CN117603962A - 一种样本中dna与rna共提取通用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA与RNA共提取技术领域，本发明公开了一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，包括下列步骤：1)柱膜准备，2）裂解，将缓冲液1A与缓冲液1B加入所述裂解介质管；3）去杂，4）DNA/RNA分离，5）RNA纯化，6）DNA纯化，7）漂洗8）洗脱，将柱子转移到DNA与RNA回收管；收集的滤液为RNA/DNA，用于下游应用；本发明简化了操作步骤，缩短了操作时间，降低了操作失误，提高了提取效果；有效提高产量与纯度，将潜在污染风险降低，提高了结果的准确性与可靠性；适用于高通量处理，满足了大规模样本处理的要求；适用于大部分样本。
Description
技术领域
本发明涉及DNA与RNA共提取技术领域，尤其涉及一种样本中DNA与RNA共提取通用方法。
背景技术
随着科技的进步与发展，人们在生物医学、基因组学、药物开发、农业科学等领域中的样本需要进行DNA/RNA提取，所以往往需要进行DNA与RNA的共提取；DNA和RNA共提取技术具有重要的实用价值，可以为基础科学研究、医学诊断和药物开发等领域提供更全面的信息和便利。
DNA与RNA共提取技术的发展一直在不断进行，以满足研究人员对于同时获得DNA和RNA的需求。现有社会下，DNA与RNA共提取技术在简化操作、提高效率和保证质量等方面有了显著的进展。这些技术的不断发展为分子生物学研究、临床诊断和个体化医学等领域提供了更多的可能性，并促进了对基因组和转录组的全面理解。
虽然DNA和RNA共提取技术在分子生物学研究中得到了广泛应用，但也存在一些缺点和限制。以下是一些常见的DNA与RNA共提取技术的缺点：
1.复杂操作：传统的DNA和RNA共提取方法通常需要多个步骤和复杂的实验操作，包括细胞破碎、核酸分离、洗涤和纯化等。这些步骤需要耗费大量时间和精力，并且容易出现操作失误，影响提取效果。
2.低产量和低纯度：传统方法在提取过程中可能会导致DNA/RNA的损失和降解，从而导致提取的产量较低和纯度较差。特别是对于某些难以裂解的样本（如硬质组织），传统方法的效果更为有限。
3.潜在污染风险：传统方法中使用的有机溶剂和试剂可能会引入潜在的污染物，例如酚/氯仿等有机溶剂可能含有有害物质。这些污染物可能对后续的实验和分析产生干扰，特别是对于低丰度的目标核酸，影响结果的准确性和可靠性。
4.不适用于高通量处理：传统方法通常是手工操作，适用于小规模的样本处理。大规模样品处理时，可能需要进行分批处理，增加实验的复杂性和时间成本。随着高通量技术的发展和需求的增加，传统方法无法满足大规模样本处理的要求，效率较低且容易出现操作误差。
5.样品限制：某些DNA和RNA共提取方法对样品处理量有限制，对提取样本的类型有限制，多集中在细胞和组织等样品，对于其他样品类型，如土壤、粪便等环境样本，血液、尿液、唾液等体液样本处理能力有限。
通过上述描述，可知，现有情况下急需一种样本中DNA与RNA共提取通用方法来解决问题。
发明内容
为了解决上述问题本发明提供了一种样本中DNA与RNA共提取通用方法。
本发明的方案是：
一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，包括下列步骤：
1)柱膜准备
DNA提取柱与RNA提取柱分别加入平衡缓冲液，等待≥1min，最大速度离心10s，将硅胶柱膜分别转移到相应新的收集管中；
2）裂解
称量样本添加到裂解介质管中；将缓冲液1A与缓冲液1B加入所述裂解介质管；通过设备裂解；通过设备离心；缓冲液1A与缓冲液1B的使用，避免使用酚/氯仿裂解；
3）去杂
取上清液转入2.0 mL 微型离心管；加入缓冲液2号沉淀污染物，涡旋1s，最大速度离心2min；
4）DNA/RNA分离
将上清液转移到2.0 mL 微型离心管中，加入缓冲液3号，旋涡1s，得到溶液A；上清液与缓冲液3号的体积比为1:1；
向DNA提取柱中加入溶液A，离心，滤液用于RNA纯化；
5）RNA纯化
滤液中加入缓冲液4号，涡旋1s，得到溶液B；上清液、缓冲液3号与缓冲液4号的体积比为1:1:1；
将溶液B加入RNA提取柱，离心10s，弃滤液；重复此步骤直至全部过柱；
将RNA提取柱转移到新的RNA 收集管中；准备漂洗；
6）DNA纯化：
DNA提取柱关闭收集管盖子，准备漂洗；
7）漂洗
在柱子中心加入缓冲液5号，离心，弃滤液；
在柱子中心加入缓冲液6号，离心，弃滤液；
在柱子中心加入缓冲液6号，离心30s；
将柱子放入新的收集管，最大速度离心1min；
8）洗脱
将柱子转移相匹配的DNA与RNA回收管；
向柱子中央加入无酶无菌水，最大速度离心1min；收集的滤液分别为RNA与DNA，用于下游应用。
作为优选的技术方案，所述5)获得的RNA收集管中RNA提取柱与6）步骤获得的DNA收集管中DNA提取柱分别执行7）步骤。
作为优选的技术方案，所述2）中将缓冲液1A与缓冲液1B加入所述裂解介质管，还加入β-巯基乙醇。
作为优选的技术方案，所述裂解介质管中的裂解介质为氧化锆珠和石英砂的混合物。
作为优选的技术方案，所述缓冲液1A制备方法为：
1）称取表面活性剂、磷酸二氢钠、EDTA-2Na到配液桶中，向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为3.7～4.3；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0～6.6，获得缓冲液1A。
作为优选的技术方案，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠 、Triton X-100 、Tween20其中的一种。
作为优选的技术方案，所述缓冲液1B制备方法为：
1）称取硫氰酸钠溶液、磷酸二氢钠放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟，直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为3.4～4.0；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.4～8.0，pH调好后，向溶液中加入表面活性剂，搅拌至溶解，获得缓冲液1B。
作为优选的技术方案，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠 、Triton X-100 、Tween20其中的一种。
作为优选的技术方案，所述缓冲液2号制备方法为：
1）称取氯化铝六水合物、乙酸铵到配液桶；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为6.5～7.1，获得缓冲液2号，配制完成在2～8℃保存；所述缓冲液2号用量为300 µL/样品。
作为优选的技术方案，所述缓冲液3号制备方法为：
1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，45℃水浴加热溶解，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为4.3～4.9；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0～6.6，获得缓冲液3号。
作为优选的技术方案，所述缓冲液4号制备方法为：1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌、水浴加热溶解；搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为4.3～4.9；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0～6.6；
3）按照40～60%比例向溶液中加入异丙醇，获得缓冲液4号。
作为优选的技术方案，所述缓冲液5号制备方法：
1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌、水浴加热溶解，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为4.3-4.9；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0～7.6；
3）按照10～30%比例向溶液中加入乙醇，获得缓冲液5号。
作为优选的技术方案，所述缓冲液6号制备方法：
1）称取Tris-HCl与Tris放入到塑料配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为6.2～6.8；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0～7.6；
3）按照70～90%比例向溶液中加入乙醇，获得缓冲液6号。
作为优选的技术方案，适用样本的种类包括土壤、粪便、血液、尿液、唾液中的任意一种。
由于采用了上述技术方案一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，包括下列步骤：1)柱膜准备，DNA提取柱与RNA提取柱分别加入平衡缓冲液，等待≥1min，最大速度离心10s，将硅胶柱膜分别转移到相应新的收集管中；2）裂解，称量样本添加到裂解介质管中；将缓冲液1A与缓冲液1B加入所述裂解介质管；通过设备裂解；通过设备离心；3）去杂，取上清液转入2.0 mL 微型离心管；加入缓冲液2号沉淀污染物，涡旋1s，最大速度离心2min；4）DNA/RNA分离，将上清液转移到2.0 mL 微型离心管中，加入缓冲液3号，旋涡1s，得到溶液A；上清液与缓冲液3号的体积比为1:1；向DNA提取柱中加入溶液A，离心，滤液用于RNA纯化；5）RNA纯化，滤液中加入缓冲液4号，涡旋1s，得到溶液B；上清液、缓冲液3号与缓冲液4号的体积比为1:1:1；将溶液B加入RNA提取柱，离心10s，弃滤液；重复此步骤直至全部过柱；将RNA提取柱转移到新的RNA 收集管中；准备漂洗；6）DNA纯化，DNA提取柱关闭收集管盖子，准备漂洗；7）漂洗，在柱子中心加入缓冲液5号，离心，弃滤液；在柱子中心加入缓冲液6号，离心，弃滤液；在柱子中心加入缓冲液6号，离心30s；将柱子放入新的收集管，最大速度离心1min；8）洗脱，将柱子转移到相匹配的DNA与RNA回收管；向柱子中央加入无酶无菌水，最大速度离心1min；收集的滤液分别为RNA与DNA，用于下游应用。
本发明的优点：
本发明简化了操作步骤，缩短了操作时间，降低了操作失误，提高了提取效果；有效提高产量与纯度，将潜在污染风险降低，提高了结果的准确性与可靠性；适用于高通量处理，满足了大规模样本处理的要求；适用于大部分样本。
附图说明
图1为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量的DNA-Nano浓度数据图；
图2为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量的DNA-260/280数据图；
图3为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量的DNA-260/230数据图；
图4为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量提取250mg SG4土壤DNA的电泳图；
图5为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量提取500mg SG4土壤DNA的电泳图；
图6为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量的RNA-Nano浓度数据图；
图7为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量的RNA-260/280数据图；
图8为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量的RNA-260/230数据图；
图9为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量提取250mg SG4土壤RNA的电泳图；
图10为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量提取500mg SG4土壤RNA的电泳图；
图11为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量和加入缓冲液2号后不同离心时间对DNA和RNA提取的数据表图；
图12为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量和加入缓冲液2号后不同离心时间对DNA影响的电泳图；
图13为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量和加入缓冲液2号后不同离心时间对RNA影响的电泳图；
图14为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量和加入缓冲液2号后不同离心时间对DNA和RNA的Nano浓度数据图；
图15为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量和加入缓冲液2号后不同离心时间对DNA和RNA的A260/A280数据图；
图16为本发明实施例1测试缓冲液2号不同用量和加入缓冲液2号后不同离心时间对DNA和RNA的A260/A230数据图；
图17为本发明实施例1中测试对DNA提取的数据图；
图18为本发明实施例1中测试缓冲液4号中异丙醇不同比例对RNA影响的数据图；
图19为本发明实施例1中测试对DNA提取的电泳图；
图20为本发明实施例1中测试缓冲液4号中异丙醇不同比例对RNA影响的电泳图；
图21为本发明实施例1中测试不同DNA提取柱对DNA与RNA提取影响的数据图；
图22为本发明实施例1中测试不同DNA提取柱对DNA提取影响的电泳图；
图23为本发明实施例1中测试不同DNA提取柱对RNA提取影响的电泳图；
图24为本发明实施例1中测试不同DNA提取柱对DNA与RNA提取的Nano浓度数据图，其中横向坐标轴上组别中数字分别对应图22中设置的相应数字组；
图25为本发明实施例1中测试不同DNA提取柱对DNA与RNA提取的A260/A280数据图，其中横向坐标轴上组别中数字分别对应图22中设置的相应数字组；
图26为本发明实施例1中测试不同DNA提取柱对DNA与RNA提取的A260/A230数据图，其中横向坐标轴上组别中数字分别对应图22中设置的相应数字组；
图27为本发明实施例1中测试不同RNA提取柱对DNA和RNA提取的影响数据图；
图28为本发明实施例1中测试不同RNA提取柱对RNA提取影响的电泳图；
图29为本发明实施例1中测试对DNA提取的电泳图；
图30为本发明实施例1中测试不同RNA提取柱对DNA和RNA提取的Nano浓度数据图，其中横向坐标轴上组别中数字分别对应图28中设置的相应数字组；
图31为本发明实施例1中测试不同RNA提取柱对DNA和RNA提取的A260/A280数据图，其中横向坐标轴上组别中数字分别对应图22中设置的相应数字组；
图32为本发明实施例1中测试不同RNA提取柱对DNA和RNA提取的A260/A230数据图，其中横向坐标轴上组别中数字分别对应图22中设置的相应数字组；
图33为本发明测试实施例1与对比例对相同样本DNA和RNA提取的Nano浓度数据差别图；
图34为本发明测试实施例1与对比例对相同样本DNA和RNA提取的A260/A280数据差别图；
图35为本发明测试实施例1与对比例对相同样本DNA和RNA提取的A260/A230数据差别图；
图36为本发明测试实施例1与对比例对相同样本DNA提取的电泳差别图；
图37为本发明测试实施例1与对比例对相同样本RNA提取的电泳差别图；
图38为本发明测试实施例1与对比例对DNA提取的Nano浓度数据差别图；
图39为本发明测试实施例1与对比例对RNA提取的Nano浓度数据差别图；
图40为本发明测试实施例1与对比例对DNA与RNA提取的电泳差别图；
图41为本发明测试实施例1与对比例对DNA提取的A260/A280数据差别图；
图42为本发明测试实施例1与对比例对DNA提取的A260/A230数据差别图；
图43为本发明测试实施例1与对比例对RNA提取的A260/A280数据差别图；
图44为本发明测试实施例1与对比例对RNA提取的A260/A230数据差别图；
图45为本发明测试实施例2与对比例对DNA与RNA提取的Nano浓度数据差别图；
图46为本发明测试实施例2与对比例对DNA与RNA提取的A260/A280数据差别图；
图47为本发明测试实施例2与对比例对DNA与RNA提取的A260/A230数据差别图；
图48为本发明测试实施例2与对比例对DNA与RNA提取的电泳差别图。
具体实施方式
本发明提供了一种样本中DNA与RNA共提取通用方法。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
1)柱膜准备
DNA提取柱与RNA提取柱分别加入平衡缓冲液，等待≥1min，最大速度离心10s，将硅胶柱膜分别转移到相应新的收集管中；
2）裂解
称量样本添加到裂解介质管中；将150μL缓冲液1A与600μL缓冲液1B加入所述裂解介质管（如果担心核酸完整性可添加8 μL β-巯基乙醇）；2500～2700rpm 涡旋15 min或设备以5m/sec裂解35sec；最大速度离心2min；
3）去杂
取上清液转入2.0 mL 微型离心管；加入300μL缓冲液2号沉淀污染物，涡旋1s，最大速度离心2min；
4）DNA/RNA分离
将上清液转移到2.0 mL 微型离心管中，加入1体积的缓冲液3号，旋涡1s，得到溶液A；上清液与缓冲液3号的体积比为1:1；
向DNA提取柱中加入700μL溶液A，15000rpm离心10s，收集滤液，盖上装有滤液的收集管盖子；
将DNA提取柱放入新的DNA收集管中，将剩余的溶液A加入DNA提取柱，15000rpm离心10s，收集滤液，盖上装有滤液的收集管盖子;将DNA 提取柱放入新的DNA收集管中，并将两次的滤液混合用于RNA纯化；
5）RNA纯化
滤液中加入步骤4）上清液1体积的缓冲液4号，涡旋1s，得到溶液B；上清液、缓冲液3号与缓冲液4号的体积比为1:1:1；
将800μL溶液B加入RNA提取柱，15000rpm离心10s，弃滤液；重复此步骤直至全部过柱；
将RNA提取柱转移到新的RNA 收集管中，准备漂洗；
6）DNA纯化：
DNA提取柱关闭收集管盖子，准备漂洗；
7）漂洗
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入700μL缓冲液5号，15000rpm离心10s，弃滤液；
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入700μL缓冲液6号，15000rpm离心10s，弃滤液；
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入500μL缓冲液6号，15000rpm离心30s；
将DNA提取柱和RNA提取柱分别放入新的收集管，最大速度离心1min；
8）洗脱
将DNA提取柱和RNA提取柱分别转移到DNA收集管和RNA收集管；
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入100μL无酶无菌水，最大速度离心1min；收集的滤液分别为DNA与RNA，用于下游应用。
所述裂解介质管中的裂解介质为氧化锆珠和石英砂的混合物。
裂解介质配制表
所述样本为250～500mg的土壤（SG4）。
1.焦碳酸二乙酯处理水配制
表1：
（1）称量纯化水加入到玻璃配液瓶中，用移液枪准确抽取DEPC液体，加入到称好的纯化水中，盖好瓶盖，将玻璃配液瓶水平放在桌面上，快速摇动直至有大量白色气泡产生，再继续摇2min，竖起玻璃配液瓶后气泡快速消失，目视DEPC已完全融入水中，瓶身上无明显DEPC挂壁痕迹，再静置12小时以上。
（2）溶液静置后，需高温灭菌处理。配液瓶盖拧松后，将配液瓶放入高温灭菌锅中，121℃灭菌30分钟。配制完成后盖好盖子存放备用，并在两周内使用，过期作废。
2.缓冲液 1A配制
表2：
（1）称取表面活性剂、磷酸二氢钠、EDTA-2Na到配液桶中，向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25 ℃）应在3.7-4.3。使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0-6.6。
3.缓冲液1B配制
表3：
（1）称取硫氰酸钠溶液、磷酸二氢钠放入到配液桶中。向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25 ℃）应在3.4～4.0。使用NaOH溶液调节溶液pH至7.4～8.0。pH调好后，向溶液中加入表面活性剂，搅拌至溶解。所述表面活性剂为Triton X-100 。
4.缓冲液2号配制
表4：
（1）称取氯化铝六水合物、乙酸铵到配液桶。向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25℃）应为6.5-7.1，此溶液不用调节pH值。注意：配好后需2-8℃保存。
缓冲液2号操作过程中用量为300 µL/样品，分别测试过150/200/250/300 µL四种不同用量，随着使用量的增加，提取DNA和RNA的收率会有不同程度降低，但是纯度会提升，经验证将这一步骤的离心时间由1分钟增加到2分钟，在用量是300 µL/样品的情况下增加收率并保持高纯度（详见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15与图16）
5.缓冲液3号配制
表5：
（1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中。向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25℃）应在4.3～4.9。使用NaOH溶液调节溶液pH至6.0～6.6。
6.缓冲液4号配制
表6：
（1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中。向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25℃）应在4.3～4.9。使用NaOH溶液调节溶液pH至6.0～6.6。
（3）按照40～60%比例向溶液中加入异丙醇。效果详见图17、图18、图19与图20。
7.缓冲液5号配制
表7：
（1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中。向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25℃）应在4.3～4.9。使用NaOH溶液调节溶液pH至7.0～7.6。
（3）按照10～30%比例向溶液中加入乙醇。
8.缓冲液6号配制
表8：
（1）用电子秤称取Tris-HCl和Tris放入到塑料配液桶中。向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，开启电动搅拌器，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
（2）用pH计测试溶液的pH值，pH值（25℃）应为6.2～6.8。使用NaOH溶液调节溶液pH至7.0～7.6。
（3）按照70～90%比例向溶液中加入乙醇。
9.无酶无菌水
配液表1：
10.平衡缓冲液配制
表9：
（1）称取氢氧化钠放入到配液桶中，加入焦碳酸二乙酯处理水，至少搅拌10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明。
所述DNA提取柱为DNA Column 、RNA提取柱为 RNA Column。硅胶柱膜高效分离DNA与RNA。
对比实验1
实施例1制备测量收率与纯度为实施例组；
对比例1，按照实施例1步骤，唯一区别为DNA提取柱为生工，测量收率与纯度；
对比例2，按照实施例1步骤，唯一区别为DNA提取柱为Jie Tee，测量收率与纯度；
对比例3，按照实施例1步骤，唯一区别为DNA提取柱为Magen，测量收率与纯度；
进行对比，结果发现生工和Jie Tee与目前所用DNA Column相当，Magen收率偏低，从DNA纯度来看，但考虑到成本及稳定性来说，最终确定为目前所用的DNA Column。（见图21、图22、图23、图24、图25与图26）。
比较了RNA提取柱，最终选择了目前所用的RNA Column。所选 RNA Column与新景在收率和纯度结果上均相当，所选 RNA Column稳定性更好（见图27、图28、图29、图30、图31与图32）。
对比实验4
使用本申请配制的各缓冲液，DNA和RNA提取柱分别采用本实施例1（图示实施例组）和对比例4（图示Zymo），从结果看出，对比例DNA提取柱膜对DNA的提取不完全，导致提取出来的RNA中有明显的DNA残留，不满足DNA和RNA分离的目的（见图33、图34、图35、图36与图37）。
对比实验5
提取土壤样本250mg，采用实施例1提取，对比例5使用Zymo产品进行提取，两者提取后分别进行收率与纯度检测，结果详见图38、图39、图40、图41、图42、图43与图44。
实施例2
样本为提取血液样本200µL。
1)柱膜准备
DNA提取柱与RNA提取柱分别加入平衡缓冲液，等待≥1min，最大速度离心10s，将硅胶柱膜分别转移到相应新的收集管中；
2）裂解
称量样本添加到裂解介质管中；将150μL缓冲液1A与600μL缓冲液1B加入所述裂解介质管；（如果担心核酸完整性可添加8 μL β-巯基乙醇）；2500～2700rpm 涡旋15 min或设备以5m/sec裂解35sec；最大速度离心2min；
3）去杂
取上清液转入2.0 mL 微型离心管；加入300μL缓冲液2号沉淀污染物，涡旋1s，最大速度离心2min；
4）DNA/RNA分离
将上清液转移到2.0 mL 微型离心管中，加入1体积的缓冲液3号，旋涡1s，得到溶液A；上清液与缓冲液3号的体积比为1:1；
向DNA提取柱中加入700μL溶液A，15000rpm离心10s，收集滤液，盖上装有滤液的收集管盖子；
将DNA提取柱放入新的DNA收集管中，将剩余的溶液A加入DNA提取柱，15000rpm离心10s，收集滤液，盖上装有滤液的收集管盖子;将DNA 提取柱放入新的DNA收集管中，并将两次的滤液混合用于RNA纯化；
5）RNA纯化
滤液中加入步骤4）上清液1体积的缓冲液4号，涡旋1s，得到溶液B；上清液、缓冲液3号与缓冲液4号的体积比为1:1:1；
将800μL溶液B加入RNA提取柱，15000rpm离心10s，弃滤液；重复此步骤直至全部过柱；
将RNA提取柱转移到新的RNA 收集管中，准备漂洗；
6）DNA纯化：
DNA提取柱关闭收集管盖子，准备漂洗；
7）漂洗
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入700μL缓冲液5号，15000rpm离心10s，弃滤液；
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入700μL缓冲液6号，15000rpm离心10s，弃滤液；
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入500μL缓冲液6号，15000rpm离心30s；
将DNA提取柱和RNA提取柱分别放入新的收集管，最大速度离心1min；
8）洗脱
将DNA提取柱和RNA提取柱分别转移到DNA收集管和RNA收集管；
向DNA提取柱和RNA提取柱中心分别加入100μL无酶无菌水，最大速度离心1min；收集的滤液分别为DNA与RNA，用于下游应用。
所述裂解介质管中的裂解介质为氧化锆珠和石英砂的混合物。
裂解介质配制、焦碳酸二乙酯处理水配制、缓冲液 1A配制、缓冲液1B配制、缓冲液2号配制、缓冲液3号配制、缓冲液4号配制、缓冲液5号配制、缓冲液6号配制、无酶无菌水与平衡缓冲液配制与实施例1中各配置相同。
所述DNA提取柱为DNA Column 、RNA提取柱为 RNA Column。硅胶柱膜高效分离DNA与RNA。
对比实验6
提取血液样本200µL，采用实施例2提取，对比例6使用Zymo产品进行提取，两者提取后分别进行收率与纯度检测，结果详见图45、图46、图47与图48。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)柱膜准备
DNA提取柱与RNA提取柱分别加入平衡缓冲液，等待≥1min，最大速度离心10s，将硅胶柱膜分别转移到相应新的收集管中；
2）裂解
称量样本添加到裂解介质管中；将缓冲液1A与缓冲液1B加入所述裂解介质管；通过设备裂解；通过设备离心；
3）去杂
取上清液转入2.0 mL 微型离心管；加入缓冲液2号沉淀污染物，涡旋1s，最大速度离心2min；
4）DNA/RNA分离
将上清液转移到2.0 mL 微型离心管中，加入缓冲液3号，旋涡1s，得到溶液A；上清液与缓冲液3号的体积比为1:1；
向DNA提取柱中加入溶液A，离心，滤液用于RNA纯化；
5）RNA纯化
滤液中加入缓冲液4号，涡旋1s，得到溶液B；上清液、缓冲液3号与缓冲液4号的体积比为1:1:1；
将溶液B加入RNA提取柱，离心10s，弃滤液；重复此步骤直至全部过柱；
将RNA提取柱转移到新的RNA 收集管中，准备漂洗；
6）DNA纯化
DNA提取柱关闭收集管盖子，准备漂洗；
7）漂洗
在柱子中心加入缓冲液5号，离心，弃滤液；
在柱子中心加入缓冲液6号，离心，弃滤液；
在柱子中心加入缓冲液6号，离心30s；
将柱子放入新的收集管，最大速度离心1min；
8）洗脱
将柱子转移到相应的DNA与RNA回收管；
向柱子中央加入无酶无菌水，最大速度离心1min；收集的滤液分别为RNA与DNA，用于下游应用。
2.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液1A制备方法为：
1）称取表面活性剂、磷酸二氢钠、EDTA-2Na到配液桶中，向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为3.7～4.3；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0～6.6，获得缓冲液1A。
3.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液1B制备方法为：
1）称取硫氰酸钠溶液、磷酸二氢钠放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟，直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为3.4～4.0；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.4～8.0，pH调好后，向溶液中加入表面活性剂，搅拌至溶解，获得缓冲液1B。
4.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液2号制备方法为：
1）称取氯化铝六水合物、乙酸铵到配液桶；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为6.5～7.1，获得缓冲液2号，配制完成在2～8℃保存；所述缓冲液2号用量为300 µL/样品。
5.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液3号制备方法为：
1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，45℃水浴加热溶解，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为4.3～4.9；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0～6.6，获得缓冲液3号。
6.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液4号制备方法为：
1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌、水浴加热溶解；搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为4.3～4.9；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至6.0～6.6；
3）按照40～60%比例向溶液中加入异丙醇，获得缓冲液4号。
7.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液5号制备方法：
1）称取硫氰酸胍、Tris-HCl放入到配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌、水浴加热溶解，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为4.3-4.9；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0～7.6；
3）按照10～30%比例向溶液中加入乙醇，获得缓冲液5号。
8.如权利要求1所述的一种样本中DNA与RNA共提取通用方法，其特征在于，所述缓冲液6号制备方法：
1）称取Tris-HCl与Tris放入到塑料配液桶中；向配液桶中加入焦碳酸二乙酯处理水，搅拌≥10分钟直至固体溶解，溶液澄清透明；
2）用pH计测试溶液的pH值，pH值为6.2～6.8；使用氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0～7.6；
3）按照70～90%比例向溶液中加入乙醇，获得缓冲液6号。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2024
- 2024-01-23 CN CN202410089808.5A patent/CN117603962A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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