CN115786328A - 基于硅藻壳的快速核酸提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种基于硅藻壳的快速核酸提取方法。本发明是一种利用硅藻壳表面巨大的比表面积和介孔结构来进行核酸提取和吸附的方法，具体是将硅藻壳与生物样本混合，硅藻壳可裂解生物样本使核酸释放，利用硅藻壳表面的硅羟基(Si‑OH)吸附和富集核酸，收集吸附核酸的硅藻壳作为检测靶标进行扩增反应检测。本发明操作简单，成本低，提取效率高，提取速度快，核酸产物质量高。

Description

基于硅藻壳的快速核酸提取方法

技术领域

本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种基于硅藻壳的快速核酸提取方法。

背景技术

核酸检测因其出色的灵敏度和特异性成为目前主要的病原微生物检测手段，其中，核酸提取则是核酸检测的重要组成部分和必备过程。由于生物样本中的核酸通常包含在细胞或病毒粒子中，并与各种蛋白质紧密结合，且生物样本中的多种有机杂质，如血红素、粘蛋白等会抑制下游的核酸检测反应，核酸提取不充分会导致产物中靶标核酸含量过低，从而导致检测结果重复性和灵敏度较差，因此获取高质量的核酸对于核酸检测极其重要。

目前已公开的核酸提取方法主要分为液相提取和固相提取两种。液相提取的原理是根据化合物的相对溶解度分离化合物来进行的(DOI:10.1021/acs.analchem.1c04460)，其中，有机试剂萃取法是最经典的液相提取法，但其提取过程中使用了氯仿、苯酚等多种毒性较强的有机试剂，且提取周期长，已逐渐被淘汰。在核酸的液相提取领域，还有众多研究，S.Fister等(DOI:10.1016/j.seppur.2015.03.035)测试了16种不同的离子液体比较DNA提取的回收率；Clark等(DOI：10.1021/ac504260t)首次证明使用疏水性离子液体来萃取核酸，疏水磁性离子液体可用于磁辅助分散液-液微萃取，可以缩短提取时间和提高提取效率；Marengo等(DOI:10.1186/s13007-019-0408-x)进一步利用此方法，实现了拟南芥基因组DNA的提取，同时对磁性离子液体的体积和提取时间进行了优化。

与液相提取相比，核酸的固相提取具有相分离高效，污染风险低和样品需求少的优点(DOI:10.1016/j.trac.2019.03.008)，目前最常用的固相提取法为磁珠法和离心柱法。中国发明专利CN113667664A公开了一种基于纳米磁珠的核酸提取方法，提取核酸质量较高，可满足基本的分子生物实验要求，但该核酸提取方法依然存在着不可忽视的问题，因包含洗脱和洗涤步骤导致磁珠提取耗时较长，步骤繁琐，且磁珠材料成本较高，不利于流行病的大范围筛查。离心柱法提取核酸的研究中，二氧化硅材料是制备离心柱的主要基材，因此作为固相基质被用于核酸提取，Pearlman等(DOI:10.1021/acsami.9b21564)基于二氧化硅材料开发了一种简单且成本低的核酸提取方法，该方法使用磁珠、移液器、钢丝球和外部磁体来实现高梯度磁分离，适用于不同体积的样品；Ana B.

等(DOI:10.1039/c3nr34358h)研究发现，将二氧化硅与Fe₃O₄或者聚合物吸附剂结合，可以有效的吸附DNA，但这种微球的比表面积较小，其DNA吸附能力非常有限，导致DNA分离产量较低；中国发明专利CN114450419A公开了一种利用二氧化硅固体支持物来进行核酸提取的方法，此方法由于提取缓冲液引入了多种金属离子，会导致其对于下游的扩增反应产生抑制。

硅藻是光合单细胞藻类，是纳米结构二氧化硅的天然来源，这些微生物在它们的膜中产生高度有序的多孔细胞壁，称为硅藻壳(DOI:10.3390/app10196811)。硅藻壳因其独特的介孔结构具有巨大的比表面积，在许多方面展现出了十分优良的性能。Jeehee Lee等(DOI：10.1021/acsnano.0c00621)发现硅藻壳因其纳米多孔结构而具有超亲水性和超嗜血性，基于此开发出了一种新型止血材料；Ellegaard等(DOI：10.1007/s10811-016-0893-5)研究发现，硅藻壳可用于减弱紫外线辐射方面；G.W.Lim等(DOI:10.1007/s10811-014-0356-9)发现硅藻壳对蛋白质有较佳的吸附作用。目前硅藻壳对于核酸的吸附性研究报道较少，还未有将硅藻壳用于核酸提取的研究。

中国发明专利(CN113755484A，CN113930132A，CN114988456A，CN114107282A，CN111298765A)公开了使用硅藻土为固相基质进行核酸提取的方法，然而上述方法所用的硅藻土均需要进行化学改性，通过借助添加在硅藻土表面的化学基团对样本中的核酸进行吸附和富集，步骤繁琐，增加了成本，除此之外，这些方法所用的硅藻土仅可用于核酸的吸附和富集，无法完成生物样本的裂解和核酸的释放，需要通过热裂解或化学试剂裂解等额外的步骤对生物样本进行预处理，流程复杂。

因此，如何快速且高效地对样本中的核酸进行提取，提高核酸的浓度，减少抑制下游扩增检测反应的杂质是核酸提取技术的关键。为了简化提取流程，进一步提高核酸提取的效率，降低核酸提取的成本，亟待开发一种新的核酸提取技术，应用于各种领域的核酸检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种基于硅藻壳的快速核酸提取方法，操作简单，成本低，提取效率高，提取速度快，核酸产物质量高。

本发明所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，是将硅藻壳与生物样本混合，硅藻壳可裂解生物样本使核酸释放，并通过“阴离子-阳离子-阴离子”盐桥的作用在硅藻壳表面吸附和富集核酸，收集硅藻壳沉淀完成核酸提取。

所述硅藻壳的来源为海洋单细胞硅藻，海洋单细胞硅藻为含硅质壳的海洋单细胞生物，优选威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)、隐秘小环藻(Cyclotellacryptica)、假微型海链藻(Thalassiosira sp.)、舟形藻(Navicula sp.)、卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)、斜纹藻(Pleurosigma indicum)、圆筛藻(Coscinodiscussp.)中的一种或多种。

优选的，硅藻壳提纯方法参考中国发明专利CN112978738A公开的一种从海洋单细胞硅藻提取纯净硅藻壳的新方法，其提纯过程简单易行，获得的硅藻壳形态完整，有机质含量少。

所述生物样本为口咽拭子浸提液和血清。

所述核酸的来源为原核细胞、真核细胞和病毒粒子。

优选的，1-20μg硅藻壳与20-1000μL生物样本，优选生物样本体积为50-200μL。

优选的，制备口咽拭子浸提液样本的方法：按照国家卫健委发布的《新冠病毒核酸采样培训方案》中的要求采集志愿者的口咽拭子，采集完成后将拭子浸入含500μL生理盐水的离心管中，置于漩涡振荡器上振荡30sec，弃去咽拭子获得所述口咽拭子浸提液样本。

优选的，制备血清的方法：将收集的血液样本置于不含抗凝剂的收集管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，沿着收集管将血凝块轻轻划开，4℃放置过夜，待其平衡后，将收集管置于离心机中4℃离心，转速为3000rpm，时间为15min，离心结束后收集上清获得所述血清样本。

优选的，硅藻壳与生物样本混合后，加入无机盐溶液，可促进硅藻壳富集核酸，其中，无机盐包括氯化镁或氯化钠，镁离子和钠离子在提取体系中的终浓度分别为0.1-100mM和0.1-1000mM。

硅藻壳沉淀可用于核酸扩增检测，将硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合后即可进行检测，优选核酸扩增检测方法为聚合酶链式反应(PCR)。

在实际操作中，本发明核酸提取过程中涉及两个步骤：(1)将硅藻壳与生物样本混合，裂解生物样本，硅藻壳吸附和富集核酸，(2)收集硅藻壳沉淀完成核酸提取；

其中，步骤(1)中，为使硅藻壳与生物样本充分混合，裂解样本并充分接触核酸，可采用手动颠倒混匀和漩涡振荡器振荡混匀，优选振荡器混匀，振荡时间为1-60sec，为促进硅藻壳对核酸的吸附作用，可引入钠离子或镁离子，促进硅藻壳表面吸附和富集核酸；

步骤(2)中，收集硅藻壳沉淀时可静置沉降1-5min或1000-4000rpm转速下离心1-60sec，小心吸取并弃置上清，收集硅藻壳沉淀用于扩增检测。

优选的，可直接将生物样本与硅藻壳于扩增管内混合，提取核酸，弃上清后，直接将扩增缓冲体系加入扩增管内进行下游扩增，实现核酸的单管提取和检测，可用于“从样本到答案”的一体化核酸快速检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.操作步骤简单。无需对生物样本进行额外处理以释放核酸，无需常规的洗涤和洗脱步骤，无需使用大型仪器，设备仪器要求低，仅需小型漩涡振荡器和微型离心机即可完成核酸提取。

2.提取效率高，提取速度快，核酸产物质量高。仅需5-10min便可以完成整个提取过程，且具有与市售试剂盒相当的提取效率，所述市售试剂盒为常用核酸提取试剂盒：磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒(DP438，天根生化科技有限公司)和血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304，天根生化科技有限公司)。

3.提取体系简单，成本低。本发明无需胍盐、十二烷基硫酸钠(SDS)等裂解剂和乙醇、异丙醇等洗涤试剂，降低成本的同时避免了上述试剂对后续扩增检测的抑制作用。

4.适用性广。本发明适用于不同生物样本的核酸提取，为临床诊断技术领域提供了新的核酸提取方法，在核酸现场快速检测的应用中具有广阔的应用前景。

5.推进基础研究进展。本发明为用于核酸提取的新型天然生物材料的研究开发提供了理论依据和实践参考。

附图说明

图1、硅藻壳的扫描电子显微镜图片；

图2、实施例1血清样本的大肠杆菌O157:H7特异性基因荧光扩增曲线图；

图3、实施例2血清样本的大肠杆菌O157:H7特异性基因荧光扩增曲线图；

图4、实施例3血清样本的金黄色葡萄球菌nuc基因荧光扩增曲线图；

图5、实施例4血清样本的乙肝病毒S蛋白基因荧光扩增曲线图；

图6、实施例5口咽拭子浸提液样本的人内参基因RNase P基因荧光扩增曲线图；

图7、血清样本多种核酸提取方法的乙肝病毒S蛋白基因荧光扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

需要说明的是，实施例中用到的所有原料除特殊说明外，均为市购。

实施例中均采用荧光实时PCR法检测靶标核酸，PCR扩增反应缓冲体系的总体积为20μL，成分见表1。荧光实时PCR的流程为：使用CFX Connect TM实时PCR***(购自美国Bio-Rad公司)使扩增混合物进行快速热循环，包括95℃3min的初始变性和40个95℃15sec和58℃10sec的快速循环，每隔一个循环收集一次荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图。

表1PCR扩增反应缓冲体系成分表

实施例1：血清样本的核酸提取及大肠杆菌O157:H7检测

基于大肠杆菌O157:H7的保守序列，通过NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)软件和NUPACK软件(www.nupack.org/)设计特异性引物。

引物序列：

Primer F:5’-CCATGTGCAATATGCAACTAC-3’(CP064383.1)(SEQ ID NO:1)

Primer R:5’-CTTCATCTCCTTCCGATATACC-3’(CP064383.1)(SEQ ID NO:2)

取100μL对数期大肠杆菌O157:H7的菌液于离心管中，按照1:9的比例，梯度稀释10倍后备用。将990μL血清样本与10μL稀释的大肠杆菌O157:H7菌液混合，制备得到模拟大肠杆菌感染的血清样本。取20μL血清样本与1μg卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)的藻壳混合，并加入10μL浓度为3.6％(w/v)氯化钠溶液和10μL浓度为100mM氯化镁溶液，使钠离子和镁离子的终浓度分别为153.85mM和25mM，于小型漩涡振荡器上振荡15sec，使硅藻壳和核酸充分接触。将离心管放入微型离心机中3000rpm离心60sec，小心吸去上清，将硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合，并加入上述引物进行核酸扩增反应检测，两条引物的终浓度均为4×10^-7M，扩增结果如图2，阴性对照组(NTC)为等量空白培养基代替大肠杆菌O157:H7菌液加入血清中制成的模拟样本。

从图2中可以看出，本发明方法提取的血清样本核酸中检测到了大肠杆菌O157:H7的特异性基因。

实施例2：血清样本的核酸提取及大肠杆菌O157:H7检测

基于大肠杆菌O157:H7的高度保守序列，通过NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)软件和NUPACK软件(www.nupack.org/)设计特异性引物。

引物序列：

Primer F:5’-CCATGTGCAATATGCAACTAC-3’(CP064383.1)(SEQ ID NO:1)

Primer R:5’-CTTCATCTCCTTCCGATATACC-3’(CP064383.1)(SEQ ID NO:2)

取100μL对数期大肠杆菌O157:H7的菌液于离心管中，按照1：9的比例，梯度稀释10倍后备用。将990μL血清样本与10μL稀释的大肠杆菌O157:H7菌液混合，制备得到模拟大肠杆菌感染的血清样本。取1000μL血清样本与20μg威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)和舟形藻(Navicula sp.)的藻壳混合物混合，并加入200μL浓度为3.6％(w/v)氯化钠溶液，使钠离子终浓度为102.56mM。用手上下颠倒离心管10次，再将离心管置于离心管架上静置1min，使硅藻壳沉降到离心管底部，小心吸去上清，硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合，并加入上述引物进行核酸扩增反应检测，两条引物的终浓度均为4×10^-7M，扩增结果如图3，阴性对照组(NTC)为等量空白培养基代替大肠杆菌O157:H7菌液混入血清中制成的模拟样本。

从图3中可以看出，本发明方法提取的血清样本核酸中检测到了大肠杆菌O157:H7的特异性基因。结果表明，本发明核酸提取方法操作简便，无需使用振荡和离心设备，也可快速高效提取核酸，可用于在缺乏仪器设备的条件下提取核酸并进行现场即时检测。

实施例3：血清样本的核酸提取及金黄色葡萄球菌nuc基因检测

基于金黄色葡萄球菌nuc基因的保守序列，通过NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)软件和NUPACK软件(www.nupack.org/)设计特异性引物。

引物序列：

Primer F：5’-GTCGAGTTTGACAAAGGTC-3’(DQ399678.1)(SEQ ID NO:3)

Primer R：5’-TTAGCCAAGCCTTGACG-3’(DQ399678.1)(SEQ ID NO:4)

取100μL对数期金黄色葡萄球菌的菌液于离心管中，按照1：9的比例，梯度稀释10倍后备用。将990μL血清样本与10μL稀释的大肠杆菌O157:H7菌液混合，制备得到模拟大肠杆菌感染的血清样本。取100μL血清样本与5μg假微型海链藻(Thalassiosira sp.)的藻壳混合，并加入40μL浓度为93.75mM(w/v)氯化镁溶液，使镁离子终浓度为26.79mM，于小型漩涡震荡器上振荡30sec，使硅藻壳和核酸充分接触。将离心管放入微型离心机中2000rpm离心30sec，小心吸去上清，将硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合，并加入上述引物进行核酸扩增反应检测，两条引物的终浓度均为4×10^-7M，扩增结果如图4，阴性对照组(NTC)为等量空白培养基代替金黄色葡萄球菌菌液加入血清中制成的模拟样本。

从图4中可以看出，本发明方法提取的血清样本核酸中检测到了金黄色葡萄球菌的nuc基因。

实施例4：血清样本的核酸提取及乙肝病毒S蛋白基因检测

基于乙肝病毒的S蛋白基因序列，通过NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)软件和NUPACK软件(www.nupack.org/)设计特异性引物。

引物序列：

Primer F：5’-AGACTCGTGGTGGACTTC-3’(AB809557.1)(SEQ ID NO:5)

Primer R：5’-GGTTGGTGAGTGATTGGAG-3’(AB809557.1)(SEQ ID NO:6)

取200μL乙肝患者的血清样本或乙肝病毒检测结果阴性的志愿者的血清样本与5μg圆筛藻(Coscinodiscus sp.)和隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)的藻壳混合物混合，并加入100μL浓度为100mM(w/v)氯化镁溶液，使镁离子终浓度为33.33mM，于小型漩涡振荡器上振荡10sec，使硅藻壳和核酸充分接触。将离心管放入微型离心机中1000rpm离心30sec，小心吸去上清，将硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合，并加入上述引物进行核酸扩增反应检测，两条引物的终浓度均为4×10^-7M，扩增结果如图5，阴性对照组(NTC)为乙肝病毒检测结果阴性的志愿者的血清。

从图5中可以看出，本发明方法提取的血清样本核酸中检测到了乙肝病毒的S蛋白基因。

实施例5：口咽拭子浸提液样本的核酸提取及人内参基因RNase P基因检测

基于常用的人内参基因RNase P基因序列，通过NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)软件和NUPACK软件(www.nupack.org/)设计特异性引物。

引物序列：

Primer F：5’-GGCCATCAGAAGGAGATGAAGATT-3’(NM_006413.5)(SEQ ID NO:7)

Primer R：5’-CATTCTTTTCAGCCCTCACACT-3’(NM_006413.5)(SEQ ID NO:8)

向500μL口咽拭子浸提液样本中加入10μg斜纹藻(Pleurosigma indicum)的藻壳，于小型漩涡振荡器上振荡30sec。将离心管放入微型离心机3000rpm离心20sec，使硅藻壳离心到离心管底部，小心吸去上清，将硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合，并加入上述引物进行核酸扩增反应检测，两条引物的终浓度均为4×10^-7M，扩增结果如图6，阴性对照组(NTC)为未擦拭志愿者咽喉的空白咽拭子的浸提液。

从图6中可以看出，本发明方法提取的血清样本核酸中检测到了人内参基因RNaseP基因。

实施例6：多种核酸提取方法对比

基于乙肝病毒的S蛋白基因序列，通过NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)软件和NUPACK软件(www.nupack.org/)设计特异性引物。

引物序列：

Primer F：5’-AGACTCGTGGTGGACTTC-3’(AB809557.1)(SEQ ID NO:5)

Primer R：5’-GGTTGGTGAGTGATTGGAG-3’(AB809557.1)(SEQ ID NO:6)

取200μL乙肝患者的血清样本或乙肝病毒检测结果阴性的志愿者的血清样本与20μg圆筛藻(Coscinodiscus sp.)和隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)的藻壳混合物混合，并加入80μL浓度为100mM(w/v)氯化镁溶液，使镁离子终浓度为28.57mM，于涡旋仪上震荡15sec，使硅藻壳和核酸充分接触。将离心管放入微型离心机中1000rpm离心15sec，小心吸去上清，将硅藻壳沉淀与扩增缓冲液混合，并加入上述引物进行核酸扩增反应检测，两条引物的终浓度均为4×10^-7M。

参照产品说明书分别使用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒(DP438，天根生化科技有限公司)、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304，天根生化科技有限公司)和样本核酸释放剂(JM103，青岛简码基因科技有限公司)对相同的血清样本进行核酸提取，将各核酸提取产物作为靶标进行PCR扩增检测，通过比较达到荧光阈值所需的循环数(C_t值)判断各方法的核酸提取效率，结果如图7，阴性对照组(NTC)为乙肝病毒检测结果阴性的志愿者的血清。

从图7可以看出，本发明方法提取的核酸为模板进行的PCR扩增反应具有最低的C_t值，表明该方法优于市售试剂盒。

Claims (10)

1.一种基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：将硅藻壳与生物样本混合，硅藻壳可裂解生物样本使核酸释放，并吸附和富集核酸，收集硅藻壳沉淀完成核酸提取。

2.根据权利要求1所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：硅藻壳为海洋单细胞硅藻。

3.根据权利要求2所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：海洋单细胞硅藻为含硅质壳的海洋单细胞生物。

4.根据权利要求3所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：含硅质壳的海洋单细胞生物包括威氏海链藻、隐秘小环藻、假微型海链藻、舟形藻、卵形藻、斜纹藻、圆筛藻中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：生物样本为口咽拭子浸提液和血清样本。

6.根据权利要求1所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：核酸的来源为原核细胞、真核细胞和病毒粒子。

7.根据权利要求1所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：硅藻壳用量为1-20μg，生物样本用量为20-1000μL。

8.根据权利要求1所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：硅藻壳与生物样本混合后，加入无机盐溶液，促进硅藻壳富集核酸。

9.根据权利要求8所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：无机盐包括氯化镁或氯化钠，且镁离子和钠离子在提取体系中的终浓度分别为0.1-100mM和0.1-1000mM。

10.根据权利要求1所述的基于硅藻壳的快速核酸提取方法，其特征在于：硅藻壳沉淀用于核酸扩增检测。

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