JPH0515373A - ヒトゲノムｄｎａの抽出および精製方法 - Google Patents
ヒトゲノムｄｎａの抽出および精製方法Info
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- JPH0515373A JPH0515373A JP3009909A JP990991A JPH0515373A JP H0515373 A JPH0515373 A JP H0515373A JP 3009909 A JP3009909 A JP 3009909A JP 990991 A JP990991 A JP 990991A JP H0515373 A JPH0515373 A JP H0515373A
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】ヒトの全血、組織、***、培養細胞からのゲノ
ムＤＮＡの抽出および精製方法に関し、この方法は、動
物の血液や組織、ウイルス（例えば肝炎ウイルス）、植
物細胞からＤＮＡを抽出するためにも用いることができ
る。また限られた実施時間において一部分は手動的にそ
して一部分は自動的に再現することができる方法を提供
する。 【構成】次の段階を含んで成るヒトゲノムＤＮＡの抽出
および精製方法に関する： （１）試料を装入してこれを溶解処理し、（２）クロロ
ホルムまたは他の有機溶媒で抽出し、（３）遠心分離し
てタンパク質部分を除去し、（４）水に希釈し、そして
カチオン性洗剤で沈澱させ、（５）濾過し、適当なフィ
ルターにゲノムＤＮＡを付着させ、これを水に再懸濁す
る。
ムＤＮＡの抽出および精製方法に関し、この方法は、動
物の血液や組織、ウイルス（例えば肝炎ウイルス）、植
物細胞からＤＮＡを抽出するためにも用いることができ
る。また限られた実施時間において一部分は手動的にそ
して一部分は自動的に再現することができる方法を提供
する。 【構成】次の段階を含んで成るヒトゲノムＤＮＡの抽出
および精製方法に関する： （１）試料を装入してこれを溶解処理し、（２）クロロ
ホルムまたは他の有機溶媒で抽出し、（３）遠心分離し
てタンパク質部分を除去し、（４）水に希釈し、そして
カチオン性洗剤で沈澱させ、（５）濾過し、適当なフィ
ルターにゲノムＤＮＡを付着させ、これを水に再懸濁す
る。
Description
【０００１】本発明は、ヒトの全血、組織、***、培養
細胞からのゲノムＤＮＡの抽出および精製方法に関す
る。この方法は、動物の血液や組織、ウイルス（例えば
肝炎ウイルス）、植物細胞からＤＮＡを抽出するために
も用いることができる。より詳しくは、本発明は、限ら
れた実施時間において一部分は手動的にそして一部分は
自動的に再現することができる方法を提供する。
細胞からのゲノムＤＮＡの抽出および精製方法に関す
る。この方法は、動物の血液や組織、ウイルス（例えば
肝炎ウイルス）、植物細胞からＤＮＡを抽出するために
も用いることができる。より詳しくは、本発明は、限ら
れた実施時間において一部分は手動的にそして一部分は
自動的に再現することができる方法を提供する。
【０００２】例えば、Applied Biosystemsの「ＤＮＡ抽
出装置」による伝統的方法が知られているが、低収率で
あり時間がかかるため十分ではない。更に、それは高価
で刺激性であり且つ神経毒性であるフェノールを試薬と
して使用する。従って本出願人は、より高収率をより迅
速に且つ簡単に達成することができる方法を提供する課
題に取り組んだ。
出装置」による伝統的方法が知られているが、低収率で
あり時間がかかるため十分ではない。更に、それは高価
で刺激性であり且つ神経毒性であるフェノールを試薬と
して使用する。従って本出願人は、より高収率をより迅
速に且つ簡単に達成することができる方法を提供する課
題に取り組んだ。
【０００３】ヒトゲノムＤＮＡの抽出および精製方法を
主クレームにおいて示しそして特徴づけ、一方従属クレ
ームには主たる解決案の変形を記載する。
主クレームにおいて示しそして特徴づけ、一方従属クレ
ームには主たる解決案の変形を記載する。
【０００４】本発明の方法は、他の方法では低収率で約
４時間で得られるものを約２０分以内に得ることを可能
にする。更に本発明の方法は、適当な装置を用いて少な
くとも一部分は自動化することができ、少量の水（例え
ば500 〜1000μｌ）を含む試験管中で１０〜１５分間で
ヒトゲノムＤＮＡを提供する。
４時間で得られるものを約２０分以内に得ることを可能
にする。更に本発明の方法は、適当な装置を用いて少な
くとも一部分は自動化することができ、少量の水（例え
ば500 〜1000μｌ）を含む試験管中で１０〜１５分間で
ヒトゲノムＤＮＡを提供する。
【０００５】全体としてヒト血液から出発する本発明の
ＤＮＡの抽出および精製方法は、少なくとも次の段階を
含んで成る： ─試料を装入してこれを溶解処理し、 ─有機溶媒、例えばクロロホルムでタンパク質を抽出
し、 ─遠心分離してタンパク質部分を除去し、 ─水に希釈し、そしてカチオン性洗剤で沈澱させ、 ─濾過し、そして適当なフィルターにゲノムＤＮＡを付
着させ、 ─フィルターを洗浄し、そしてゲノムＤＮＡを溶出さ
せ、これを水に再懸濁する。
ＤＮＡの抽出および精製方法は、少なくとも次の段階を
含んで成る： ─試料を装入してこれを溶解処理し、 ─有機溶媒、例えばクロロホルムでタンパク質を抽出
し、 ─遠心分離してタンパク質部分を除去し、 ─水に希釈し、そしてカチオン性洗剤で沈澱させ、 ─濾過し、そして適当なフィルターにゲノムＤＮＡを付
着させ、 ─フィルターを洗浄し、そしてゲノムＤＮＡを溶出さ
せ、これを水に再懸濁する。
【０００６】こうして得られたＤＮＡは、次のような更
なる分析において使用することができる： １．酵素的制限─サザンブロット。 ２．ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を用いた特定
のゲノム断片の増幅。 伝統的方法に比較して、収率は１２０〜１５０％とな
り、血液１mlあたり４０μg の回収量である。
なる分析において使用することができる： １．酵素的制限─サザンブロット。 ２．ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を用いた特定
のゲノム断片の増幅。 伝統的方法に比較して、収率は１２０〜１５０％とな
り、血液１mlあたり４０μg の回収量である。
【０００７】更に詳しくは、本発明は次の主な段階を含
んで成る： 段階１：通常は300 〜2500μl であるが他の量であって
もよい血液試料を装入し、これをカチオン性洗剤、例え
ばテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴ
ＡＢ）またはドデシルトリメチルアンモニウムブロミド
（ＤＴＡＢ）と、０．５Ｍより高濃度の塩化ナトリウム
により、溶解処理を行う。この溶液を混合し、６８℃ま
で加熱し、そしてしばらくの間（例えば５分間）インキ
ュベートする。
んで成る： 段階１：通常は300 〜2500μl であるが他の量であって
もよい血液試料を装入し、これをカチオン性洗剤、例え
ばテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴ
ＡＢ）またはドデシルトリメチルアンモニウムブロミド
（ＤＴＡＢ）と、０．５Ｍより高濃度の塩化ナトリウム
により、溶解処理を行う。この溶液を混合し、６８℃ま
で加熱し、そしてしばらくの間（例えば５分間）インキ
ュベートする。
【０００８】段階２：１容量のクロロホルムまたは他の
有機溶媒を添加することにより、抽出を行う。 段階３：通常の卓上遠心機を用いて混合物を数分間遠心
し、有機相によりクロッグを形成するタンパク質を除去
する。
有機溶媒を添加することにより、抽出を行う。 段階３：通常の卓上遠心機を用いて混合物を数分間遠心
し、有機相によりクロッグを形成するタンパク質を除去
する。
【０００９】段階４：遠心後、イオン強度を０．５Ｍ
ＮａＣｌ未満に下げるために或る量の水、およびカチオ
ン性洗剤（例えば５％のセチルトリメチルアンモニウム
ブロミド溶液）を水相に添加し、それにより短時間の混
合操作後にカチオン性洗剤ミセル−ＤＮＡ複合体の沈澱
が起こる。
ＮａＣｌ未満に下げるために或る量の水、およびカチオ
ン性洗剤（例えば５％のセチルトリメチルアンモニウム
ブロミド溶液）を水相に添加し、それにより短時間の混
合操作後にカチオン性洗剤ミセル−ＤＮＡ複合体の沈澱
が起こる。
【００１０】段階５：そうして得られたミセル−ＤＮＡ
複合体を含む溶液を濾過する。検査された既知の多孔度
（孔径５〜１５μ）のフィルター（例えば、焼結珪硼酸
ガラス、またはポリプロピレンもしくはポリエチレンの
ような有機母材）を用いて限外濾過を行い、満足できる
方法でＤＮＡ−カチオン性洗剤ミセル複合体を保持す
る。親水性界面は、洗浄操作後にＤＮＡが容易に且つ迅
速に回収できるようにする。有機母材のフィルターはＤ
ＮＡの遅い回収を与えるので、今のところ一般に使われ
ない。ゲノムＤＮＡがフィルター上に固定されたら、次
いでそれを溶出する。
複合体を含む溶液を濾過する。検査された既知の多孔度
（孔径５〜１５μ）のフィルター（例えば、焼結珪硼酸
ガラス、またはポリプロピレンもしくはポリエチレンの
ような有機母材）を用いて限外濾過を行い、満足できる
方法でＤＮＡ−カチオン性洗剤ミセル複合体を保持す
る。親水性界面は、洗浄操作後にＤＮＡが容易に且つ迅
速に回収できるようにする。有機母材のフィルターはＤ
ＮＡの遅い回収を与えるので、今のところ一般に使われ
ない。ゲノムＤＮＡがフィルター上に固定されたら、次
いでそれを溶出する。
【００１１】段階６：この溶出は、次のような一連のフ
ィルター洗浄後に起こる： ─第一の洗浄は、過剰の洗剤を除去するために低イオン
強度の水溶液中で行い； ─第二の洗浄は、ＤＮＡ−カチオン性洗剤複合体をＤＮ
Ａ−Ｎａに変えるために、アルコールとイオン溶液の混
合物、例えば０．２Ｍ ＮａＣｌ／７０％エタノールを
用いて行い； ─第三の洗浄は、過剰の塩、例えばＮａＣｌタイプを除
去するために、アルコールと低イオン強度の溶液との混
合物（例えば７０％アルコールと３０％水）を用いて行
う。
ィルター洗浄後に起こる： ─第一の洗浄は、過剰の洗剤を除去するために低イオン
強度の水溶液中で行い； ─第二の洗浄は、ＤＮＡ−カチオン性洗剤複合体をＤＮ
Ａ−Ｎａに変えるために、アルコールとイオン溶液の混
合物、例えば０．２Ｍ ＮａＣｌ／７０％エタノールを
用いて行い； ─第三の洗浄は、過剰の塩、例えばＮａＣｌタイプを除
去するために、アルコールと低イオン強度の溶液との混
合物（例えば７０％アルコールと３０％水）を用いて行
う。
【００１２】空気流によりフィルターから微量のアルコ
ールを全て取り除いた後、フィルターを低イオン強度の
水溶液（例えば水）で室温にてまたは加熱することによ
り例えば６８℃にて洗浄することにより、ＤＮＡを回収
する。
ールを全て取り除いた後、フィルターを低イオン強度の
水溶液（例えば水）で室温にてまたは加熱することによ
り例えば６８℃にて洗浄することにより、ＤＮＡを回収
する。
Claims (6)
- 【請求項１】 全血、組織または培養細胞からゲノムＤ
ＮＡを抽出する方法であって、次の段階： （１）試料を装入してこれを溶解処理し、 （２）試料を抽出し、 （３）遠心分離してタンパク質部分を除去し、 （４）水に希釈し、そしてカチオン性洗剤で沈澱させ、 （５）濾過し、そして適当なフィルターにゲノムＤＮＡ
を付着させ、これを水に再懸濁する、 を含んで成る方法。 - 【請求項２】 溶解溶液が、Ｃ8 〜Ｃ18を含むサイズの
炭化水素鎖を有するカチオン性洗剤と塩化ナトリウム
（０．５Ｍより高濃度）を含有する、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 ＤＮＡを含む複合体が多孔質（珪硼酸）
ガラスフィルターまたは他のフィルター材料上で限外濾
過される、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 全血、組織または培養細胞が試験管に装
入される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 フィルターの洗浄が、少なくとも次の工
程： ─低イオン強度の水溶液中での第一の洗浄； ─アルコールとイオン溶液の混合物による第二の洗浄； ─アルコールと低イオン強度の溶液による第三の洗浄、 を含んで成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項６】 少量の水が使用される、請求項１〜５の
いずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT83334A IT1240870B (it) | 1990-02-14 | 1990-02-14 | Procedimento per l'estrazione e la purificazione di dna genomico umano |
| IT83334A/90 | 1990-02-14 | ||
| US54425090A | 1990-06-26 | 1990-06-26 | |
| US78375591A | 1991-10-28 | 1991-10-28 | |
| US08/268,577 US5596092A (en) | 1990-02-14 | 1994-07-06 | Extraction of genomic DNA from blood using cationic detergents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0515373A true JPH0515373A (ja) | 1993-01-26 |
Family
ID=33494191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3009909A Pending JPH0515373A (ja) | 1990-02-14 | 1991-01-30 | ヒトゲノムｄｎａの抽出および精製方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5596092A (ja) |
| EP (1) | EP0442026B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0515373A (ja) |
| AT (1) | ATE132158T1 (ja) |
| AU (1) | AU7029691A (ja) |
| CA (1) | CA2019911A1 (ja) |
| DE (1) | DE69024477T2 (ja) |
| IT (1) | IT1240870B (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999015645A1 (fr) * | 1997-09-22 | 1999-04-01 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Technique d'isolation d'adn |
| KR100456284B1 (ko) * | 2002-07-09 | 2004-11-09 | 학교법인 인하학원 | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 |
| JP2005253464A (ja) * | 2004-02-13 | 2005-09-22 | Eiken Chem Co Ltd | 簡易的核酸抽出法 |
| JP2007509620A (ja) * | 2003-11-04 | 2007-04-19 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 迅速かつ低コストな核酸の単離方法 |
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