CN109338009A

CN109338009A - 与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109338009A
Application number: CN201811513265.6A
Authority: CN
Inventors: 李俊星; 黄河勋; 邱悦菡; 王曼曼; 钟玉娟; 吴海滨; 罗剑宁; 龚浩
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-12-11
Also published as: CN109338009B

Abstract

本发明提供一种与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记定位于中国南瓜基因组的第10条染色体上，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了用于检测该InDel标记的特异引物和方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2‑3所示。利用本发明提供的特异性引物对，基于PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的电泳条带，将该InDel分子标记应用于筛选具有芋香味性状的南瓜，有利于确定具有芋香味的南瓜的客观判断标准，从基因型上快速、准确地判断南瓜芋香味性状，从而建立南瓜芋香味性状的分子辅助选择育种技术体系。

Description

与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物学领域，特别涉及一种与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记及其应用。

背景技术

南瓜芋香味性状在南瓜资源的风味性状中比较特殊，香味浓郁。具有芋香味性状的南瓜品种深受市场和消费者青睐。但是目前芋香味性状的判断主要还是依靠育种家的嗅觉判断，缺乏客观判断的标准。另外，香味性状的表现极易受到环境的影响，仅仅依靠表型的嗅觉判断会对资源筛选造成困扰。因此，有必要提供一种从基因型上快速准确的判断南瓜芋香味性状的方法，通过南瓜芋香味的基因定位，找到与芋香味紧密连锁的InDel分子标记，从而建立南瓜芋香味性状的辅助选择育种技术体系。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供与南瓜芋香味性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记定位于中国南瓜基因组的第10条染色体上，***的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述InDel分子标记在筛选具有芋香味性状的南瓜中的应用。

一种筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，包括：检测如上所述的与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记的引物对。

一种筛选具有芋香味性状的南瓜的试剂盒，其特征在于，包含有用于检测核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的InDel分子标记的试剂。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人大量创造性劳动，通过对南瓜芋香味的基因定位，找到与芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记定位于中国南瓜基因组的第10条染色体上，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该InDel分子标记及分子标记扩增引物应用于筛选具有芋香味性状的南瓜，有利于确定具有芋香味的南瓜的客观判断标准，从基因型上快速、准确地判断南瓜芋香味性状，从而建立南瓜芋香味性状的辅助选择育种技术体系。

附图说明

图1为实施例1中分子标记引物在亲本及F₁中PCR结果图；

图2为实施例2中分子标记引物在F₂单株中检测验证的PCR检测结果；

图3为实施例3中的分子标记引物在不同类型的中国南瓜资源中检测验证的PCR检测结果；

图4为实施例4中的标记引物应用于检测筛选育种改良材料的PCR检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的一种与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记，所述InDel分子标记定位于中国南瓜基因组的第10条染色体上，***的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(CGCTTTTTCCATCGATTTTGCTGGA)所示。该InDel分子标记可以在筛选具有芋香味性状的南瓜中应用。发明人发现，定位于中国南瓜基因组的第10条染色体上，核苷酸序列如SEQ IDNO.1的InDel分子标记与南瓜芋香味性状紧密连锁，能够区分具有芋香味形状的南瓜和不具有芋香味的南瓜。

本发明提供了一种筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，即可以通过检测上述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的与南瓜芋香味性状基因连锁的InDel分子标记，来筛选具有芋香味性状的南瓜，其中，检测到含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列。优选地，设计得到序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物，采用PCR法检测该InDel分子标记。具体地，筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，包括以下步骤：(1)提取南瓜的DNA；(2)以步骤(1)提取得到南瓜的DNA为模板，设计得到并采用核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物进行PCR扩增；(3)凝胶电泳检测：如果扩增产物中仅含有229bp条带，则待测南瓜为具有芋香味性状的南瓜。其中，所述PCR法的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，dNTP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物，PCR buffer。具体的PCR的扩增体系为：包含1U Taq酶，1μL模板DNA，1.5μL的dNTP，1μL引物，2μL的10×PCR buffer，加ddH₂O至20μL，扩增程序为：94℃3min，循环过程为94℃30s、52℃30s、72℃30s、30个循环，最后72℃延伸5min。

本发明还提供了一种筛选具有芋香味性状的南瓜的试剂盒，包含有用于检测核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的InDel分子标记的试剂。优选地，所述用于检测核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的InDel分子标记的试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物。

实施例1南瓜芋香味性状基因的定位试验及indel标记开发

1.试验材料：

以广东省农业科学院蔬菜研究所选育保存的香芋南瓜(母本)和非芋香味的编号为BX(父本)的资源为亲本，二亲本杂交获得F1，F1自交获得F2分离群体。

2.南瓜芋香味基因初步定位：

利用2亲本和200株F2单株，通过GBS-Seq测序开发SNP标记构建了高密度遗传连锁图谱，最终得到的图谱总图距为1955.34cM，包含20个连锁群。并对169株F2群体进行了芋香味性状表型鉴定。结合高密度遗传图谱和F2单株表型鉴定结果，将芋香味基因定位到第10号连锁群上，两个标记的遗传距离为1.73cM，将该区间两头的标记比对到中国南瓜基因组，定位到中国南瓜基因组第10条染色体上。

3.InDel标记开发

利用2亲本进行全基因组重测序，寻找芋香味基因定位区间内的InDel位点。在定位区间内，与非芋香味亲本比较发现，芋香味的亲本具有1个InDel分子标记位点，***的核苷酸序列为CGCTTTTTCCATCGATTTTGCTGGA(SEQ ID NO.1)，并根据该位点上下游200bp的序列，设计InDel标记引物。

InDel标记引物序列为：

F1：TTCTTTACAATTGCCCGATG(SEQ ID NO.2)；

R1：AAGAAGATGTTCCGTAACGA(SEQ ID NO.3)。

PCR扩增体系使用20μl体系，包括，包含1U Taq酶，1μL模板DNA，1.5μL的dNTP，1μL引物，2μL的10×PCR buffer，加ddH₂O至20μL。PCR扩增程序为：94℃ 3min，循环过程为94℃30s、52℃ 30s、72℃ 30s、30个循环，最后72℃延伸5min。按照上述体系和程序，InDel标记引物在两亲本和F1中进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，亲本间呈现特异条带，母本条带大小229bp，父本扩增条带大小205bp，F1呈现双亲条带229bp和205bp，结果如图1所示，其中，由左至右的第一泳道为marker，第二泳道为母本的PCR结果，第三泳道为父本的PCR结果，第四泳道为F1的PCR结果。

实施例2

采用实施例1中InDel标记引物，通过F2群体随机单株进行验证。利用实施例1中InDel标记引物，以进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在亲本间表现特异，在F2单株检测结果见图2。由左至右第一泳道marker，第二泳道为母本PCR结果，第三泳道为父本PCR结果，第四至十四泳道为F2单株PCR结果

可见，母本条带长度229bp，父本扩增条带长度205bp，F2群体的随机单株中存在P1，P2和F1的三种类型。结合F2单株的表型分析发现，单株与母本呈现相同大小条带的都能呈现芋香味，而单株条带与父本、F1条带一致的都不能呈现芋香味。因此，上述InDel标记可以将芋香味与非芋香味性状的单株分开。

实施例3

采用实施例1中InDel标记引物，利用20种不同类型的中国南瓜资源进行验证。利用该引物进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在亲本间表现特异，在不同类型中国南瓜资源中的检测结果见图3。其中，从左至右第一泳道marker，第二泳道为父本PCR结果，第三泳道为母本PCR结果，第四泳道为F1PCR结果。第五至二十四泳道为不同的中国南瓜资源材料PCR结果。母本条带长度229bp，父本扩增条带长度205bp，F1两种带型，存在205bp和229bp的片段。不同类型的中国南瓜资源中存在母本、父本和F1的三中带型。结合各材料的表型发现香味表型与PCR结果一致。可见，上述InDel标记可以将芋香味与非芋香味性状的单株分开。

实施例4

采用实施例1中InDel标记引物，应用到芋香味性状改良育种材料筛选中。利用该引物进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果如图4所示，其中，从左至右第一泳道marker，第二泳道为母本PCR结果，第三泳道为父本PCR结果，第四至五十四泳道为育种改良材料PCR结果。在51份南瓜改良材料中，只检测到母本和F1类型的条带，结合各个改良材料的表型，说明改良的材料分为纯合的具有芋香味性状单株、以及杂合的不具备芋香味单株。可见，上述InDel标记可以高效、准确地筛选到具备芋香味性状单株，提高芋香味性状改良的效率。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctttttcc atcgattttg ctgga 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctttacaa ttgcccgatg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaagatgt tccgtaacga 20

Claims

1.一种与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel分子标记定位于中国南瓜基因组的第10条染色体上，***的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的InDel分子标记在筛选具有芋香味性状的南瓜中的应用。

3.一种筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，其特征在于，包括：检测权利要求1所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的与南瓜芋香味性状紧密连锁的InDel分子标记。

4.根据权利要求3所述的筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，其特征在于，所述检测为PCR法。

5.根据权利要求4所述的筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，其特征在于，所述PCR法中使用的扩增权利要求1所述的InDel分子标记的引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

6.根据权利要求5所述的筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取南瓜的DNA；

(2)以步骤(1)提取得到南瓜的DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的引物进行PCR扩增；

(3)凝胶电泳检测：如果扩增产物中仅含有229bp条带，则待测南瓜为具有芋香味性状的南瓜。

7.根据权利要求4～6任一项所述的筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，其特征在于，所述PCR法的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，dNTP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的引物，PCR buffer。

8.根据权利要求7所述的筛选具有芋香味性状的南瓜的方法，其特征在于，所述PCR法的扩增体系包含：1U Taq酶，1μL模板DNA，1.5μL的dNTP，1μL引物，2μL的10×PCR buffer，加ddH₂O至20μL。

9.一种筛选具有芋香味性状的南瓜的试剂盒，其特征在于，包含有用于检测核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的InDel分子标记的试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的InDel分子标记的试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物。