所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.161所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.162所示；A01_1890299T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.163所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.164所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.165所示；A01_9011904T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.166所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.167所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.168所示；A01_9931508A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.169所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.170所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.171所示；A01_38066952T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.172所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.173所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.174所示；A02_4513465T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.175所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.176所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.177所示；A02_9066005A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.178所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.179所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.180所示；A02_26114498C/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.181所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.182所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.183所示；A02_33106778A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.184所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.185所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.186所示；A02_43062531G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.187所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.188所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.189所示；A02_53072585T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.190所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.191所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.192所示；A02_56173024A/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.193所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.194所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.195所示；A02_59470911T/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.196所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.197所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.198所示；A02_61720722G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.199所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.200所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.201所示；A03_3305462G/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.202所示，正向引物F2的序列如SEQ IDNO.203所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.204所示；A03_3893711C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.205所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.206所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.207所示；A03_9449082A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.208所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.209所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.210所示。
本发明的另一目的是提供所述的KASP分子标记或所述的引物组在构建青花菜种质资源指纹图谱中的应用。
本发明的另一目的是提供所述的KASP分子标记或所述的引物组在鉴定青花菜品种中的应用。
本发明的另一目的是提供所述的KASP分子标记或所述的引物组在鉴定青花菜父母本与子代差异中的应用。
本发明的另一目的是提供所述的KASP分子标记或所述的引物组在鉴定青花菜种子纯度中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明基于甘蓝基因组和重测序KASP技术，开发了一组用于青花菜鉴定的核心SNP标记，可实现对青花菜种质资源、杂交种纯度等快速、准确、有效地鉴定。
附图说明
图1为实施例1中引物SNP17在68份青花菜种质资源中的多态性图谱；
图2为实施例1中引物SNP22在68份青花菜种质资源中的多态性图谱；
图3为实施例2中36份青花菜品系SNP-DNA指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
(1)KASP分子标记的开发
KASP分子标记开发步骤：参考甘蓝基因组(http://brassicadb.cn/#/Download/下的Brassica_Genome_data/Braol_JZS_V2.0//)与重测序数据进行比对，经过vcftools(版本：0.1.16)进行过滤，参数设置为平均深度5X及以上，标记质量值30以上，最小完整度0.7以上，最小等位基因频率0.05，双等位标记等；多态信息含量0.2及以上，期望杂合度0.2以上等；用RepeatMasker(版本：4.1.0)标记基因组重复序列，去除重复序列上的SNP标记；截取SNP标记上下游各50bp序列，然后使用blast软件(版本：2.10.1+)把序列比对参考基因组，去除比对上2个(包括原有位置)及2个以上位置的标记；引物设计软件primer 3(版本：2.4.0)固定上游引物位置，并设计引物；每隔2Mb选取一个标记，保证每条染色体标记数量超过5对，然后实验检测KASP标记成功率。KASP分子标记对应的引物组SNP位置与等位基因如表1所示。
表1 70个青花菜核心SNP位点的相关信息
(2)KASP引物组的合成
依据开发的SNP位点转化为KASP引物组，引物组由编号SNP01-SNP70组成，均匀分布在9条染色体上，每一条染色体上设置至少5组引物，引物组具体信息如表2所示。每个KASP引物组用于扩增对应的SNP标记，每个引物组均由两个正向引物F1、F2以及一条反向引物R构成。在反应体系中主要成分为Primer Mix，它是由两条末端碱基不同的等位基因正向引物以及一条通用反向引物构成，两条正向引物5’端分别为不同序列的检测引物序列即荧光探针FAM与VIC，引物F1的5’端添加FAM荧光标签序列
GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；引物F2的5’端添加VIC荧光标签序列
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，另一主要成分为Master Mix，它能够检测两条正向引物中带有的不同荧光。通过两个等位基因特异性正向引物的竞争性结合，实现双等位基因的识别。
表2基于KASP技术开发的70个青花菜核心SNP分子标记的引物信息
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(3)品种的选定以及DNA提取
选用江苏丘陵地区镇江农业科学研究所蔬菜花卉研究室保存的68份青花菜品种，如表3所示。
表3 68份青花菜种质资源的详情表
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采用改良的CTAB法提取植物幼嫩叶片的DNA，具体方法如下：
步骤1，采取选定品种幼嫩的叶片0.1g，放入取样管中，放入液氮后研磨；
步骤2，在取样管中加入CTAB 600μL，涡旋仪震荡2-3min；
步骤3，65℃水浴30min，水浴期间手动震荡2-3次；
步骤4，加入三氯甲烷：异戊醇(24：1)600μL，手动摇晃5min；
步骤5，在离心机上常温，12000rpm，5min；
步骤6，吸取上清液400μL后加入800μL无水乙醇摇匀，-20℃冷却20min；
步骤7，将样品常温12000rpm，离心5min，倒出上清液晾干；
步骤8，晾干后的样品加入100μL的ddH2O，测定所提取的DNA的浓度与OD值。
将所提取的DNA稀释至20ng/μL，采用5μL的体系，KASP Master Mix 2.5μL，DNA 1μL、F1 0.05μL、F2 0.05μL、R 0.15μL、ddH2O 1.25μL。在ABI实时定量仪器上进行PCR扩增、PCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃-55℃退火延伸60s，共10个TouchDown循环(每个循环降低0.6℃)；第二轮PCR反应，95℃变性20s，55℃退火延伸60s，共36个循环。最后在25℃，30sec读取基因分型数据。
图1为引物SNP17在68份青花菜种质资源中的多态性图谱，图2为引物SNP22在68份青花菜种质资源中的多态性图谱。表示初始DNA浓度为20ng/μL时，68份青花菜材料及2个纯水阴性对照在2个SNP位点的KASP基因分型结果。其中靠近Y轴的点和靠近X轴的点表示两种不同的纯合基因型，处于坐标轴对角线上的点表示杂合基因型。
实时荧光定量PCR结果(图1、图2)表明，引物组SNP17和SNP22经体系扩增后，均能得到较好的KASP分型结果。
本发明的KASP基因分型技术对目标SNP/InDel进行精准的双等位基因分型，根据所开发的SNP位点以及设计的引物可以构建所选群体的DNA指纹图谱、品种鉴定、以及种子纯度鉴定等实验。
实施例2青花菜种质资源指纹图谱的构建
利用KASP平台对68个青花菜品系进行基因型检测。在70个标记中，43个KASP标记成功分型，11个未成功分型，9个未分型材料数>5，7个不具有多态性，为保证结果准确性，在后续分析中将这27个标记去除。
最终获得43个核心SNP标记用于构建青花菜种质资源的指纹图谱。利用43个核心KASP标记对36份江苏丘陵地区镇江农业科学研究所蔬菜花卉研究室的青花菜育种资源，如表4所示，进行基因型检测，构建青花菜种质资源DNA指纹图谱。将36份材料的核心位点分型结果转化为二元编码数据，得到的指纹图谱，如图3所示。利用该DNA指纹图谱可对江苏丘陵地区镇江农业科学研究所蔬菜花卉研究室青花菜种质资源进行有效区分。
表4 36份青花菜品种具体信息
实施例3青花菜杂交品种的鉴定
利用10个SNP位点所设计的引物组鉴定待测的青花菜品种是否为‘瑞绿10号’，随机选择一个待测品种与标准样品‘瑞绿10号’各10粒种子，采用上述改良的CTAB法提取DNA，之后在SNP01-SNP70的70个引物中随机挑选10个SNP位点进行PCR扩增统计基因分型结果，进行品种鉴定，检测结果如表5所示。
表5待测品种与标准样品‘瑞绿10号’在10个SNP位点上的分型结果
| 引物组编号 | 待测品种 | 瑞绿10号 | 引物组编号 | 待测品种 | 瑞绿10号 |
| SNP01 | A:A | A:C | SNP24 | A:A | G:G |
| SNP04 | G:G | G:G | SNP29 | G:T | T:T |
| SNP07 | G:T | G:T | SNP37 | C:C | C:C |
| SNP15 | G:A | G:A | SNP42 | C:A | C:C |
| SNP18 | T:T | T:T | SNP59 | T:C | T:T |
从表5中可知，根据基因分型结果进行比对，在SNP01、SNP24、SNP29、SNP42、SNP59的基因分型结果不同，判定待测品种不是‘瑞绿10号’。
实施例4寻找父母本与子代的差异SNP
利用所开发的70个KASP引物组，对母本‘Q204’、父本‘M23’进行杂交得到F1。选取子叶采用改良的CTAB法提取DNA，采用KASP技术进行基因型的检测，同时27个核心KASP-SNP标记进行基因分型检测，检测方法及PCR反应同上，检测结果如表6所示。
表6母本‘Q204’、父本‘M23’及其杂交种在27个SNP位点上的分型结果
| 引物组编号 | Q204 | M23 | F1 | 引物组编号 | Q204 | M23 | F1 |
| SNP01 | AC | CC | CC | SNP16 | GG | AA | GA |
| SNP03 | TT | TC | TC | SNP17 | AC | AA | AA |
| SNP04 | GG | AA | GA | SNP18 | TC | TC | TC |
| SNP05 | TT | TG | TT | SNP19 | CC | CG | CC |
| SNP07 | GG | TT | GT | SNP20 | CC | TC | CC |
| SNP08 | CC | CT | CT | SNP21 | CT | TT | TT |
| SNP09 | AT | AT | AA | SNP22 | AG | AG | GG |
| SNP10 | CC | CT | CC | SNP25 | CC | TT | CT |
| SNP11 | GC | CC | CC | SNP26 | TT | TT | TT |
| SNP12 | AA | CC | AC | SNP27 | TT | CT | TT |
| SNP13 | AG | GG | GG | SNP33 | GG | GC | GC |
| SNP14 | CC | CC | CC | SNP34 | GG | AG | AG |
| SNP15 | AA | AG | AG | SNP39 | TC | TT | TT |
| SNP43 | TA | TT | TA |
从表6中可知，KASP引物组筛选出‘Q204×M23’杂交种F1与父母本之间的差异SNP有SNP04、SNP07、SNP09、SNP12、SNP16、SNP22、SNP25。
实施例5种子纯度的鉴定
利用所开发的KASP标记鉴定杂交种‘Q204×M23’的纯度，根据所设计70个KASP引物组筛选出杂交种‘Q204×M23’一代与父母本之间的差异SNP有SNP04、SNP07、SNP09、SNP12、SNP16、SNP22、SNP25。随机挑取待测杂交种种子94粒，提取DNA。催芽后选取子叶和下胚轴采用改良的CTAB法提取DNA，采用KASP技术进行基因分型检测，选用SNP07这组差异引物进行杂交种种子纯度的鉴定，将94粒种子的DNA分别加入96孔板的94个孔中，剩余的2个孔做两个阴性对照，根据上述的反应体系以及PCR反应条件，获得94个待测杂交种种子样品在编号为SNP07的SNP标记位点的基因分型结果，统计结果表明：94个样品大部分表现为杂合基因型G：T，杂交种纯度为94.58％。
Claims (6)
1.一种青花菜KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记包括以下中的至少一个：A01_3094927A/C，A01_3842008A/T，A01_4265358T/C，A01_6357104G/A，A01_11115570T/G，A02_4516825C/G，A02_15912500G/T，A02_19891434C/T，A02_31451277A/T，A02_31459473C/T，A02_35442443G/C，A02_52870426C/A，A03_194735A/G，A03_17277365G/C，A03_21841464G/A，A03_23315341A/G，A03_26267190A/C，A04_17751632T/C，A05_6673288C/G，A05_51262859T/C，A06_7964853C/T，A07_30545769A/G，A07_41422657A/G，A08_19117011A/G，A08_32458241C/T，A09_51531182A/T，A05_19534233C/T，A05_39660832T/G，A06_4137036G/T，A06_26279196A/G，A06_39685055A/T，A07_21825990G/A，A07_48699362G/C，A08_45812224A/G，A08_49976809G/A，A09_3229095C/T，
A09_17283492C/T，A09_66305140T/C，A03_11121340T/C，A03_11351714T/A，
A03_11871947G/C，A03_28446819C/A，A03_30492535T/A，A03_60864739A/G，A03_67910447G/C，A03_71281157T/C，A03_72433966T/G，A04_1537694G/A，A04_6100592T/C，A04_8619968T/C，A04_10843478A/G，A04_13090388T/C，A04_15728660A/T，A04_16222652T/C，A01_1890299T/C，A01_9011904T/G，A01_9931508A/G，A01_38066952T/C，A02_4513465T/C，A02_9066005A/T，A02_26114498C/A，A02_33106778A/G，
A02_43062531G/C，A02_53072585T/C，A02_56173024A/C，A02_59470911T/A，A02_61720722G/A，A03_3305462G/T，A03_3893711C/T，A03_9449082A/G。
2.用于扩增如权利要求1所述的KASP分子标记的引物组，其特征在于，
A01_3094927A/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.1所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.2所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.3所示；
A01_3842008A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.4所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.5所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.6所示；
A01_4265358T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.7所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.8所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.9所示；
A01_6357104G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.10所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.11所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.12所示；
A01_11115570T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.13所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.14所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.15所示；
A02_4516825C/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.16所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.17所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.18所示；
A02_15912500G/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.19所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.20所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.21所示；
A02_19891434C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.22所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.23所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.24所示；
A02_31451277A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.25所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.26所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.27所示；
A02_31459473C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.28所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.29所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.30所示；
A02_35442443G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.31所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.32所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.33所示；
A02_52870426C/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.34所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.35所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.36所示；
A03_194735A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.37所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.38所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.39所示；
A03_17277365G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.40所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.41所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.42所示；
A03_21841464G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.43所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.44所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.45所示；
A03_23315341A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.46所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.47所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.48所示；
A03_26267190A/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.49所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.50所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.51所示；
A04_17751632T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.52所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.53所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.54所示；
A05_6673288C/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.55所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.56所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.57所示；
A05_51262859T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.58所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.59所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.60所示；
A06_7964853C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.61所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.62所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.63所示；
A07_30545769A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.64所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.65所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.66所示；
A07_41422657A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.67所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.68所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.69所示；
A08_19117011A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.70所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.71所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.72所示；
A08_32458241C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.73所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.74所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.75所示；
A09_51531182A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.76所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.77所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.78所示；
A05_19534233C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.79所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.80所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.81所示；
A05_39660832T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.82所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.83所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.84所示；
A06_4137036G/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.85所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.86所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.87所示；
A06_26279196A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.88所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.89所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.90所示；
A06_39685055A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.91所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.92所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.93所示；
A07_21825990G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.94所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.95所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.96所示；
A07_48699362G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.97所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.98所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.99所示；
A08_45812224A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.100所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.101所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.102所示；
A08_49976809G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.103所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.104所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.105所示；
A09_3229095C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.106所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.107所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.108所示；
A09_17283492C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.109所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.110所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.111所示；
A09_66305140T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.112所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.113所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.114所示；
A03_11121340T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.115所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.116所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.117所示；
A03_11351714T/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.118所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.119所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.120所示；
A03_11871947G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.121所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.122所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.123所示；
A03_28446819C/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.124所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.125所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.126所示；
A03_30492535T/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.127所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.128所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.129所示；
A03_60864739A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.130所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.131所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.132所示；
A03_67910447G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.133所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.134所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.135所示；
A03_71281157T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.136所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.137所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.138所示；
A03_72433966T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.139所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.140所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.141所示；
A04_1537694G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.142所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.143所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.144所示；
A04_6100592T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.145所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.146所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.147所示；
A04_8619968T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.148所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.149所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.150所示；
A04_10843478A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.151所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.152所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.153所示；
A04_13090388T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.154所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.155所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.156所示；
A04_15728660A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.157所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.158所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.159所示；
A04_16222652T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.160所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.161所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.162所示；
A01_1890299T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.163所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.164所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.165所示；
A01_9011904T/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.166所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.167所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.168所示；
A01_9931508A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.169所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.170所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.171所示；
A01_38066952T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.172所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.173所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.174所示；
A02_4513465T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.175所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.176所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.177所示；
A02_9066005A/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.178所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.179所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.180所示；
A02_26114498C/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.181所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.182所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.183所示；
A02_33106778A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.184所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.185所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.186所示；
A02_43062531G/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.187所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.188所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.189所示；
A02_53072585T/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.190所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.191所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.192所示；
A02_56173024A/C的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.193所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.194所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.195所示；
A02_59470911T/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.196所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.197所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.198所示；
A02_61720722G/A的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.199所示，正向引物F2的序列如SEQ ID NO.200所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.201所示；
A03_3305462G/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.202所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.203所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.204所示；
A03_3893711C/T的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.205所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.206所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.207所示；
A03_9449082A/G的正向引物F1的序列如SEQ ID NO.208所示，正向引物F2的序列如SEQID NO.209所示，反向引物R的序列如SEQ ID NO.210所示。
3.如权利要求2所述的KASP分子标记或如权利要求2所述的引物组在构建青花菜种质资源指纹图谱中的应用。
4.如权利要求2所述的KASP分子标记或如权利要求2所述的引物组在鉴定青花菜品种中的应用。
5.如权利要求2所述的KASP分子标记或如权利要求2所述的引物组在鉴定青花菜父母本与子代差异中的应用。
6.如权利要求2所述的KASP分子标记或如权利要求2所述的引物组在鉴定青花菜种子纯度中的应用。
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