CN113930418B - 核酸释放剂及其核酸释放方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸释放剂及其核酸释放方法，该方案包括0.5‑1.5M Tris‑HCl、30‑70mM EDTA、0.5‑1.5M半胱氨酸、10‑30U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为15‑30％的NP‑40、体积百分比浓度为3‑7％的Poly A，其中RRI为RNA酶抑制剂。将所述核酸释放剂平衡至室温后摇匀；取摇匀后的所述核酸释放剂加入至PCR反应管；再加入待测样本并吹打混匀得到目的核酸，其中所述核酸释放剂与所述待测样本的体积比为1:3。本申请具有回收率高、操作简单及生产成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及核酸释放剂及其核酸释放方法。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种用于扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，其最大特点是能将微量的核酸进行大量的富集和增加，从而达到便于检测微量核酸的目的。其中在医学诊断上常用的PCR方法主要是基于双荧光探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法，利用qPCR方法进行体外诊断的靶标主要包括人基因组DNA、DNA病毒、细菌、真菌和RNA病毒等。由于RNA的结构为单链结构，不稳定且容易降解，因此在样品的处理过程当中要求非常高，需要较为复杂的方法对待扩增的RNA样品进行前处理和核酸提取并纯化，得到纯净的核酸后，方能进行检测得到稳定的结果。
为此，目前应用于荧光定量PCR扩增的核酸提取方法主要有以下4种：
(1)传统煮沸法：裂解液与血液样本混匀，高温裂解，离心得到核酸；
(2)浓缩煮沸法：先用多聚糖浓缩沉淀病毒核酸，再加裂解液煮沸，离心得到核酸；
(3)离心柱法：裂解后采用层析柱吸附核酸、再洗脱得到较纯的核酸；
(4)磁珠法：用磁珠吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸。
上述前2种提取方法缺点是需要多次转管、移液、离心等步骤，样本处理耗时长，且在高温处理的操作中难免会丢失部分核酸，使最终用于PCR扩增的核酸样本的运量值偏低。而离心柱法虽然比上述两种煮沸法提取的核酸纯度会有大大提高，但手工操作的步骤多依旧存在效率低下的问题。磁珠法提取步骤简单，回收率高、纯度好，易于自动化，但产品价格昂贵，目前应用并不广泛。
因此，亟待一种回收效率高、操作简单及生产成本低的核酸释放剂及其核酸释放方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了核酸释放剂及其核酸释放方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：核酸释放剂包括0.5-1.5MTris-HCl、30-70mM EDTA、0.5-1.5M半胱氨酸、10-30U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为15-30％的NP-40、体积百分比浓度为3-7％的Poly A，其中RRI为RNA酶抑制剂。
工作原理及有益效果：1、与现有技术相比，本申请的核酸释放剂与传统的核酸释放剂成分完全不同，本申请将PolyA作为核酸助沉剂，半胱氨酸与NP-40作为非离子活性剂来配合PolyA来释放待测样本的核酸，具体来说，半胱氨酸和NP-40在本方案中：两者作为非离子表面活性剂，可裂解细胞膜，使得核酸快速释放，另外NP-40可对逆转录酶起到保护作用，使得逆转录酶在碱性环境中能正常工作，因此在使用时不需要使用裂解液进行煮沸，也不需要采用离心柱法和磁珠法提取核酸，仅仅只需要将其与待测样本放在PCR反应管内混合即可得到核酸，因此能够显著降低操作难度、降低操作时间、减少核酸浪费，从而达到提取效率高、操作简单，可在室温下3分钟内完成样本处理及生产成本低的优点；
2.本方案利用该核酸释放剂释放出来的核酸可直接用于PCR检测，现有技术中有较多关于核酸磁珠提取法的核酸提取剂，然而核酸磁珠提取法还需要配合核酸提取仪以及磁力架进行，且程序一般运行时间在30分钟左右，成本高耗时久，而本方案提供的是可直接释放用于PCR检测的核酸的核酸释放剂。
3、而且本核酸释放剂的配制方法极为简单，只需要将上述各种成本混合摇匀即可，显著降低了生产成本和配制难度。
进一步地，由1M Tris-HCl、50mM EDTA、1M半胱氨酸、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25％的NP-40、体积百分比浓度为5％的Poly A组成。
核酸释放方法，采用上述的核酸释放剂，具体包括以下步骤：
将所述核酸释放剂平衡至室温后摇匀；
取摇匀后的所述核酸释放剂加入至PCR反应管；
再加入待测样本并吹打混匀得到目的核酸，其中所述核酸释放剂与所述待测样本的体积比为1:3。本申请与现有技术相比，无需单独提取样本核酸，只需要将核酸释放剂与待测样本按照1:3的体积比例在PCR反应管内摇匀即可得到目的核酸，彻底免去了现有技术中的离心、弃上清和转管等操作，极大地简化了实验步骤，也因为不存在煮沸以及转移反应容器等操作，因此不存在核酸丢失，使得核酸的回收率极大地提高，也使得检测灵敏度有很大的提高。
进一步地，所述待测样本包括全血、血清、血浆或分泌物。
此设置，应用本核酸释放剂可以对全血、血清、血浆或分泌物等未知样本中的核酸含量进行快速、准确的测定，而且重复性好，特异性强，兼容性好。
进一步地，所述目的核酸为DNA或RNA。
进一步地，所述核酸释放剂的配制方法如下：
分别取1μL的1M Tris-HCl、0.4μL的50mM EDTA、0.2μL的1M半胱氨酸、0.2μL的体积百分比浓度为25％的NP-40、0.2μL的体积百分比浓度为5％的Poly A、0.04μL的20U/μL RRI及7.96μL的DEPC水充分混匀制成。
此设置，证明本申请的核酸释放剂的用量很小，在易于判别的前提下能够保持成本低、使用安全的有点，能够适用于不同类型的荧光定量PCR仪尤其是应用于POCT，可广泛应用于病原微生物的检测、基因突变检测，宠物疾病检测及法医学鉴定等领域。
附图说明
图1是本发明的实施例1的核酸释放剂与磁珠法检测ORF1ab基因的示意图；
图2是实施例2的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测ORF1ab基因的示意图；
图3是实施例3的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测ORF1ab基因的示意图；
图4是实施例4的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测ORF1ab基因的示意图；
图5是实施例1的核酸释放剂与磁珠法检测N基因的示意图；
图6是实施例2的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测N基因的示意图；
图7是实施例3的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测N基因的示意图；
图8是实施例4的核酸释放剂与实施例1的核酸释放剂检测N基因的示意图；
图9是磁珠法检测ORF1ab基因的示意图(快速PCR)；
图10是实施例1检测ORF1ab基因的示意图(快速PCR)；
图11是实施例2检测ORF1ab基因的示意图(快速PCR)；
图12是实施例3检测ORF1ab基因的示意图(快速PCR)；
图13是实施例4检测ORF1ab基因的示意图(快速PCR)；
图14是磁珠法检测N基因的示意图(快速PCR)；
图15是实施例1检测N基因的示意图(快速PCR)；
图16是实施例2检测N基因的示意图(快速PCR)；
图17是实施例3检测N基因的示意图(快速PCR)；
图18是实施例4检测N基因的示意图(快速PCR)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：本方案提供的具体实施例：
本核酸释放剂由1M Tris-HCl、50mM EDTA、1M半胱氨酸、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25％的NP-40、体积百分比浓度为5％的Poly A组成。
如配制一次实验的核酸释放剂，其配制方法如下：
分别取1μL的1M Tris-HCl、0.4μL的50mM EDTA、0.2μL的1M半胱氨酸、0.2μL的体积百分比浓度为25％的NP-40、0.2μL的体积百分比浓度为5％的Poly A、0.04μL的20U/μL RRI及7.96μL的DEPC水充分混匀制成。
其中，1M Tris-HCl为1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；50mM EDTA为50mmol/L的乙二胺四乙酸；RRI为RNA酶抑制剂；DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体，不含杂质RNA、DNA和蛋白质；NP-40为Nonidet P 40的缩写，中文译为乙基苯基聚乙二醇，是一种温和的非离子型去垢剂；Poly A的作用就是核酸助沉剂。
实施例2：缺少半胱氨酸和NP-40的空白组实验
本核酸释放剂由1M Tris-HCl、50mM EDTA、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为5％的Poly A组成。
如配制一次实验的核酸释放剂，其配制方法如下：
分别取1μL的1M Tris-HCl、0.4μL的50mM EDTA、0.2μL的体积百分比浓度为5％的Poly A、0.04μL的20U/μL RRI及8.36μL的DEPC水充分混匀制成。
实施例3：将半胱氨酸替换成月桂酰肌氨酸钠的对照组实验
本核酸释放剂由1M Tris-HCl、50mM EDTA、1M月桂酰肌氨酸钠、20U/μLRRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25％的NP-40、体积百分比浓度为5％的Poly A组成。
如配制一次实验的核酸释放剂，其配制方法如下：
分别取1μL的1M Tris-HCl、0.4μL的50mM EDTA、0.2μL的1M月桂酰肌氨酸钠、0.2μL的体积百分比浓度为25％的NP-40、0.2μL的体积百分比浓度为5％的Poly A、0.04μL的20U/μL RRI及7.96μL的DEPC水充分混匀制成。
实施例4：将NP-40替换成Triton X-100的对照组实验：
本核酸释放剂由1M Tris-HCl、50mM EDTA、1M半胱氨酸、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25％的Triton X-100、体积百分比浓度为5％的Poly A组成。
如配制一次实验的核酸释放剂，其配制方法如下：
分别取1μL的1M Tris-HCl、0.4μL的50mM EDTA、0.2μL的1M半胱氨酸、0.2μL的体积百分比浓度为25％的Triton X-100、0.2μL的体积百分比浓度为5％的Poly A、0.04μL的20U/μL RRI及7.96μL的DEPC水充分混匀制成。
值得说明的是，以上实施例1至实施例4的配置环境和条件完全一致。
实施例5
核酸释放方法，采用上述实施例1－实施例4的核酸释放剂，具体包括以下步骤：
步骤1、将核酸释放剂平衡至室温后摇匀；
步骤2、取摇匀后的核酸释放剂加入至PCR反应管；
步骤3、再加入待测样本并吹打混匀得到目的核酸，其中核酸释放剂与待测样本的体积比为1:3，其中待测样本包括全血、血清、血浆或分泌物，目的核酸为DNA或RNA。
与现有技术相比，本申请的核酸释放剂与传统的核酸释放剂成分完全不同，本申请将PolyA作为核酸助沉剂，半胱氨酸与NP-40作为非离子活性剂来配合PolyA来释放待测样本的核酸，类似于磁珠法核酸提取，但操作方法完全不同，因此在使用时不需要使用裂解液进行煮沸，也不需要采用离心柱法和磁珠法提取核酸，仅仅只需要将其与待测样本放在PCR反应管内混合即可得到核酸，因此能够显著降低操作难度、降低操作时间、减少核酸浪费，从而达到提取效率高、操作简单及生产成本低的优点。
实施例6
本实施例将实施例1-4进行实际应用，且将实施例1-4的核酸释放剂与传统磁珠法提取核酸进行比对，普通PCR程序(LC480)来验证本申请的核酸释放剂以及核酸释放方法的有效性。
实验所用仪器为LC480实时荧光定量PCR仪，购自罗氏诊断有限公司；iRapid4实时荧光定量PCR仪由杭州迪安生物技术有限公司生产；核酸提取仪EB1000由杭州迪安生物技术有限公司生产；
本申请的核酸释放剂及核酸提取或纯化试剂(磁珠法)均由杭州迪安生物技术有限公司(我司)生产，试剂纯度均为分子生物学级，PCR反应液所用试剂及酶系均购自珠海宝锐生物科技有限公司，引物和探针均由上海百力格生物技术有限公司合成；新冠假病毒由复佰澳(苏州)生物科技有限公司定制合成并出具质量检验报告。
核酸释放剂检测2019-nCoV核酸质控品A(1E7～1E4 copies/mL)与磁珠法提取核酸检测2019-nCoV核酸质控品B(1E7～1E4 copies/mL)。
1、试剂准备
(1)实施例1－实施例4的核酸释放剂配制：
实施例1提供的核酸释放剂各组分如下表1：
表1实施例1提供的核酸释放剂
| 试剂名称 | 体积(每人份) |
| 1M Tris-HCl | 1μL |
| 50mM EDTA | 0.4μL |
| 1M半胱氨酸 | 0.2μL |
| 25％NP-40 | 0.2μL |
| 5％Poly A | 0.2μL |
| 20U/μL RRI | 0.04μL |
| DEPC水 | 7.96μL |
核酸释放剂配制方法：按上表1量取各组分依次添加，充分混匀制成。
实施例2－实施例4的核酸释放剂的配制成分同上实施例介绍，在此不累赘说明。
(2)核酸提取或纯化试剂(磁珠法)配置：
使用杭州迪安生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂，其产品主要由裂解液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ，磁珠悬液，洗脱液，蛋白酶K和磁棒套组成。按说明书上标明的方式进行核酸提取。
(3)PCR反应液配制：
PCR反应液各组分添加量如下表2：
表2：PCR反应液组分
其中Fast Direct RT Premix BufferⅡ(dUTP)(Mg2+free)(DG)含有(dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP)，模板取3μL，反应体系为25μL。
其中，引物探针序列如下：
ORF1ab-F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
ORF1ab-R：ACGATTGTGCATCAGCTGA
ORF1ab-P：FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1
N-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
N-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
N-P：VIC-TTGCTGCTGCTTGACAGATT–BHQ1
RNP-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG
RNP-F：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
RNP-F：CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2
(4)样本梯度稀释
将高浓度的新冠假病毒与DEPC水混合后进行10倍梯度稀释，共4个梯度(1E4copies/mL～1E7 copies/mL)，得到样本S1～S4。
2、核酸释放或提取
(1)将本申请实施例1到实施例4提供的核酸释放剂平衡至室温后摇匀，针对每个实施例都进行如下操作：
取6个PCR管，在每个PCR管中加入本申请提供的核酸释放剂10μL，再分别依次加入样本S1(1E7 copies/mL)、S2(1E6 copies/mL)、S3(1E5 copies/mL)、S4(1E4 copies/mL)、阴性质控品、阳性质控品各30μL，轻轻吹打混匀，无须静置，整个过程大概1-3min。其中阳性质控品含有2019-nCoV检测片段，阴性参考品未含有2019-nCoV检测片段。
(2)磁珠法提取严格参照核酸提取或纯化试剂(磁珠法)说明书操作，提取程序如下表3：
表3磁珠法提取核酸的提取程序
(3)分别直接加入本发明提供的PCR反应液，瞬时离心后备用。
3、荧光PCR程序
PCR程序如下表4：
表4:PCR程序
4、结果分析
分析结果如图1-4和图5-8所示，其中图1-4为磁珠法及实施例1到4核酸释放剂检测ORF1ab基因的PCR示意图，图5-8为磁珠法及实施例1到4核酸释放剂检测N基因的PCR示意图，值得一提的是，如图1-4和图5-8仅仅展示了软件中展示的一部分图，真正实验会自动得到详细的数据。
结合图1-4和图2得到的样本检测结果如下表5－表8：
表5实施例1的核酸释放剂和磁珠法的样本检测结果
可见表5中，本申请的实施例1的核酸释放剂提取效率等效于磁珠法提取核酸。因此也就是在配制方法和操作步骤更为简单的前提下，仍然能够与传统磁珠法基本类似的提取效率。
表6实施例2的核酸释放剂和实施例1的核酸释放剂的样本检测结果
可见表6中，本申请的实施例2的核酸释放剂提取效率远低于实施例1的核酸释放剂的提取效率，可见半胱氨酸和NP-40在本方案中起到裂解细胞，释放核酸的作用。
表7实施例3的核酸释放剂和实施例1的核酸释放剂的样本检测结果
可见表7中，本申请的实施例3的核酸释放剂提取效率远低于实施例1的核酸释放剂的提取效率，可见半胱氨酸在本方案中起到破坏蛋白分子，释放核酸的作用。
表8实施例4的核酸释放剂和实施例1的核酸释放剂的样本检测结果
可见表8中，本申请的实施例4的核酸释放剂提取效率远低于实施例1的核酸释放剂的提取效率，可见NP-40在本方案中起到破坏细胞核膜，释放核酸的作用。
实施例7
本实施例采用与实施例6一样的设计，仍旧比对本申请的核酸释放剂与传统磁珠法的提取效率。不同之处，在于该实施例7采用快速PCR程序。
核酸释放剂检测2019-nCoV核酸质控品A(1E7～1E4 copies/mL)与磁珠法提取核酸检测2019-nCoV核酸质控品B(1E7～1E4 copies/mL)快速PCR程序(iRapid4)。
1、试剂准备
(1)实施例1的核酸释放剂配制：
核酸释放剂各组分如表1：
核酸释放剂配制方法：按上表1量取各组分依次添加，充分混匀制成。
(2)PCR反应液配制：
PCR反应液各组分添加量如表2：
其中Fast Direct RT Premix BufferⅡ(dUTP)(Mg2+free)(DG)含有(dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP)，模板取3μL，反应体系为25μL。
其中，引物探针序列如下：
ORF1ab-F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
ORF1ab-R：ACGATTGTGCATCAGCTGA
ORF1ab-P：FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1
N-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
N-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
N-P：VIC-TTGCTGCTGCTTGACAGATT–BHQ1
RNP-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG
RNP-F：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
RNP-F：CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2
(3)样本梯度稀释
将高浓度的新冠假病毒与DEPC水混合后进行10倍梯度稀释，共4个梯度(1E4copies/mL～1E7 copies/mL)，得到样本S1～S4。
2、核酸释放
(1)将本发明的实施例1核酸释放剂平衡至室温后摇匀，取6个PCR管，在每个PCR管中加入本发明提供的核酸释放剂10μL，再分别依次加入样本S1(1E7 copies/mL)、S2(1E6copies/mL)、S3(1E5 copies/mL)、S4(1E4 copies/mL)、阴性质控品、阳性质控品各30μL，轻轻吹打混匀。其中阳性质控品含有2019-nCoV检测片段，阴性参考品未含有2019-nCoV检测片段。
(2)磁珠法提取严格参照核酸提取或纯化试剂(磁珠法)说明书操作，提取程序如表3：
(3)分别直接加入本发明提供的PCR反应液，瞬时离心后备用。
3、荧光PCR程序
PCR程序如下表9：
表9：PCR程序
4、结果分析
如图9-13和图14-18，其中图9-13是本发明的实施例1-4的核酸释放剂与磁珠法检测ORF1ab基因的示意图(快速PCR)，图14-18是本发明的实施例1-4的核酸释放剂与磁珠法检测N基因的示意图(快速PCR)，值得一提的是，图9-13和图14-18仅仅展示了软件中展示的一部分图，真正实验会自动得到详细的数据。
汇总图9-13和图14-18得到的样本检测结果如下表10：
表10磁珠法及实施例1-4核酸释放剂检测结果数据表
结合如图9-13和图14-18以及表10的数据分析，本申请的核酸释放剂提取效率等效于磁珠法提取核酸。因此也就是在配制方法和操作步骤更为简单的前提下，仍然能够与传统磁珠法基本类似的提取效率。
可证明本申请的核酸释放剂的用量很小，在易于判别的前提下能够保持成本低、使用安全的有点，能够适用于不同类型的荧光定量PCR仪尤其是应用于POCT，可广泛应用于病原微生物的检测、基因突变检测，宠物疾病检测及法医学鉴定等领域。
本发明未详述部分为现有技术，故本发明未对其进行详述。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
尽管本文较多地使用了专业术语，但并不排除使用其他术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上做任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.核酸释放剂，其特征在于，由0.5-1.5M Tris-HCl、30-70mM EDTA、0.5-1.5M半胱氨酸、10-30U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为15-30%的NP-40、体积百分比浓度为3-7%的Poly A配制而成，其中RRI为RNA酶抑制剂；
其中，PolyA作为核酸助沉剂，半胱氨酸与NP-40作为非离子活性剂来配合PolyA来释放核酸；
其中，所述核酸释放剂的配制方法如下：
分别取1μL的所述 Tris-HCl、0.4μL的所述 EDTA、0.2μL的所述半胱氨酸、0.2μL的所述NP-40、0.2μL的所述Poly A、0.04μL的所述 RRI及7.96μL的所述DEPC水充分混匀制成。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，由1M Tris-HCl、50mM EDTA、1M半胱氨酸、20U/μL RRI、DEPC水以及体积百分比浓度为25%的NP-40、体积百分比浓度为5%的PolyA配制而成。
3.核酸释放方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的核酸释放剂，具体包括以下步骤：
将所述核酸释放剂平衡至室温后摇匀；
取摇匀后的所述核酸释放剂加入至PCR反应管；
再加入待测样本并吹打混匀得到目的核酸，其中所述核酸释放剂与所述待测样本的体积比为1:3。
4.根据权利要求3所述的核酸释放方法，其特征在于，所述待测样本包括全血、血清、血浆或分泌物。
5.根据权利要求3所述的核酸释放方法，其特征在于，所述目的核酸为DNA或RNA。
6.根据权利要求3所述的核酸释放方法，其特征在于，应用于核酸的PCR检测。
7.根据权利要求3所述的核酸释放方法，其特征在于，核酸释放剂释放的时间为1-3分钟。
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