CN117051151A - 一种辣椒5k液相芯片及其应用 - Google Patents

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Hunan Agricultural University
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Hunan Xiangyan Seed Industry Co ltd
Hunan Agricultural University
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Abstract

本发明公开了一种辣椒5K液相芯片及其应用，该芯片的基因分型对象包括5984个SNP位点，所述SNP位点是将不同基因型辣椒种质的重测序数据比对至辣椒参考基因组“Zunla‑1_V2”后，进行过滤、评估获得，采用本发明制备的辣椒5K液相芯片对辣椒样品进行快速的基因分型，能够应用于辣椒种质资源的遗传多样性分析、品种的快速鉴定、基因定位和分子辅助、设计育种，有助于缩短辣椒育种周期，推动辣椒新品种选育进程。

Description

一种辣椒5K液相芯片及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种辣椒5K液相芯片及其应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)原产中南美洲，属于茄科辣椒属一年生或多年生植物，现已经成为世界重要的蔬菜作物和调料作物，是中国种植面积最大的蔬菜，品种多样性极为丰富，不同颜色、不同大小、不同形状的品种应有尽有。由于辣椒经济效益好，辣椒产业已发展为多地的特色产业，助力乡村振兴。近年来，随着测序技术的发展，辣椒完成了de-nove测序并且公布了一些重测序数据，为我们提供了丰富的遗传变异信息，然而这些遗传变异信息很难直接应用到辣椒的实际育种工作中。尽管目前在辣椒中开发了SSR标记，CAPS标记，然而由于辣椒基因组大、基础研究工作薄弱，标记量少等原因，导致育种中选择效率较低，目标不明确，限制了其在辣椒育种中的应用。因此，目前急需一种新的基因分型技术提高辣椒育种中的选择效率，推动辣椒分子育种的发展。
单核苷酸多态性(SNP)在基因组中分布广、数量多、便于筛查及基因分型，具有十分重要的生物学意义，被认为是当前最佳的标记。目前，SNP标记已经成为生物种群鉴定、遗传结构分析、基因定位、基因组选择的重要工具。随着高通量测序技术的发展，对于有参考基因组的物种来说，基于全基因组测序成为高通量SNP基因分型技术的主流。然而该技术对于相关数据的管理、分析具有较高的要求，同时辣椒基因组大，导致测序成本很高。靶向捕获测序基因型分型，通过对已知序列设计探针、开发芯片，利用随机打断的基因组DNA片段与芯片混合，捕获辣椒高通量测序文库中的包含目标位点的DNA片段进行扩增、纯化、高通量测序。以一种降低文库丰度的方式实现对大量目标位点的深度测序，能够降低相关数据的分析及管理难度，并且能够显著降低基因分型的成本。然而该技术在辣椒中尚未展开应用。
液相捕获芯片是基于DNA的捕获，再进行测序，它对同一个位置进行了多次测序，准确率更高，成本低，且开发的SNP芯片密度可以灵活调整；可以随时补充新的位点、升级灵活；未来可针对不同的使用场景及使用需求，采用不同组合的芯片，即可检测。然而该项技术尚未在辣椒中应用，该辣椒芯片的开发有助于辣椒育种产业的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辣椒5K液相芯片及其应用，采用本发明的液相芯片可以实现对辣椒种质资源的快速分型，解决了现用的大量遗传信息不能应用到实际育种的问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种辣椒5K液相芯片，该芯片的基因分型对象包括辣椒全基因组上的5984个SNP位点，所述SNP位点的位置信息如说明书表1所示。
上述的辣椒5K液相芯片，优选的，所述SNP位点的参考基因组为辣椒基因组“Zunla-1_V2”。
优选的，所述辣椒5K液相芯片为基于靶向捕获测序的辣椒5K液相基因芯片。
优选的，所述辣椒5K液相芯片由探针混合液和杂交捕获试剂构成，所述探针混合液包括辣椒SNP靶向捕获5K探针、通用封闭液I、通用封闭液II；所述杂交捕获试剂包括TCGBS 2×杂交Buffer、TCGBS重复序列封闭液Block、TCGBS2×Beads Wash Buffer、TCGBSWash Buffer I/Wash Buffer II/Wash Buffer III、TCGBS Stringent Wash Buffer。
更优选的，所述探针混合液中的辣椒SNP靶向捕获5K探针为DNA双链探针。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种所述的辣椒5K液相芯片在辣椒种质资源的遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位或分子辅助育种方面的应用。
上述的应用，优选的，所述应用的方法包括如下步骤：利用所述辣椒5K液相芯片对辣椒样品进行基因分型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了辣椒5K液相基因芯片，包含了5984个SNP位点，能够同时对5984个位点进行检测，其数量、密度及效率均是目前报道辣椒中较高的，能够应用于辣椒的基础研究和分子育种中。
(2)本发明的辣椒5K液相基因芯片，还可以补充其他位点进来，在育种中可以灵活使用。
(3)本发明的辣椒5K液相基因芯片，为辣椒的遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位、背景筛选及分子标记辅助育种提供了一项高效的基因组分型工具；同时根据现有研究，本发明可随时根据新的位点设计新的探针，同时对于样品量没有较高要求，以满足使用人不同的使用场景及使用需求，在辣椒分子育种中具有较高的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的辣椒5K液相基因芯片5984个位点分布统计情况；
图2为本发明的实施例2中DNA电泳质检图(其中，采用的是5000bp的Marker，Marker片段从上到下分别为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；
图3为实施例3中利用辣椒5K液相基因芯片对308份辣椒种质进行群体结构的分析；
图4为实施例4中的SNP分布图；(其中，纵轴表示染色体，竖线表示突变SNP位置)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的辣椒5K液相芯片，该芯片的基因分型对象包括5984个SNP位点(见表1)，所述SNP位点是将不同基因型辣椒种质的重测序数据比对至辣椒参考基因组“Zunla-1_V2”后，进行过滤、评估获得，该辣椒5K液相芯片的开发过程如下：
在设计、筛选相关探针时，尽量使SNP位点能够均匀分布于全基因组中(图1)。同时尽量选择了在308份材料中多态性较为丰富的SNP位点(MAF>0.2，超过3000个SNP位点>0.3)，尽可能保证位点多态性及探针的特异性。
以308份重测序数据为主要的分析对象。利用BWA-mem将原始读长比对至辣椒参考基因组“Zunla-1_V2”之上，利用GATK_V 4.0进行SNP calling并进一步对SNP位点进行评估、过滤。进一步通过以下质控条件进行位点的选择：1)在群体数据中基因型频率介于5％-95％，即MAF≥0.05；2)多态性位点所在120bp序列在基因组上唯一比对；3)120bp序列内包含多态性位点不超过2个；4)120bp序列GC含量在40％-60％之间；5)基因组上滑动窗口每50Kb随机选择一个高质量多态性位点，并以均匀分布的原则，从中选择了5984个SNP(见表1)作为辣椒5K液相基因芯片的检测位点。以期缩短辣椒育种的周期，提高辣椒育种的效率。具体地，5984个SNP位点的位置如表1所示。
该芯片为基于靶向捕获测序的辣椒5K液相基因芯片，所述辣椒5K液相芯片由探针混合液和杂交捕获试剂构成，探针混合液包括辣椒SNP靶向捕获5K探针、通用封闭液I、通用封闭液II；杂交捕获试剂包括TCGBS2×杂交Buffer、TCGBS重复序列封闭液Block、TCGBS2×Beads Wash Buffer、TCGBS Wash Buffer I/Wash Buffer II/Wash Buffer III、TCGBSStringent Wash Buffer。所述辣椒5K探针为DNA双链探针，是根据所筛选的5984个SNP位点设计并合成的核苷酸序列。
表1：辣椒5K液相芯片的5984个SNP位点信息
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实施例2：
本发明的辣椒5K液相芯片在辣椒DNA样品检测中的应用，具体方法如下：
1、辣椒基因组DNA样品的提取：辣椒叶片含有大量的酚类和多糖物质，可介导DNA降解，与DNA结合形成褐色，影响DNA的质量。参考(王岩,张宝玺,张国裕,等.辣椒叶片DNA提取方法的优化[J].长江蔬菜,2006(8):59-61.)，取苗期辣椒真叶，使用优化的CTAB法进行核酸的提取。然后利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，同时利用Agilent 2100仪器进行浓度的测定。检测合格的样品放入-20℃冰箱保存备用。
2、液相芯片的数据测定：将合格的样品进行超声随机打断，凝胶电泳回收300-500bp长度的DNA片段(如图2所示)，在其末端加上接头，形成文库，利用LM-PCR进行扩增形成测序文库，将文库进行液氮冻干后加入辣椒SNP靶向捕获5K探针1.5μL及相关杂交试剂(通用封闭液I 2μL、通用封闭液II 2μL；TCGBS2×杂交Buffer 2μL、TCGBS重复序列封闭液Block 2μL、TCGBS2×Beads Wash Buffer 8.5μL、TCGBS Wash Buffer I/Wash Buffer II/Wash Buffer III 2.7μL、TCGBS Stringent Wash Buffer 1.8μL)，65℃温育12-16h进行杂交变性，用洗液反复2-3次冲洗去掉未杂交的DNA，进行5个循环的PCR反应(PCR mix 25μL,杂交DNA10μL,Primermix 2.5μL 95℃5s,65℃20s,72℃10s)，做成杂交捕获测序的文库，进行测序，每个样本产出1-2Gb的数据。
3、样本变异信息的获取：
将测序下机的数据使用BWA软件与参考基因组(ZunlaV2)进行比对，并使GTAK4进行数据的标准call SNP和indel；从而获取待测的样本的变异信息数据。
实施例3：
本发明的辣椒5K液相芯片在遗传多样性分析/品种鉴定方面的应用，具体是利用本发明的辣椒5K液相芯片对核心种质材料进行分群。
种质资源的遗传多样性是育种工作的基础，而对种质资源遗传多样性的研究可以挖掘出优异资源，从而为育种者提供重要信息。前人都是以表型性状评价辣椒的遗传多样性，而没有在全基因组水平上进行评价，此外辣椒基因组大小约为3Gb，精准评价需要达到10X左右的测序深度，测序成本很高，数据计算资源耗费很大，而本发明的辣椒5K液相芯片可以低成本快速的对辣椒核心种质资源的遗传多样性分布以及亲缘关系进行鉴定，为辣椒种质资源的分子评价、基因深度挖掘及遗传改良提供理论参考。
利用辣椒5K液相基因芯片对308份辣椒种质进行群体结构的分析，如图3所示。由此分析可知，一年生辣椒282份、灌木状辣椒10份、中国辣椒8份、柔毛辣椒2份和下垂辣椒6份。对这些材料进行进化树作图分析一年生辣椒种非常清晰地与其它辣椒种材料进行了区分，灌木状辣椒等处在进化树的另一分枝上，说明一年生辣椒与其它几个种亲缘关系相对较远，灌木状辣椒和中国辣椒在进化树上的位置相邻，说明其亲缘关系较近。与柔毛辣椒、下垂辣椒以及其它种辣椒材料相比，一年生辣椒和灌木状辣椒以及中国辣椒在遗传进化上更为相似。以上结果证实辣椒液相芯片在核心材料具有较高多态性，可以对种质资源评价、遗传改良以及相关研究。
实施例4：
本发明的辣椒5K液相芯片在基因定位中的应用，具体方法如下：
发表在Horticulture Research杂志上的The bHLH1-DTX35/DFR moduleregulates pollen fertility by promoting flavonoid biosynthesis in Capsicumannuum L.，文章中，将基因定位在Chr01染色体的起始端，本发明通过定位分析发现用本发明的辣椒5K液相芯片处理也可以得到与之一致的候选区间。具体操作参考实施例2，并通过BWA软件将reads比对到辣椒参考基因组上，使用GTAK4软件寻找全基因组的SNP位点。分析发现reads覆盖全基因组的93％以上，说明本发明的辣椒5K液相芯片的捕获较好。然后选取碱基质量值大于等于20，mapping质量值大于等于20，在双亲和隐性池中纯合的位点，进行SNP分布图的画图。如图4，在1号染色体的起始端SNP明显富集，说明候选区间在1号的0-20M区间与文献中保持一致，说明本发明的辣椒5K液相芯片可用于候选基因的定位，准确率较高。

Claims (7)

1.一种辣椒5K液相芯片，其特征在于，该芯片的基因分型对象包括辣椒全基因组上的5984个SNP位点，所述SNP位点的位置信息如说明书表1所示。
2.根据权利要求1所述的辣椒5K液相芯片，其特征在于，所述SNP位点的参考基因组为辣椒基因组“Zunla-1_V2”。
3.根据权利要求1所述的辣椒5K液相芯片，其特征在于，所述辣椒5K液相芯片为基于靶向捕获测序的辣椒5K液相基因芯片。
4.根据权利要求3所述的辣椒5K液相芯片，其特征在于，所述辣椒5K液相芯片由探针混合液和杂交捕获试剂构成，所述探针混合液包括辣椒SNP靶向捕获5K探针、通用封闭液I、通用封闭液II；所述杂交捕获试剂包括TCGBS2×杂交Buffer、TCGBS重复序列封闭液Block、TCGBS2×Beads Wash Buffer、TCGBS Wash Buffer I/Wash Buffer II/Wash Buffer III、TCGBS Stringent Wash Buffer。
5.根据权利要求4所述的辣椒5K液相芯片，其特征在于，所述探针混合液中的辣椒SNP靶向捕获5K探针为DNA双链探针。
6.一种如权利要求1-5中任一项中所述的辣椒5K液相芯片在辣椒种质资源的遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位或分子辅助育种方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括如下步骤：利用所述辣椒5K液相芯片对辣椒样品进行基因分型。
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