CN115120716A - 用pd-1轴结合拮抗剂和rna疫苗治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用PD‑1轴结合拮抗剂和RNA疫苗治疗癌症的方法。本公开提供了用于治疗个体的癌症的方法、用途和试剂盒。所述方法包括向所述个体施用PD‑1轴结合拮抗剂(诸如抗PD‑1或抗PD‑L1抗体)和RNA疫苗(例如个体化癌症疫苗，其包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生)。本公开进一步提供了RNA分子(例如个体化RNA癌症疫苗，其包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生)以及DNA分子与用于产生或使用RNA疫苗的方法。

Description

用PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗治疗癌症的方法
本申请是申请日为2020年01月13日、中国申请号为202080011177.5、发明名称为“用PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗治疗癌症的方法”的发明申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月14日提交的美国临时申请序列号62/792,387、于2019年1月22日提交的美国临时申请序列号62/795,476和于2019年8月15日提交的美国临时申请序列号62/887,410的优先权权益，这些临时申请各自通过引用整体并入本文。
以ASCII文本文件提交序列表
以下提交的以ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：146392046940SEQLIST.TXT，记录日期：2020年1月13日，大小：41KB)。
技术领域
本公开涉及通过施用PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)与RNA疫苗联合来治疗癌症的方法、用途和试剂盒。本公开进一步提供了RNA分子(例如个体化RNA癌症疫苗，所述个体化RNA癌症疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生)以及DNA分子和用于产生或使用RNA疫苗的方法。
背景技术
黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的皮肤癌潜在致命性形式。2012年，全世界黑色素瘤新增病例约232,000例，死亡55,000例；欧洲新增病例超过100,000例，死亡22,000例(Ferlay J,Steliarova-Foucher E,Lortet-Tieulent J等人,Eur J Cancer 2013；49:1374-403)。在美国，2018年预计有91,270例新确诊黑色素瘤病例，并且预计约9,320名患者死于该疾病(美国癌症协会2018)。此外，估计表明黑色素瘤发生率每10-20年增加一倍(Garbe C,Leiter U.Clin Dermatol 2009；27:3-9)。
黑色素瘤患者的临床结果高度依赖于就诊时的分期。直到最近，转移性黑色素瘤的治疗选择仍然有限。达卡巴嗪被视为标准一线治疗；但是结果不佳，缓解率为5％-12％，中位无进展存活(PFS)小于2个月，并且中位总存活(OS)为6.4个月至9.1个月(MiddletonMR,Grob JJ,Aaronson N等人,J Clin Oncol 2000；18:158-66；Bedikian AY,Millward M,Pehamberger H等人,J Clin Oncol 2006；24:4738-45；Chapman PB,Hauschild A,RobertC等人,N Engl J Med 2011；364:2507-16；Robert C,Thomas L,Bondarenko I等人,N EnglJ Med 2011；364:2517-26)。尽管联合化疗以及化疗联合干扰素-α(IFN)-α或白介素-2(IL-2)表现出改善的缓解率，但是并未使OS得到改善(Chapman PB,Einhorn LH,Meyers ML等人,J Clin Oncol 1999；17:2745-51；Ives NJ,Stowe RL,Lorigan P等人,J Clin Oncol2007；25:5426-34)。
靶向抑制T细胞活化的共抑制受体或“免疫检查点”的免疫治疗剂改善了晚期黑色素瘤患者的预后。尽管取得了这些进展，但许多患者对当前的疗法无应答或后来死于其疾病，凸显了对更有效的治疗方案的持续未满足的医疗需求。
有关当前可用的免疫疗法的临床和非临床数据表明，单药免疫疗法在大多数患者中不太可能诱导完全并且持久的抗肿瘤应答。恶性细胞对宿主的免疫抑制由多种途径介导；因此，可能需要采用两种或更多种靶向癌症免疫治疗(CIT)剂的联合治疗方案，以充分发挥宿主免疫***的抗肿瘤潜力。
治疗性疫苗虽然很有前景，但过去一直未能达到预期。潜在原因之一是癌症特异性T细胞在长期暴露于癌症细胞期间变得功能耗竭。
本文所引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开和UniProtKB/Swiss-Prot登录号通过引用整体并入本文，如同个别参考文献各自特定地和个别地指示为通过引用并入一样。
发明内容
本文提供了涉及用于治疗癌症的PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PD1或抗PD-L1抗体)和RNA疫苗的方法、试剂盒和用途。
在一些方面，本文提供了治疗个体的癌症的方法，这些方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗，其中RNA疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为PD-1结合拮抗剂。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体为纳武单抗或派姆单抗。在一些实施例中，抗PD-1抗体以约200mg的剂量施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为PD-L1结合拮抗剂。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。在一些实施例中，抗PD-L1抗体为阿维单抗或德瓦鲁单抗。在一些实施例中，抗PD-L1抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含含有氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：1)的HVR-H1、含有氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：2)的HVR-2以及含有氨基酸RHWPGGFDY(SEQ ID NO：3)的HVR-3；和(b)轻链可变区(VL)，其包含含有氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：4)的HVR-L1、含有氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：5)的HVR-L2以及含有氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO：6)的HVR-L3。在一些实施例中，抗PD-L1抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。在一些实施例中，抗PD-L1抗体以约1200mg的剂量施用于个体。
在上述实施例中任一项的一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂以21天或3周的间隔施用于个体。
在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码10-20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗配制成脂质体复合物纳米颗粒或脂质体。在一些实施例中，RNA疫苗以约15μg、约25μg、约38μg、约50μg或约100μg的剂量施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗以21天或3周的间隔施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，并且RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂在第1周期至第8周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在第8周期后进一步施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在17个另外的21天周期中进一步施用于个体，该PD-1轴结合拮抗剂在第13周期至第29周期的第1天施用于个体，并且该RNA疫苗在第13周期、第21周期和第29周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，该PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约200mg的剂量施用于个体，并且该RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天以约25μg的剂量、在第2周期的第8天以约25μg的剂量、在第2周期的第15天以约25μg的剂量并且在第3周期至第7周期中每个周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗经静脉内施用。在一些实施例中，个体是人。
在一些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌和头颈部癌。在一些实施例中，癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为皮肤黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤不是眼黑色素瘤或肢端黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为转移性(例如，IV期，诸如复发性或新发IV期)或不可切除的局部晚期(例如，IIIC期或IIID期)黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为既往未接受过治疗的晚期黑色素瘤。在一些实施例中，所述方法使无进展存活(PFS)得到改善。在一些实施例中，所述方法使客观缓解率(ORR)得到提高。
在一些方面，本文提供了试剂盒或制品，这些试剂盒或制品包括用于与RNA疫苗联合使用以根据上述实施例中任一项所述的方法治疗患有癌症的个体的PD-1轴结合拮抗剂。
在一些方面，本文提供了一种在治疗患有癌症的人个体的方法中使用的PD-1轴结合拮抗剂，该方法包括将有效量的PD-1轴结合拮抗剂与RNA疫苗联合施用于个体，其中RNA疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些方面，本文提供了一种在治疗患有癌症的人个体的方法中使用的RNA疫苗，该方法包括将有效量的RNA疫苗与PD-1轴结合拮抗剂联合施用于个体，其中RNA疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
在一些方面，本文提供了一种RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：(1)5'帽；(2)5'非翻译区(UTR)；(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(4)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(5)3'UTR，该3'UTR包含：(a)***的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12SRNA的非编码RNA或其片段；以及(6)poly(A)序列。
在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，所述编码至少一个新表位的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列(例如，上述(3))与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(4))之间。在一些实施例中，RNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，RNA分子在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸连接基的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列；其中所述编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和所述编码新表位的多核苷酸序列形成第一连接基-新表位模块；并且其中在5'→3'方向上，形成第一连接基-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列(例如，上述(3))与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(4))之间。在一些实施例中，氨基酸连接基包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:39)。在一些实施例中，编码氨基酸连接基的多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQID NO:37)。在一些实施例中，RNA分子在5'→3'方向上进一步包含：至少第二连接基-表位模块，其中所述至少第二连接基-表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，形成第二连接基-新表位模块的多核苷酸序列在编码第一连接基-新表位模块的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(4))之间；并且其中第一连接基-表位模块的新表位不同于第二连接基-表位模块的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且RNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列，其中编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(4))之间。在一些实施例中，RNA分子包含图4所示的序列。在一些实施例中，图4中的N表示编码一个或多个新表位(例如，编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位)的多核苷酸序列。在一些实施例中，图4中的N表示一个或多个(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同)连接基-新表位模块，在5'→3'方向上，每个模块包含编码一个或多个氨基酸连接基的多核苷酸序列以及编码新表位的多核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA分子的5'帽(例如，上述(1))包含以下结构的D1非对映异构体：
Figure BDA0003642845070000071
在一些实施例中，RNA分子的5'UTR(例如，上述(2))包含序列UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:23)。在一些实施例中，RNA分子的5'UTR(例如，上述(2))包含序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:21)。在一些实施例中，由RNA分子编码的分泌性信号肽(例如，在上述(3)中)包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:27)。在一些实施例中，RNA分子的编码分泌性信号肽的多核苷酸序列(例如，上述(3))包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，由RNA分子编码的MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分(例如，上述(4))包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:30)。在一些实施例中，RNA分子的编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(4))包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:28)。在一些实施例中，RNA分子的AES mRNA的3'非翻译区(例如，上述(5a))包含序列
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGG
GUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ ID NO:33)。在一些实施例中，其中RNA分子的线粒体编码的12S RNA的非编码RNA(例如，上述(5b))包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，RNA分子的3'UTR(例如，上述(5))包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:31)。在一些实施例中，RNA分子的poly(A)序列(例如，上述(6))包含120个腺嘌呤核苷酸。
在一些方面，本文提供了一种RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:19)；和多核苷酸序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:20)。
在一些方面，本文提供了一种RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGGGCGAACU AGUAUUCUUC UGGUCCCCAC AGACUCAGAG AGAACCCGCC ACCAUGAGAGUGAUGGCCCC CAGAACCCUG AUCCUGCUGC UGUCUGGCGC CCUGGCCCUG ACAGAGACAU GGGCCGGAAGCNAUCGUGGGA AUUGUGGCAG GACUGGCAGU GCUGGCCGUG GUGGUGAUCG GAGCCGUGGU GGCUACCGUGAUGUGCAGAC GGAAGUCCAG CGGAGGCAAG GGCGGCAGCU ACAGCCAGGC CGCCAGCUCU GAUAGCGCCCAGGGCAGCGA CGUGUCACUG ACAGCCUAGU AACUCGAGCU GGUACUGCAU GCACGCAAUG CUAGCUGCCCCUUUCCCGUC CUGGGUACCC CGAGUCUCCC CCGACCUCGG GUCCCAGGUA UGCUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCA CCUCUGCUAG UUCCAGACAC CUCCCAAGCA CGCAGCAAUG CAGCUCAAAA CGCUUAGCCUAGCCACACCC CCACGGGAAA CAGCAGUGAU UAACCUUUAG CAAUAAACGA AAGUUUAACU AAGCUAUACUAACCCCAGGG UUGGUCAAUU UCGUGCCAGC CACACCGAGA CCUGGUCCAG AGUCGCUAGC CGCGUCGCUAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA(SEQ ID NO:42)。
在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列；其中所述编码至少一个新表位的多核苷酸序列在SEQ ID NO:19的序列与SEQ ID NO:20的序列之间或在SEQ ID NO:42中标记为“N”的位置处。在一些实施例中，RNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，RNA分子在5'→3'方向上(例如，在SEQ IDNO:19的序列与SEQ ID NO:20的序列之间或在SEQ ID NO:42中标记为“N”的位置处)进一步包含：(a)至少第一连接基-新表位模块，其中所述至少第一连接基-新表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；以及(b)编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列。在一些实施例中，RNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且RNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，RNA分子进一步包含5'帽，其中5'帽位于序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:19)的5'末端。在一些实施例中，5'帽位于两个鸟嘌呤核苷酸之间。在一些实施例中，RNA分子进一步包含5'帽，其中5'帽位于SEQ ID NO:42的前2个G碱基之间(例如图4所示)。在一些实施例中，5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
Figure BDA0003642845070000111
在一些方面，本文提供了一种脂质体，该脂质体包含上述实施例中任一项所述的RNA分子(包括例如本文所述或序列表或附图中所述的RNA分子中的任一者)以及一种或多种脂质，其中所述一种或多种脂质形成包封RNA分子的多层结构。在一些实施例中，所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。在一些实施例中，所述一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。在一些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不低于1.0:2.0。在一些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不高于1.9:2.0。在一些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不低于1.0:2.0并且不高于1.9:2.0。
在一些方面，本文提供了一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，该方法包括向个体施用有效量的根据上述实施例中任一项所述的RNA分子(包括例如本文所述或序列表或附图中所述的RNA分子中的任一者)或根据上述实施例中任一项所述的脂质体。本文还提供了根据上述实施例中任一项所述的RNA分子或根据上述实施例中任一项所述的脂质体，其在治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法中使用，其中该方法包括向个体施用有效量的RNA分子或脂质体。本文还提供了根据上述实施例中任一项所述的RNA分子(包括例如本文所述或序列表或附图中所述的RNA分子中的任一者)或根据上述实施例中任一项所述的脂质体，其用于制造治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的药物。在一些实施例中，RNA分子包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，方法进一步包括向个体施用PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PDL1抗体)。在一些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌和头颈部癌。在一些实施例中，RNA分子或脂质体以约15μg、约25μg、约38μg、约50μg或约100μg的剂量施用。在一些实施例中，RNA分子或脂质体以约15μg、约25μg、约38μg、约50μg或约100μg的剂量施用，并且PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PDL1抗体)以约200mg或约1200mg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA分子或脂质体在8个21天周期中施用于个体，其中PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以以约200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。
在一些方面，本文提供了编码本文所述的RNA分子中任一者的DNA分子。在一些方面，本文提供了一种DNA分子，该DNA分子在5'→3'方向上包含：(1)编码5'非翻译区(UTR)的多核苷酸序列；(2)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(3)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(4)编码3'UTR的多核苷酸序列，该3'UTR包含：(a)***的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(5)编码poly(A)序列的多核苷酸序列。
在一些实施例中，DNA分子进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列；其中在5’→3’方向上，所述编码至少一个新表位的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列(例如，上述(2))与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(3))之间。在一些实施例中，DNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，DNA分子在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸连接基的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列；其中所述编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和所述编码新表位的多核苷酸序列形成第一连接基-新表位模块；并且其中在5’→3’方向上，形成第一连接基-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列(例如，上述(2))与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(3))之间。在一些实施例中，氨基酸连接基包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:39)。在一些实施例中，编码氨基酸连接基的多核苷酸序列包含序列GGCGGCTCTGGAGGAGGCGGCTCCGGAGGC(SEQID NO:38)。在一些实施例中，DNA分子在5’→3’方向上进一步包含：至少第二连接基-表位模块，其中所述至少第二连接基-表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在5’→3’方向上，形成第二连接基-新表位模块的多核苷酸序列在编码第一连接基-新表位模块的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(3))之间；并且其中第一连接基-表位模块的新表位不同于第二连接基-表位模块的新表位。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且DNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，DNA分子进一步包含编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列，其中编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(3))之间。在一些实施例中，编码5'UTR的多核苷酸(例如，上述(1))包含序列TTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:24)。在一些实施例中，编码5'UTR的多核苷酸(例如，上述(1))包含序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ IDNO:22)。在一些实施例中，分泌性信号肽(例如，由上述(2)编码)包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:27)。在一些实施例中，编码分泌性信号肽的多核苷酸序列(例如，上述(2))包含序列ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:26)。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分(例如，由上述(3)编码)包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:30)。在一些实施例中，编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列(例如，上述(3))包含序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCC(SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，编码AES mRNA的3'非翻译区的多核苷酸序列(例如，上述(4a))包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，编码线粒体编码的12S RNA的非编码RNA的多核苷酸(例如，上述(4b))包含序列CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:36)。在一些实施例中，编码3'UTR的多核苷酸(例如，上述(4))包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:32)。在一些实施例中，poly(A)序列(例如，上述(5))包含120个腺嘌呤核苷酸。
在一些方面，本文提供了一种DNA分子，该DNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:40)；和多核苷酸序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:41)。
在一些实施例中，DNA分子进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列；其中所述编码至少一个新表位的多核苷酸序列在SEQ ID NO:40的序列与SEQ ID NO:41的序列之间。在一些实施例中，DNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，DNA分子在5'→3'方向上在SEQ ID NO:40的序列与SEQ ID NO:41的序列之间包含：(a)至少第一连接基-新表位模块，其中所述至少第一连接基-新表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；以及(b)编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且DNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。
在一些方面，本文提供了一种产生RNA分子的方法，该方法包括转录根据上述实施例中任一项所述的DNA分子。
本发明涉及下述实施方案。
1.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗，其中所述RNA疫苗包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂为PD-1结合拮抗剂。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。
4.根据实施方案3所述的方法，其中所述抗PD-1抗体为纳武单抗或派姆单抗。
5.根据实施方案3或实施方案4所述的方法，其中所述抗PD-1抗体以约200mg的剂量施用于所述个体。
6.根据实施方案1所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂为PD-L1结合拮抗剂。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体为阿维单抗或德瓦鲁单抗。
9.根据实施方案7所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含：
(a)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含：HVR-H1，其包含GFTFSDSWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列；HVR-2，其包含AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；和HVR-3，其包含RHWPGGFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含：HVR-L1，其包含RASQDVSTAVA(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列；HVR-L2，其包含SASFLYS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和HVR-L3，其包含QQYLYHPAT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
10.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
11.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体为阿特珠单抗。
12.根据实施方案错误！未找到引用源。-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体以约1200mg的剂量施用于所述个体。
13.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂以21天或3周的间隔施用于所述个体。
14.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述RNA疫苗包含编码10-20个新表位的一种或多种多核苷酸，所述新表位由存在于所述肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
15.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述RNA疫苗配制成脂质体复合物纳米颗粒或脂质体。
16.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述RNA疫苗以约15μg、约25μg、约38μg、约50μg或约100μg的剂量施用于所述个体。
17.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述RNA疫苗以21天或3周的间隔施用于所述个体。
18.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂和所述RNA疫苗在8个21天周期中施用于所述个体，并且其中所述RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天施用于所述个体。
19.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂在第1周期至第8周期的第1天施用于所述个体。
20.根据实施方案错误！未找到引用源。或实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂和所述RNA疫苗在第8周期后进一步施用于所述个体。
21.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂和所述RNA疫苗在17个另外的21天周期中进一步施用于所述个体，其中所述PD-1轴结合拮抗剂在第13周期至第29周期的第1天施用于所述个体，并且其中所述RNA疫苗在第13周期、第21周期和第29周期的第1天施用于所述个体。
22.根据实施方案0所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂和所述RNA疫苗在8个21天周期中施用于所述个体，其中所述PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约200mg的剂量施用于所述个体，并且其中所述RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于所述个体。
23.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述RNA疫苗在第2周期的第1天以约25μg的剂量、在第2周期的第8天以约25μg的剂量、在第2周期的第15天以约25μg的剂量并且在第3周期至第7周期中每个周期的第1天以约25μg的剂量施用于所述个体。
24.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂和所述RNA疫苗经静脉内施用。
25.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述个体为人。
26.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌和头颈部癌。
27.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述癌症为黑色素瘤。
28.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述黑色素瘤为皮肤黑色素瘤或粘膜黑色素瘤。
29.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述黑色素瘤不是眼黑色素瘤或肢端黑色素瘤。
30.根据实施方案错误！未找到引用源。-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述黑色素瘤为转移性或不可切除的局部晚期黑色素瘤。
31.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述黑色素瘤为IV期黑色素瘤。
32.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述黑色素瘤为IIIC期或IIID期黑色素瘤。
33.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述黑色素瘤为既往未接受过治疗的晚期黑色素瘤。
34.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述方法使无进展存活(PFS)得到改善。
35.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述方法使客观应答率(ORR)得到提高。
36.一种试剂盒，其包括用于与RNA疫苗联合使用以依照根据实施方案1-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法治疗患有癌症的个体的PD-1轴结合拮抗剂。
37.一种在治疗患有癌症的人个体的方法中使用的PD-1轴结合拮抗剂，所述方法包括将有效量的所述PD-1轴结合拮抗剂与RNA疫苗联合施用于所述个体，其中所述RNA疫苗包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
38.一种在治疗患有癌症的人个体的方法中使用的RNA疫苗，所述方法包括将有效量的所述RNA疫苗与PD-1轴结合拮抗剂联合施用于所述个体，其中所述RNA疫苗包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
39.一种RNA分子，其在5'→3'方向上包含：
(1)5'帽；
(2)5'非翻译区(UTR)；
(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；
(4)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；
(5)3'UTR，其包含：
(a)***的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和
(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及
(6)poly(A)序列。
40.根据实施方案0所述的RNA分子，其进一步包含编码至少1个新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，所述编码至少1个新表位的多核苷酸序列在所述编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
41.根据实施方案0所述的RNA分子，其在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸连接基的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列；
其中所述编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和所述编码新表位的多核苷酸序列形成第一连接基-新表位模块；并且
其中在5'→3'方向上，形成所述第一连接基-新表位模块的所述多核苷酸序列在所述编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
42.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其中所述氨基酸连接基包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:39)。
43.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其中所述编码氨基酸连接基的多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ ID NO:37)。
44.根据实施方案错误！未找到引用源。-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其在5'→3'方向上进一步包含：至少第二连接基-表位模块，其中所述至少第二连接基-表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；
其中在5'→3'方向上，形成所述第二连接基-新表位模块的所述多核苷酸序列在编码所述第一连接基-新表位模块的所述新表位的所述多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间；并且
其中所述第一连接基-表位模块的所述新表位不同于所述第二连接基
-表位模块的所述新表位。
45.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其中所述RNA分子包含5个连接基-表位模块，并且其中所述5个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
46.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其中所述RNA分子包含10个连接基-表位模块，并且其中所述10个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
47.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其中所述RNA分子包含20个连接基-表位模块，并且其中所述20个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
48.根据实施方案错误！未找到引用源。-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其进一步包含编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列，其中所述编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
49.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，
其中所述5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
Figure BDA0003642845070000221
50.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述5'UTR包含序列UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:23)。
51.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述5'UTR包含序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:21)。
52.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述分泌性信号肽包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:27)。
53.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述编码分泌性信号肽的多核苷酸序列包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:25)。
54.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:30)。
55.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQID NO:28)。
56.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述AESmRNA的3'非翻译区包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ ID NO:33)。
57.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述线粒体编码的12S RNA的非编码RNA包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:35)。
58.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述3'UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:31)。
59.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其中所述poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。
60.一种RNA分子，其在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:19)；和多核苷酸序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:20)。
61.根据实施方案60所述的RNA分子，其在SEQ ID NO:19的序列与SEQ ID NO:20的序列之间进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列。
62.根据实施方案60所述的RNA分子，其在5'→3'方向上在SEQ ID NO:19的序列与SEQ ID NO:20的序列之间进一步包含：
(a)至少第一连接基-新表位模块，其中所述至少第一连接基-新表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；以及
(b)编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列。
63.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其包含5个连接基-表位模块，其中所述5个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
64.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其包含10个连接基-表位模块，其中所述10个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
65.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其包含20个连接基-表位模块，其中所述20个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
66.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子，其进一步包含5'帽，其中所述5'帽位于序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:19)的5'末端。
67.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的RNA分子，其中所述5'
帽包含以下结构的D1非对映异构体：
Figure BDA0003642845070000261
68.一种脂质体，其包含根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子以及一种或多种脂质，其中所述一种或多种脂质形成包封所述RNA分子的多层结构。
69.根据实施方案0所述的脂质体，其中所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。
70.根据实施方案0所述的脂质体，其中所述一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
71.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的脂质体，其中在生理pH，所述脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。
72.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子或根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的脂质体。
73.根据实施方案0所述的方法，其中所述RNA分子包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
74.根据实施方案0或实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其进一步包含向所述个体施用PD-1轴结合拮抗剂。
75.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌和头颈部癌。
76.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子或根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的脂质体，其在治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法中使用。
77.一种DNA分子，其在5'→3'方向上包含：
(1)编码5'非翻译区(UTR)的多核苷酸序列；
(2)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；
(3)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；
(4)编码3'UTR的多核苷酸序列，所述3'UTR包含：
(a)***的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和
(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及
(5)编码poly(A)序列的多核苷酸序列。
78.根据实施方案0所述的DNA分子，其进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列，其中在5'→3'方向上，所述编码至少一个新表位的多核苷酸序列在所述编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
79.根据实施方案0所述的DNA分子，其在5'→3'方向上进一步包含：
编码氨基酸连接基的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列；
其中所述编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和所述编码新表位的多核苷酸序列形成第一连接基-新表位模块；并且
其中在5'→3'方向上，形成所述第一连接基-新表位模块的所述多核苷酸序列在所述编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
80.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其中所述氨基酸连接基包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:39)。
81.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其中所述编码氨基酸连接基的多核苷酸序列包含序列GGCGGCTCTGGAGGAGGCGGCTCCGGAGGC(SEQ ID NO:38)。
82.根据实施方案错误！未找到引用源。-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其在5'→3'方向上进一步包含：至少第二连接基-表位模块，其中所述至少第二连接基-表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；
其中在5'→3'方向上，形成所述第二连接基-新表位模块的所述多核苷酸序列在编码所述第一连接基-新表位模块的所述新表位的所述多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间；并且
其中所述第一连接基-表位模块的所述新表位不同于所述第二连接基
-表位模块的所述新表位。
83.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其中所述DNA分子包含5个连接基-表位模块，并且其中所述5个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
84.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其中所述DNA分子包含10个连接基-表位模块，并且其中所述10个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
85.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其中所述DNA分子包含20个连接基-表位模块，并且其中所述20个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
86.根据实施方案错误！未找到引用源。-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其进一步包含编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列，其中所述编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
87.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中编码所述5'UTR的所述多核苷酸包含序列TTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:24)。
88.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中编码所述5'UTR的所述多核苷酸包含序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:22)。
89.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述分泌性信号肽包含氨基酸序列
MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:27)。
90.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述编码分泌性信号肽的多核苷酸序列包含序列ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:26)。
91.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:30)。
92.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列包含序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCC(SEQID NO:29)。
93.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述编码AES mRNA的3'非翻译区的多核苷酸序列包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC(SEQ ID NO:34)。
94.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述编码线粒体编码的12S RNA的非编码RNA的多核苷酸包含序列CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:36)。
95.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述编码3'UTR的多核苷酸包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:32)。
96.根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子，其中所述poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。
97.一种DNA分子，其在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:40)；和多核苷酸序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:41)。
98.根据实施方案0所述的DNA分子，其在5'→3'方向上在SEQ ID NO:40的序列与SEQ ID NO:41的序列之间进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列。
99.根据实施方案0所述的DNA分子，其在5'→3'方向上在SEQ ID NO:40的序列与SEQ ID NO:41的序列之间进一步包含：
(a)至少第一连接基-新表位模块，其中所述至少第一连接基-新表位模块包含编码氨基酸连接基的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；以及
(b)编码氨基酸连接基的第二多核苷酸序列。
100.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其包含5个连接基-表位模块，其中所述5个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
101.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其包含10个连接基-表位模块，其中所述10个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
102.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的DNA分子，其包含20个连接基-表位模块，其中所述20个连接基-表位模块各自编码不同的新表位。
103.一种产生RNA分子的方法，所述方法包括转录根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的DNA分子。
104.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括依照根据实施方案1-错误！未找到引用源。中任一项所述的方法向所述个体施用根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子或根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的脂质体。
105.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括将根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的RNA分子或根据实施方案0-错误！未找到引用源。中任一项所述的脂质体与PD-1轴结合拮抗剂联合施用于所述个体。
106.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述RNA分子或脂质体以约15μg、约25μg、约38μg、约50μg或约100μg的剂量施用于所述个体，并且其中所述PD-1轴结合拮抗剂以约200mg或约1200mg的剂量施用于所述个体。
107.根据实施方案错误！未找到引用源。或实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述RNA分子或脂质体和所述PD-1轴结合拮抗剂在8个21天周期中施用于所述个体。
108.根据实施方案错误！未找到引用源。所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约200mg的剂量施用于所述个体，并且其中所述RNA分子或脂质体在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于所述个体。
应了解，本文所描述的各种实施例的一种、一些或所有特性可组合形成本发明的其它实施例。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员将变得显而易见。通过下面的详细描述进一步描述本发明的这些和其它实施例。
附图说明
专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。
图1显示了II期、随机、开放标签研究的研究方案，其涉及为评估基于RNA个体化癌症疫苗(R07198457)加抗PD1抗体(派姆单抗)的疗效和安全性。在随机分组阶段，患者随机(2:1)接受试验治疗(B组)或对照治疗(A组)。IMC＝内部监查委员会；LDH＝乳酸脱氢酶；Q3W＝每3周；TBD＝待定；ULN＝正常上限。
图2显示了II期研究的A组(派姆单抗)安全性导入期和B组(R07198457加派姆单抗)的给药方案。C＝周期；D＝天。
图3显示了示例性RNA疫苗(即多新表位RNA)的一般结构。该图为具有恒定5'-帽(β-S-ARCA(D1))、5'-非翻译区和3'-非翻译区(分别为hAg-Kozak和FI)、N-末端和C-末端融合标签(分别为sec2.0和MITD)和poly(A)尾巴(A120)以及编码通过富含GS的连接基融合的新表位(neo1至neo10)的患者特异性序列。
图4为示例性RNA疫苗(SEQ ID NO:42)的恒定区的核糖核苷酸序列(5'->3')。前两个G残基之间的键为独特的键(5'→5')-ppsp-，如表5和图5中的5'加帽结构所示。患者癌症特异性序列的在C131与A132残基(以粗体标记)。“N”是指编码一个或多个(例如，1-20个)新表位(由任选的连接基隔开)的一个或多个多核苷酸序列的位置。
图5为用于RNA恒定区的5'末端的5'-加帽结构β-S-ARCA(D1)(m2 7·2'·OGppspG)。立体P中心为“D1”异构体中的Rp构型。注：红色示出β-S-ARCA(D1)与碱性帽结构m7GpppG之间的差异；结构单元m7G的C2'位置处的-OCH3基团和β-磷酸酯处的非桥接氧被硫取代。由于存在立体P中心(带有*标记)，硫代磷酸酯帽类似物β-S-ARCA以两种非对映异构体形式存在。根据它们在反相高效液相色谱中的洗脱顺序，将其称为01和02。
具体实施方式
I.定义
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定的组合物或生物学***，这些组合物或生物学***当然可以变化。另外应当了解，本文使用的术语只是为了描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。
如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，对“分子”的提及任选地包括两个或更多此类分子的组合等。
如本文所用的术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。
应当理解，本文所述的发明的方面和实施例包括“包含”、“由以下组成”及“基本上由以下组成”所指的方面和实施例。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指抑制PD-1轴结合配偶体与其一个或多个结合配偶体的相互作用的分子，以消除由PD-1信号传导轴上的信号传导引起的T细胞功能障碍，其结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-L1、PD-L2)相互作用产生的信号传导的分子。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其一个或多个结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及其它减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用产生的信号传导的分子。在一个实施例中，PD-1结合拮抗剂可减少由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-1的信号传导所介导的或通过其的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的应答)。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。下文提供了PD-1结合拮抗剂的具体实例。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1、B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1至PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1、B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个实施例中，PD-L1结合拮抗剂可减少由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L1的信号传导所介导的或通过其的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的应答)。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。下文提供了PD-L1结合拮抗剂的具体实例。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1)的相互作用产生的信号传导的分子。在一些实施例中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其一个或多个结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。在一些实施例中，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体，其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或多个结合配偶体(诸如PD-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一个实施例中，PD-L2结合拮抗剂可减少由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L2的信号传导所介导的或通过其的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的应答)。在一些实施例中，PD-L2结合拮抗剂为免疫粘附素。
“持续缓解”是指停止治疗后减少肿瘤生长的持续作用。例如，与给药阶段开始时的大小相比，肿瘤大小可以保持相同或更小。在一些实施例中，持续应答的持续时间至少与治疗持续时间相同、至少为治疗持续时间的1.5倍、2.0倍、2.5倍或3.0倍长度。
术语“药物制剂”是指处于允许活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对于将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制备物。此类制剂为无菌制剂。“药学上可接受的”赋形剂(载体、添加剂)是指可合理地施用于哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂。
如本文所用，术语“治疗”是指被设计为在临床病理过程中改变被治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。理想的治疗效果包括降低疾病进展速度、减缓或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与癌症有关的一种或多种症状，包括但不限于减少癌细胞的增殖(或破坏)、减轻疾病所致的症状、提高患有该疾病的人的生活质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量和/或延长个体的存活，则成功地“治疗”了个体。
如本文所用，“延缓疾病的进展”意指延缓、阻碍、减缓、迟滞、稳定和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或待治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患该病。例如，晚期癌症，诸如转移的发展，可能被延迟。
“有效量”至少是实现可测量的改善或预防特定病症所需的最小量。本文的有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引起预期应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防用途、有益或预期结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重程度或延缓疾病发作，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症以及在疾病发展过程中出现的中间病理表型。对于治疗用途、有益或预期结果包括临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患病者的生活质量、减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量、增强其他药物的效果(诸如通过靶向、延缓疾病进展和/或延长存活)。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可能减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即在某种程度上减慢或预期停止)癌细胞浸润进入周围器官中；抑制(即在某种程度上减慢并预期停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤的生长；以及/或在某种程度上减轻与病症有关的一种或多种症状。有效量可以一次或多次施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量为足以直接或间接地进行预防或治疗的量。如在临床背景中所理解的，与另一药物、化合物或药物组合物结合可以达到或不能达到有效量的药物、化合物或药物组合物。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他试剂结合可以获得或实现预期结果，则可以考虑给予有效量的单一药剂。
如本文所用，“与……结合”或“与……联合”是指在一种治疗方式以外还施用另一种治疗方式。因此，“与……结合”或“与……联合”是指在向个体施用一种治疗方式之前、期间或之后施用另一种治疗方式。
“病症”是将从治疗获益的任何病状，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所述病症的病理性病状。
术语“细胞增殖性疾病”和“增殖性疾病”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施例中，所述细胞增殖性病症为癌症。在一个实施例中，所述细胞增殖性病症为肿瘤。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有前癌性和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性疾病”、“增生性疾病”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。
用于治疗目的的“受试者”或“个体”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物，诸如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“经分离的”抗体是已经鉴定并且自其自然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是会干扰抗体研究、诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将抗体纯化至(1)大于抗体重量的95％(例如通过Lowry方法测定)，在一些实施例中，大于99％重量；(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度(例如通过使用旋转杯测序仪)，或(3)均质(在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE，使用例如考马斯蓝或银染)。经分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不会存在抗体天然环境的至少一种成分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一末端具有可变结构域(VH)，其后是多个恒定结构域。每条轻链在一末端(VL)具有可变结构域，在另一末端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，该部分相对于免疫球蛋白的另一部分(即可变结构域，其包含抗原结合位点)具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。轻链的可变结构域可称为“VL”。这些结构域通常是抗体中变化最大的部分，并且包含抗原结合位点。
术语“可变的”是指以下事实：可变结构域的某些部分在抗体之间的序列差异很大，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的可变结构域中均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域中保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其主要采用β折叠结构，由三个HVR连接，这三个HVR形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧密保持在一起，并且与另一条链中的HVR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各自效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用。
来自任何哺乳动物物种抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明显不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”)。
如本文所用，术语IgG“同种型”或“亚类”是指由免疫球蛋白恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分为不同的类别。免疫球蛋白主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并在例如以下文献中有一般描述：Abbas等人，《细胞和分子免疫学》(Cellularand Mol.Immunology)，第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是较大融合分子的一部分，该融合分子是通过抗体与一个或多个其它蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指其基本上完整形式的抗体而不是如下文定义的抗体片段。该术语特别是指具有包含Fc区的重链的抗体。
出于本文目的的“裸抗体”是未与药物部分或放射性标记缀合的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施例中，本文所述的抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其是否容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab')2片段具有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交联。
“Fv”是包含完全的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由紧密和非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可缔合成类似于在双链Fv物种中的“二聚体”结构。以此构型，每个可变结构域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个HVR共同对抗体赋予抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。
“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域且亦含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生的。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般地，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，使scFv形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，参见例如Pluckthun的《单克隆抗体的药理学》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore主编，(Springer-Verlag,New York,1994)，第269-315页。
术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，其片段包含连接至与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体可为二价抗体或双特异性抗体。双体抗体更全面地描述于例如：EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，例如，除了可能存在的少量突变例如天然存在的突变，该抗体群包含的单个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆的”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施例中，这样的单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的过程获得。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变选择的靶标结合序列，例如，用以提高对靶标的亲和力、用以使靶标结合序列人源化、用以提高其在细胞培养物中的产生、用以降低其在体内的免疫原性、用以产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体制剂的优势还在于其通常不受其他免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995)，Harlow等人，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))和在动物中产生具有编码人类免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的人类抗体或类人类抗体的技术(参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可(参见例如美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
Figure BDA0003642845070000421
抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过例如用目标抗原免疫猕猴产生的抗体。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体为包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体HVR的残基被来自非人类物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人灵长类动物的HVR的残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的FR残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能。总体上，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该免疫球蛋白通常为人类免疫球蛋白。更多详情参见例如Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。另见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制得的抗体。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，227:381(1991)；Marks等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，222:581(1991)。还可用于制备人类单克隆抗体的方法如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)所述。另参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过向转基因动物施用抗原来制备人抗体，该转基因动物已经修饰以对抗原攻击产生应答而产生此类抗体，但其内源基因座已失效，例如，免疫异种小鼠(参见例如，有关XENOMOUSETM技术的美国专利No.6,075,181和6,150,584)。另参见，例如，Li等人，Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)关于通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体。
“物种依赖性抗体”是对来自第一哺乳动物物种的抗原具有比对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物更强的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体与人抗原“特异性结合”(例如，其结合亲和力(Kd)值不超过约1×10-7M，优选不超过约1×10-8M，优选不超过约1×10-9M)，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力比其对该人抗原的结合亲和力弱至少约50倍或至少约500倍或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上定义的各种抗体中的任何一种，但是优选地是人源化或人抗体。
如本文所用的术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指在序列上高变和/或形成结构上限定的环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3在六个HVR中表现出最多的多样性，尤其是H3被认为在赋予抗体精细特异性方面起着独特的作用。参见例如：Xu等人，Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu，Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,N.J.,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼科动物抗体在不存在轻链的情况下是有功能并稳定的。参见例如：Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描述得到应用，并且包含于本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991))。相反，Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并且被牛津分子公司(Oxford Molecular)的AbM抗体建模软件采用。“接触”HVR基于可用的复杂晶体结构的分析结果。这些HVR中的每个的残基如下文所述。
Figure BDA0003642845070000441
HVR可以包括以下“扩展HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基均根据上述Kabat等人的方法进行编号。
HVR可以包括以下“扩展HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基均根据上述Kabat等人的方法进行编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
术语“Kabat所述的可变结构域残基编号”或“Kabat所述的氨基酸位置编号”及其变型是指在上述Kabat等人的文献中提出的用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际线性氨基酸序列可能包含较少或附加的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变结构域可在H2的残基52之后包括单个氨基酸***片段(根据Kabat编号的残基52a)以及重链FR残基82之后的***残基(例如，根据Kabat编号的残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
当提及可变结构域中的残基(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号***(例如，Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)。第5版，美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号***”或“EU索引”(例如，上述Kabat等人所报道的EU索引)。“Kabat所述的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。
表述“线性抗体”是指Zapata等人在(1995Protein Eng,8(10):1057-1062)中所述的抗体。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以为双特异性或单特异性的。
如本文所用，术语“结合”、“特异性结合”或“具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶与抗体之间的结合，在存在分子(包括生物分子)的异质群体的存在下，其确定靶的存在。例如，与靶标(其可以是表位)结合或特异性结合的抗体是与其结合其他靶标相比具有更大亲和力、亲合力、更容易和/或持续时间更长的结合该靶标的抗体。在一个实施例中，抗体与无关靶标的结合程度为该抗体与抗原结合的小于约10％，例如，通过放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施例中，与靶标特异性结合的抗体的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。在某些实施例中，抗体与蛋白上的表位特异性结合，该表位在不同物种的蛋白之间具有保守性。在另一实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。
如本文所用，术语“样品”是指获自或衍生自目的受试者和/或个体的组合物，其包含例如待基于物理、生化、化学和/或生理特征进行表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变型是指从目的受试者获得的任何样品，其预期或已知包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解液、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、***、***、羊水、乳汁、全血、血液来源的细胞、尿液、脑脊液、唾液、痰、眼泪、汗液、粘液、肿瘤溶解产物和组织培养基、组织提取物诸如均质化的组织、肿瘤组织、细胞提取物及其组合。在一些实施例中，样品是从个体的癌症获得的样品(例如，肿瘤样品)，其包含肿瘤细胞并且任选地包含肿瘤浸润免疫细胞。例如，样品可为包埋在石蜡块中的肿瘤标本，或者包括新鲜切割的、连续未染色的切片。在一些实施例中，样品来自活检，并且包括50个或更多活肿瘤细胞(例如，来自芯针活检并且任选地包埋于石蜡块中；切除、切口、穿孔或活检钳活检；或肿瘤组织切除)。
“组织样品”或“细胞样品”是指从受试者或个体的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官、组织样品、活组织检查和/或吸出物的实体组织；血液或任何血液成分，例如血浆；体液，例如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液；受试者妊娠或发育中任何时候的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。可选地，组织或细胞样品获自疾病组织/器官。组织样品可以包含在自然环境天然不与组织混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。
如本文所用，“参考样本”、“参考细胞”、“参考组织”、“对照样本”、“对照细胞”或“对照组织”是指用于比较目的的样本、细胞、组织、标准品或水平。在一个实施例中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织获自同一受试者或个体身体的健康和/或未患病的部位(例如，组织或细胞)。例如，邻近患病细胞或组织的健康和/或未患病的细胞或组织(例如，邻近肿瘤的细胞或组织)。在另一实施例中，参考样品获自相同受试者或个体的身体的未经处理的组织和/或细胞。在又一个实施例中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织获自不是该受试者或个体的个体身体的健康和/或未患病的部分(例如，组织或细胞)。在再一实施例中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是所述受试者或个体的个体的身体部分的未经处理的组织和/或细胞。
患者对药物和治疗的“有效响应”或患者的“响应性”和类似措词是指赋予处于患疾病或病症诸如癌症的风险下或患有该疾病或病症的患者的临床或治疗有益效果。在一个实施例中，这种益处包括以下一个或多个：延长存活(包括总存活和无进展存活)；导致客观应答(包括完全应答或部分应答)；或改善癌症的体征或症状。
对治疗“没有有效响应”的患者是指没有以下任一项的患者：延长存活(包括总存活和无进展存活)；导致客观响应(包括完全响应或部分响应)；或改善癌症的征兆或症状。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可使用例如本文定义中所公开的各种测定方法进行评估。
“具有人效应细胞”的癌症或生物样本是，在诊断测试中，样本中存在人效应细胞(例如，浸润的人效应细胞)的癌症或生物样本。
“具有表达FcR的细胞”的癌症或生物学样本是，在诊断测试中，样本中存在表达FcR的细胞(例如，浸润的表达FcR的细胞)的癌症或生物样本。在一些实施例中，FcR是FcγR。在一些实施例中，FcR是活化FcγR。
Ⅱ.概述
本文提供了一种用于治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，该方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)和RNA疫苗。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于癌症中(例如存在于从个体获得的肿瘤标本中)的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，个体是人。
在一些实施例中，本文提供了一种用于治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，该方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)和RNA疫苗，其中RNA疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位基于存在于从个体获得的肿瘤样品中的体细胞突变进行鉴别。在一些实施例中，本文提供了一种用于治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，该方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)和RNA疫苗，其中RNA疫苗包含一种或多种编码一个或多个新表位的多核苷酸，所述一个或多个新表位对应于存在于从个体获得的肿瘤样品中的体细胞突变。
在一些实施例中，与包含在不存在RNA疫苗的情况下施用PD-1轴结合拮抗剂的治疗相比，该治疗延长了个体的无进展存活(PFS)和/或总存活(OS)。在一些实施例中，与包含在不存在RNA疫苗的情况下施用PD-1轴结合拮抗剂的治疗相比，该治疗改善了总缓解率(ORR)。在一些实施例中，ORR是指发生完全缓解(CR)或部分缓解(PR)的患者比例。在一些实施例中，与包含在不存在RNA疫苗的情况下施用PD-1轴结合拮抗剂的治疗相比，该治疗延长了缓解持续时间(DOR)。在一些实施例中，与包含在不存在RNA疫苗的情况下施用PD-1轴结合拮抗剂的治疗相比，该治疗改善了个体的健康相关生活质量(HRQoL)得分。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂以21天或3周的间隔施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，派姆单抗)，以21天或3周的间隔例如以约200mg的剂量施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)，以21天或3周的间隔例如以约1200mg的剂量施用于个体。
在一些实施例中，RNA疫苗以21天或3周的间隔施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂在第1周期至第8周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天施用于个体，并且PD-1轴结合拮抗剂在第1周期至第8周期的第1天施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在第8周期后进一步施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在17个另外的21天周期进一步施用于个体，其中PD-1轴结合拮抗剂在第13周期至第29周期的第1天施用于个体，并且/或者其中RNA疫苗在第13周期、第21周期和第29周期的第1天施用于个体。
在某些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，其中PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。在某些实施例中，PD-L1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，其中PD-L1轴结合拮抗剂为阿特珠单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约1200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天以约25μg的剂量、在第2周期的第8天以约25μg的剂量、在第2周期的第15天以约25μg的剂量并且在第3周期至第7周期中每个周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体(也就是说，在第2周期内以3剂总共向个体施用约75μg疫苗)。在一些实施例中，在施用RNA疫苗的第一周期内，以3剂总共向个体施用约75μg疫苗。在一些实施例中，PCV以15μg、25μg、38μg、50μg或100μg的剂量经静脉内施用(例如，以脂质体制剂的形式)。在一些实施例中，每剂递送15μg、25μg、38μg、50μg或100μg RNA(即，剂量重量反映施用的RNA的重量而非施用的制剂或脂质体复合物的总重量)。
III.RNA疫苗
本公开的某些方面涉及个体化癌症疫苗(PCV)。在一些实施例中，PCV为RNA疫苗。示例性RNA疫苗的特征如下文所述。在一些实施例中，本公开提供了一种RNA多核苷酸，其包含下文描述的RNA疫苗的特征/序列中的一种或多种。在一些实施例中，RNA多核苷酸为单链mRNA多核苷酸。在其他实施例中，本公开提供了一种编码RNA的DNA多核苷酸，该RNA包含下文描述的RNA疫苗的特征/序列中的一种或多种。
个体化癌症疫苗包含个体化新抗原(即在患者癌症中特异性表达的肿瘤相关抗原(TAA))，这些个体化新抗原经鉴定具有潜在的免疫刺激活性。在本文所述的实施例中，PCV为核酸，例如信使RNA。因此，不受理论的约束，据信在施用后，个体化癌症疫苗被吸收并且由抗原呈递细胞(APC)翻译，并且所表达的蛋白质经由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递在APC的表面上。由此诱导针对表达TAA的癌症细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和记忆T细胞依赖性免疫反应两者。
PCV通常包括多个新抗原表位(“新表位”)，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个新表位或者至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个新表位，任选地在各个新表位之间具有连接基序列。在一些实施例中，如本文所用的新表位是指对患者的癌症具有特异性但不存在于患者的正常细胞中的新颖表位。在一些实施例中，新表位在结合至MHC时呈递给T细胞。在一些实施例中，PCV还包括5'mRNA帽类似物、5'UTR、信号序列、促进抗原表达的结构域、3'UTR和/或polyA尾巴。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码10-20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码至少5个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码5-20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码5-10个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
在一些实施例中，本公开的RNA疫苗的制造为多步过程，其中通过二代测序(NGS)鉴定患者肿瘤中的体细胞突变并且预测免疫原性新抗原表位(或“新表位”)。靶向选定新表位的RNA癌症疫苗按患者进行生产。在一些实施例中，疫苗为基于RNA的癌症疫苗，其由多达两个信使RNA分子组成，每个分子编码多达10个新表位(总共编码多达20个新表位)，这些新表位对患者的肿瘤具有特异性。
在一些实施例中，所表达的非同义突变通过肿瘤DNA和外周血单核细胞(PBMC)DNA(作为患者的健康组织来源)的全外显子组测序(WES)以及肿瘤RNA测序(用于评估表达)进行鉴定。根据所得突变蛋白质的列表，使用生物信息学工作流程预测潜在的新抗原，该工作流程基于多种因素对这些抗原可能具有的免疫原性进行排序，这些因素包括所预测的表位与个体主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合亲和力以及相关RNA的表达水平。突变发现、优先级排序和确认过程得到一个数据库的补充，该数据库提供了有关健康组织中相应野生型基因的表达水平的综合信息。这些信息使得能够通过去除具有不利风险特征的候选目标来制定个体化风险缓解策略。滤除蛋白质发生的可能在关键器官中具有较高自身免疫风险的突变，并且不考虑将其用于疫苗生产。在一些实施例中，选择经预测对个体患者分别引起CD8+T细胞和/或CD4+T细胞应答的多达20个MHCI和MHCII新表位纳入疫苗中。预期针对多个新表位进行疫苗接种将增加对PCV的总体免疫应答的广度和强度，并且可能有助于降低免疫逃逸的风险，该风险可能发生于肿瘤暴露于有效免疫应答的选择压力的情况下(Tran E,Robbins PF,Lu YC等人,N Engl J Med 2016；375:2255-62；Verdegaal EM,deMiranda NF,Visser M等人,Nature 2016；536:91-5)。
在一些实施例中，RNA疫苗包含一个或多个编码氨基酸连接基的多核苷酸序列。例如，可在2个患者特异性新表位序列之间、患者特异性新表位序列与融合蛋白标签(例如，包含来源于MHC复合物多肽的序列)之间或分泌性信号肽与患者特异性新表位序列之间使用氨基酸连接基。在一些实施例中，RNA疫苗编码多种连接基。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码5-20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生，并且编码每个表位的多核苷酸由编码连接基序列的多核苷酸隔开。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码5-10个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生，并且编码每个表位的多核苷酸由编码连接基序列的多核苷酸隔开。在一些实施例中，编码连接基序列的多核苷酸还存在于编码N末端融合标签(例如，分泌性信号肽)的多核苷酸与编码新表位中的一个的多核苷酸之间，和/或存在于编码新表位中的一个或多个的多核苷酸与编码C末端融合标签(例如，包含MHC多肽的一部分)的多核苷酸之间。在一些实施例中，由RNA疫苗编码等两种或更多种连接基包含不同的序列。在一些实施例中，RNA疫苗编码多种连接基，其全部共享相同的氨基酸序列。
各种连接基序列是本领域中已知的。在一些实施例中，连接基为柔性连接基。在一些实施例中，连接基包含G、S、A和/或T残基。在一些实施例中，连接基由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施例中，连接基的长度在约5个氨基酸与20个氨基酸之间或在约5个氨基酸与12氨基酸之间，例如长度为约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸或约20个氨基酸。在一些实施例中，连接基包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:39)。在一些实施例中，RNA疫苗的连接基包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ ID NO:37)。在一些实施例中，RNA疫苗的连接基由包含序列GGCGGCTCTGGAGGAGGCGGCTCCGGAGGC(SEQ ID NO:38)的DNA编码。
在一些实施例中，RNA疫苗包含5'帽。已知mRNA帽结构包含2个核苷酸(例如，两个鸟嘌呤)与远处鸟嘌呤上的7-甲基基团之间的5'-5'三磷酸酯键，即m7GpppG。示例性帽结构可参见例如美国专利号8,153,773和9,295,717以及Kuhn,A.N.等人(2010)Gene Ther.17:961-971。在一些实施例中，5'帽具有结构m2 7,2'-OGppspG。在一些实施例中，5'帽为β-S-ARCA帽。S-ARCA帽结构包括2'-O甲基取代(例如，在m7G的C2'位置)和一个或多个磷酸酯基团处的S-取代。在一些实施例中，5'帽包含以下结构：
Figure BDA0003642845070000531
在一些实施例中，5'帽为β-S-ARCA的D1非对映异构体(参见例如美国专利号9,295,717)。上述结构中的*表示立体P中心，其可能存在于两种非对映异构体(称为D1和D2)中。β-S-ARCA的D1非对映异构体或β-S-ARCA(D1)为β-S-ARCA的非对映异构体，与β-S-ARCA的D2非对映异构体(β-S-ARCA(D2))相比，在HPLC色谱柱上首先洗脱，并由此表现出较短的保留时间。HPLC优选为分析型HPLC。在一个实施例中，利用Supelcosil LC-18-T RP色谱柱(优选以下规格：5μm，4.6×250mm)进行分离，其中可采用流速1.3mL/min。在一个实施例中，利用乙酸铵中的甲醇梯度，例如在15min内，0.05M乙酸铵溶液(pH＝5.9)中的甲醇以线性梯度从0％增加至25％。可在260nm下进行UV检测(VWD)，并且可采用280nm的激发波长和337nm的检测波长进行荧光检测(FLD)。
在一些实施例中，RNA疫苗包含5'UTR。研究表明，存在于mRNA中的蛋白质编码序列的5'末端的某些非翻译序列可提高翻译效率。参见例如Kozak,M.(1987)J.Mol.Biol.196:947-950。在一些实施例中，5'UTR包含来自人α球蛋白mRNA的序列。在一些实施例中，RNA疫苗包含UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:23)的5'UTR序列。在一些实施例中，RNA疫苗的5'UTR序列由包含序列TTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:24)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗的5'UTR序列包含序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:21)。在一些实施例中，RNA疫苗的5'UTR序列由包含序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:22)的DNA编码。
在一些实施例中，RNA疫苗包含编码分泌性信号肽的多核苷酸序列。如本领域已知的，分泌性信号肽是一种氨基酸序列，在翻译后引导多肽从内质网中转运出并且进入分泌途径。在一些实施例中，信号肽源自一种人多肽，诸如MHC多肽。参见例如Kreiter,S.等人(2008)J.Immunol.180:309-318，其中描述了一种示例性分泌性信号肽，该分泌性信号肽改善了人类树突细胞中MHC I类和II类表位的加工和呈递。在一些实施例中，在翻译后，信号肽为RNA疫苗编码的一个或多个新表位序列的N末端。在一些实施例中，分泌性信号肽包含序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:27)。在一些实施例中，RNA疫苗的分泌性信号肽包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:25)。在一些实施例中，RNA疫苗的分泌性信号肽由包含序列ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:26)的DNA编码。
在一些实施例中，RNA疫苗包含编码跨膜和/或胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列。在一些实施例中，跨膜和/或胞质结构域来自MHC分子的跨膜/胞质结构域。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”是指一种存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子在正常免疫应答中淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的信号传导中的功能涉及它们结合肽并且将其呈递以便由T细胞受体(TCR)进行识别。MHC分子在细胞内加工区室中结合肽，并且将抗原呈递细胞表面上的这些肽呈递给T细胞。人类MHC区，也称为HLA，位于6号染色体上，并且包含I类区和II类区。I类α链为分子量约44kDa的糖蛋白。多肽链的长度略多于350个氨基酸残基。它可分为三个功能区：外部区、跨膜区和胞质区。外部区的长度为283个氨基酸残基，并且分为三个结构域，即α1、α2和α3。这些结构域和区通常由I类基因的单独的外显子编码。跨膜区横跨质膜的脂质双层。它由23个通常疏水的氨基酸残基组成，这些氨基酸残基排列成α螺旋形式。胞质区，即朝向细胞质并且与跨膜区连接的部分，其长度通常为32个氨基酸残基，并且能够与细胞骨架的元件相互作用。α链与β2-微球蛋白相互作用，由此在细胞表面上形成α-β2二聚体。术语“MHC II类”或“II类”是指主要组织相容性复合物II类蛋白质或基因。在人类MHC II类区内，存在II类α链基因和β链基因的DP、DQ和DR亚区(即DPα、DPβ、DQα、DQβ、DRα和DRβ)。II类分子为各自由α链和β链组成的异二聚体。两条链为具有31-34kDa(a)或26-29kDA(β)的分子量的糖蛋白。α链的总长度在229个残基与233个残基之间变化，并且β链的总长度为225个残基至238个残基。α链和β链均由外部区、连接肽、跨膜区和胞质尾区组成。外部区由两个结构域(即α1和α2或β1和β2)组成。连接肽在α链和β链中分别为β和9个残基长。它将两个结构域连接至跨膜区，该跨膜区在α链和β链中均由23个氨基酸残基组成。胞质区(即朝向细胞质并且与跨膜区连接的部分)的α链长度在3个残基至16个残基之间变化，β链长度在8个残基至20个残基之间变化。示例性跨膜/胞质结构域序列描述于美国专利号8,178,653和8,637,006中。在一些实施例中，在翻译后，跨膜和/或胞质结构域为RNA疫苗编码的一个或多个新表位序列的C末端。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和/或胞质结构域由包含序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:30)的RNA疫苗编码。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和/或胞质结构域包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:28)。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和/或胞质结构域由包含序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCC(SEQ ID NO:29)的DNA编码。
在一些实施例中，RNA疫苗包含编码位于一个或多个新表位序列的N末端的分泌性信号肽的多核苷酸序列以及编码位于一个或多个新表位序列的C末端的跨膜和/或胞质结构域的多核苷酸序列。研究表明，将此类序列组合可改善人类树突细胞中MHC I类和II类表位的加工和呈递。参见例如Kreiter,S.等人(2008)J.Immunol.180:309-318。
在骨髓DC中，RNA释放到细胞溶质中并且翻译为多新表位肽。多肽包含额外的序列以增强抗原呈递。在一些实施例中，利用来自多肽的N-末端的MHCI重链的信号序列(sec)将新生分子靶向内质网，已表明这种做法可提高MHCI呈递效率。不受理论的约束，据信MHCI重链的跨膜和胞质结构域将多肽引导至表现出改善的MHCII呈递的内体/溶酶体区室。
在一些实施例中，RNA疫苗包含3'UTR。研究表明，存在于mRNA中的蛋白质编码序列的3'末端的某些非翻译序列可改善RNA稳定性、翻译和蛋白质表达。适合用作3'UTR的多核苷酸序列描述于例如PG公开号US20190071682中。在一些实施例中，3'UTR包含AES的3'非翻译区或其片段和/或线粒体编码的12S RNA的非编码RNA。术语“AES”是指***的氨基末端增强子并且包括AES基因(参见例如NCBI基因ID：166)。由该基因编码的蛋白质属于groucho/TLE蛋白质家族，其可作为同源寡聚体或与其他家族成员形成异源寡聚体以显性抑制其他家族成员基因的表达。一种示例性AES mRNA序列提供于NCBI参考序列登录号NM_198969中。术语“MT_RNR1”是指线粒体编码的12S RNA并且包括MT_RNR1基因(参见例如NCBI基因ID：4549)。该RNA基因属于Mt_rRNA类基因。与MT-RNR1相关联的疾病包括限制型心肌病和听神经病。其相关途径包括真核生物中的核糖体生物发生和CFTR翻译保真性(I类突变)。一种MT_RNR1 RNA序列存在于NCBI参考序列登录号NC_012920的序列中。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ ID NO:33)。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ ID NO:33)和序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:35)。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:31)。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR由包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC(SEQ ID NO:34)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR由包含序列CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:36)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR由包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC(SEQ ID NO:34)和序列CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:36)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗的3'UTR由包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ IDNO:32)的DNA编码。
在一些实施例中，RNA疫苗包含在其3'末端的poly(A)尾巴。在一些实施例中，poly(A)尾巴包含多于50个或多于100个腺嘌呤核苷酸。例如，在一些实施例中，poly(A)尾巴包含120个腺嘌呤核苷酸。已证明该poly(A)尾巴能够提高RNA稳定性和翻译效率(Holtkamp,S.等人(2006)Blood 108:4009-4017)。在一些实施例中，包含poly(A)尾巴的RNA通过转录DNA分子产生，该DNA分子在5'→3'转录方向上包含编码至少50个、100个或120个腺嘌呤连续核苷酸以及IIS型限制性内切酶的识别序列的多核苷酸序列。改善翻译的示例性poly(A)尾巴和3'UTR序列参见例如美国专利号9,476,055。
在一些实施例中，本公开的RNA疫苗或分子包含以下一般结构(在5'→3'方向上)：(1)5'帽；(2)5'未翻译区(UTR)；(3)编码分泌信号肽的多核苷酸序列；(4)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(5)3'UTR，该3'UTR包含：(a)酶切氨基末端增强子(AES)mRNA的3'未翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(6)poly(A)序列。在一些实施例中，本公开的RNA疫苗或分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:19)；和多核苷酸序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:20)。有利地，包含结构或序列的这一组合和取向的RNA疫苗的特征在于以下各项中的一者或多者：改善的RNA稳定性、增强的翻译效率、改善的抗原呈递和/或加工(例如，通过DC)和增加的蛋白质表达。
在一些实施例中，本公开的RNA疫苗或分子包含SEQ ID NO:42的序列(在5'→3'方向上)。参见例如图4。在一些实施例中，N是指编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或30个不同新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，N是指编码一个或多个连接基-表位模块(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或30个不同连接基-表位模块)的多核苷酸序列。在一些实施例中，N是指编码一个或多个连接基-表位模块(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或30个不同连接基-表位模块)和3'末端的额外氨基酸连接基的多核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA疫苗分子进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，所述编码至少一个新表位的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在一些实施例中，RNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA疫苗或分子在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸连接基的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，编码氨基酸连接基和新表位的多核苷酸序列形成连接基-新表位模块(例如，在5'→3'方向上在同一开放阅读框中的连续序列)。在一些实施例中，在5'→3'方向上，形成连接基-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间，或在SEQ ID NO:19的序列与SEQ ID NO:20的序列之间。在一些实施例中，RNA疫苗或分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个连接基-表位模块。在一些实施例中，连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA疫苗或分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且RNA疫苗或分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，RNA疫苗或分子包含5个、10个或20个连接基-表位模块s。在一些实施例中，连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，连接基-表位模块在5'→3'方向上在同一开放阅读框中形成连续序列。在一些实施例中，编码第一连接基-表位模块的连接基的多核苷酸序列为编码分泌性信号肽的多核苷酸序列的3'末端。在一些实施例中，编码最后一个连接基-表位模块的新表位的多核苷酸序列为编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列的5'末端。
在一些实施例中，RNA疫苗的长度为至少800个核苷酸、至少1000个核苷酸或至少1200个核苷酸。在一些实施例中，RNA疫苗的长度为少于2000个核苷酸。在一些实施例中，RNA疫苗的长度为至少800个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少1000个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少1200个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少1400个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少800个核苷酸但少于1400个核苷酸，或长度为至少800个核苷酸但少于2000个核苷酸。例如，包含如上所述的元件的RNA疫苗的恒定区的长度为约800个核苷酸。在一些实施例中，包含5个患者特异性新表位(例如，各自编码27个氨基酸)的RNA疫苗的长度大于1300个核苷酸。在一些实施例中，包含10个患者特异性新表位(例如，各自编码27个氨基酸)的RNA疫苗的长度大于1800个核苷酸。
在一些实施例中，RNA疫苗配制成脂质体复合物纳米颗粒或脂质体。在一些实施例中，RNA的脂质体复合物纳米颗粒制剂(RNA-脂质体复合物)用于实现本公开的RNA疫苗的IV递送。在一些实施例中，利用包含合成阳离子脂质(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的RNA癌症疫苗的脂质体复合物纳米颗粒制剂，例如以实现IV递送。DOTMA/DOPE脂质体组分已针对脾脏和其他淋巴器官中抗原呈递细胞的IV递送和靶向进行了优化。
在一个实施例中，纳米颗粒包含至少一种脂质。在一个实施例中，纳米颗粒包含至少一种阳离子脂质。阳离子脂质可为单阳离子脂质或多阳离子脂质。任何阳离子两亲分子(例如，包含至少一个亲水部分和亲脂性部分的分子)均为本发明的含义范围内的阳离子脂质。在一个实施例中，正电荷由所述至少一种阳离子脂质产生，负电荷由RNA产生。在一个实施例中，纳米颗粒包含至少一种辅助脂质。辅助盐可为中性脂质或阴离子脂质。辅助脂质可为天然脂质(诸如磷脂)或天然脂质的类似物或全合成脂质或与天然脂质无相似性的类脂质分子。在一个实施例中，阳离子脂质和/或辅助脂质为双层形成脂质。
在一个实施例中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)或其类似物或衍生物和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)或其类似物或衍生物。
在一个实施例中，所述至少一种辅助脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其类似物或衍生物、胆固醇(Chol)或其类似物或衍生物和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)或其类似物或衍生物。
在一个实施例中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种辅助脂质的摩尔比为10:0至3:7，优选为9:1至3:7、4:1至1:2、4:1至2:3、7:3至1:1或2:1至1:1，优选为约1:1。在一个实施例中，在该摩尔比下，阳离子脂质的摩尔量由阳离子脂质的摩尔量乘以阳离子脂质中的正电荷数得到。
在一个实施例中，脂质包含在包封所述RNA的囊泡中。囊泡可为多层囊泡、单层囊泡或它们的混合物。囊泡可为脂质体。
可根据阳离子脂质与RNA的(+/-)电荷比调整正电荷与负电荷并且将RNA与阳离子脂质混合，形成本文所述的纳米颗粒或脂质体。本文所述的纳米颗粒中阳离子脂质与RNA的+/-电荷比可通过以下公式进行计算。(+/-电荷比)＝[(阳离子脂质量(mol))×(阳离子脂质中正电荷总数)]:[(RNA量(mol))×(RNA中负电荷总数)]。本领域的技术人员根据制备纳米颗粒时的负载量，可轻松确定RNA量和阳离子脂质量。有关示例性纳米颗粒的进一步描述，参见例如PG公开号US20150086612。
在一个实施例中，纳米颗粒或脂质体中正电荷与负电荷的总电荷比(例如，在生理pH)介于1.4:1和1:8之间，优选介于1.2:1和1:4之间，例如介于1:1和1:3之间，诸如介于1:1.2和1:2之间、介于1:1.2和1:1.8之间、介于1:1.3和1:1.7之间，特别是介于1:1.4和1:1.6之间，诸如约1:1.5。在一些实施例中，在生理pH，纳米颗粒的正电荷与负电荷的总电荷比介于1:1.2
Figure BDA0003642845070000631
和1:2(0.5)之间。在一些实施例中，在生理pH，纳米颗粒或脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比介于1.6:2(0.8)和1:2(0.5)之间或介于1.6:2(0.8)和1.1:2(0.55)之间。在一些实施例中，在生理pH，纳米颗粒或脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。在一些实施例中，在生理pH下，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不低于1.0:2.0。在一些实施例中，在生理pH下，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不高于1.9:2.0。在一些实施例中，在生理pH下，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不低于1.0:2.0并且不高于1.9:2.0。
在一个实施例中，纳米颗粒为脂质体复合物，其包含摩尔比为10:0至1:9、优选8:2至3:7并且更优选7:3至5:5的DOTMA与DOPE，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.8:2至0.8:2、更优选1.6:2至1:2、甚至更优选1.4:2至1.1:2并且甚至更优选约1.2:2。在一个实施例中，纳米颗粒为脂质体复合物，其包含摩尔比为10:0至1:9、优选8:2至3:7并且更优选7:3至5:5的DOTMA与胆固醇，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.8:2至0.8:2、更优选1.6:2至1:2、甚至更优选1.4:2至1.1:2并且甚至更优选约1.2:2。在一个实施例中，纳米颗粒为脂质体复合物，其包含摩尔比为10:0至1:9、优选8:2至3:7并且更优选7:3至5:5的DOTAP与DOPE，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.8:2至0.8:2、更优选1.6:2至1:2、甚至更优选1.4:2至1.1:2并且甚至更优选约1.2:2。在一个实施例中，纳米颗粒为脂质体复合物，其包含摩尔比为2:1至1:2、优选2:1至1:1的DOTMA与DOPE，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.4:1或更小。在一个实施例中，纳米颗粒为脂质体复合物，其包含摩尔比为2:1至1:2、优选2:1至1:1的DOTMA与胆固醇，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.4:1或更小。在一个实施例中，纳米颗粒为脂质体复合物，其包含摩尔比为2:1至1:2、优选2:1至1:1的DOTAP与DOPE，并且其中DOTAP的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.4:1或更小。
在一个实施例中，纳米颗粒或脂质体的ζ电位为-5或更小、-10或更小、-15或更小、-20或更小或-25或更小。在各种实施例中，纳米颗粒或脂质体的ζ电位为-35或更高、-30或更高或-25或更高。在一个实施例中，纳米颗粒或脂质体具有0mV至-50mV、优选0mV至-40mV或-10mV至-30mV的ζ电位。
在一些实施例中，纳米颗粒或脂质体的多分散性指数为0.5或更小、0.4或更小或0.3或更小，如通过动态光散射所测得的。
在一些实施例中，纳米颗粒脂质体具有在约50nm至约1000nm范围内、在约100nm至约800nm范围内、在约200nm至约600nm范围内、在约250nm至约700nm范围内或在约250nm至约550nm范围内的平均直径，如通过动态光散射所测得的。
在一些实施例中，PCV以15μg、25μg、38μg、50μg或100μg的剂量经静脉内施用(例如，以脂质体制剂的形式)。在一些实施例中，每剂递送15μg、25μg、38μg、50μg或100μg RNA(即，剂量重量反映施用的RNA的重量而非施用的制剂或脂质体复合物的总重量)。可向受试者施用多于一种PCV，例如，向受试者施用包含新表位的组合的一种PCV并且还施用包含不同的新表位组合的单独PCV。在一些实施例中，施用包含十个新表位的第一PCV与包含十个替代表位的第二PCV联合。
在一些实施例中，施用PCV以使得将其递送至脾脏。例如，可施用PCT以使得将一种或多种抗原(例如，患者特异性新抗原)递送至抗原呈递细胞(例如，在脾脏中)。
本公开的PCV或RNA疫苗中的任一者均可用于本文所述的方法中。例如，在一些实施例中，施用本公开的PD-1轴结合拮抗剂与个体化癌症疫苗(PCV)(例如，上文描述的RNA疫苗)联合。
本文进一步提供了编码本公开的RNA疫苗中任一者的DNA分子。例如，在一些实施例中，本公开的DNA分子包含一般结构(在5'→3'方向上)：(1)编码5'未翻译区(UTR)的多核苷酸序列；(2)编码分泌信号肽的多核苷酸序列；(3)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(4)编码3'UTR的多核苷酸序列，该3'UTR包含：(a)酶切氨基末端增强子(AES)mRNA的3'未翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(5)编码poly(A)序列的多核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的DNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:40)；和多核苷酸序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:41)。
在一些实施例中，DNA分子在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸连接基的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，编码氨基酸连接基和新表位的多核苷酸序列形成连接基-新表位模块(例如，在5'→3'方向上在同一开放阅读框中的连续序列)。在一些实施例中，在5'→3'方向上，形成连接基-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间，或在SEQ ID NO:40的序列与SEQ ID NO:41的序列之间。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个连接基-表位模块，并且连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连接基-表位模块，并且DNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，DNA分子包含5个、10个或20个连接基-表位模块。在一些实施例中，连接基-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，连接基-表位模块在5'→3'方向上在同一开放阅读框中形成连续序列。在一些实施例中，编码第一连接基-表位模块的连接基的多核苷酸序列为编码分泌信号肽的多核苷酸序列的3'端。在一些实施例中，编码最后一个连接基-表位模块的新表位的多核苷酸序列为编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列的5'端。
本文还提供了产生本公开的RNA疫苗中任一者的方法，这些方法包括转录(例如，通过线性、双链DNA或质粒DNA转录，诸如通过体外转录)本公开的DNA分子。在一些实施例中，这些方法进一步包括从DNA分子中分离和/或纯化转录的RNA分子。
在一些实施例中，本公开的RNA或DNA分子包含IIS型限制性切割位点，该位点允许在5'RNA聚合酶启动子的控制下转录RNA，并且包含多聚腺苷酸盒(poly(A)序列)，其中识别序列位于poly(A)序列的3'末端，而切割位点位于上游并因此在poly(A)序列内。IIS型限制性切割位点的限制性切割使质粒能够在poly(A)序列内线性化，如美国专利号9,476,055和10,106,800中所述。然后可使用线性化质粒作为体外转录的模板，所得转录物以未掩蔽的poly(A)序列结尾。可使用美国专利号9,476,055和10,106,800中描述的任意类型的IIS限制性切割位点。
IV.PD-1轴结合拮抗剂
在一些实施例中，施用本公开的PCV(例如，RNA疫苗)与PD-1轴结合拮抗剂联合。
例如，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂和PDL2结合拮抗剂。“PD-1”的别名包括CD279和SLEB2。“PDL1”的别名包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的别名包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施例中，PD-1、PDL1和PDL2是人PD-1、PDL1和PDL2。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一实施例中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一实施例中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗(Bristol-Myers Squibb/Ono)，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003642845070000671
是WO2006/121168中所述的抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含以下氨基酸序列：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:11)和
(b)轻链包含以下氨基酸序列：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:11的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:12的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:11的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:12的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗(Pembrolizumab)(CAS登记号：1374853-91-4)。派姆单抗(Merck)，也称为MK-3475、Merck 3475、lambrolizumab、
Figure BDA0003642845070000681
和SCH-900475，是WO2009/114335中所述的抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含以下氨基酸序列：QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:13)和
(b)轻链包含以下氨基酸序列：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:14)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:13的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:14的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:13的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:14的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是MEDI-0680(AMP-514；AstraZeneca)。MEDI-0680是人源化IgG4抗PD-1抗体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是PDR001(CAS登记号1859072-53-9；Novartis)。PDR001是人源化IgG4抗PD1抗体，可阻断PDL1和PDL2与PD-1的结合。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是REGN2810(Regeneron)。REGN2810为人抗PD1抗体，也称为
Figure BDA0003642845070000691
和西米普利单抗。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是BGB-108(BeiGene)。在一些实施例中，抗PD-1抗体是BGB-A317(BeiGene)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是JS-001(Shanghai Junshi)。JS-001是人源化抗PD1抗体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是STI-A1110(Sorrento)。STI-A1110是人抗PD1抗体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是INCSHR-1210(Incyte)。INCSHR-1210是人IgG4抗PD1抗体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是PF-06801591(Pfizer)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是TSR-042(也称为ANB011；Tesaro/AnaptysBio)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是AM0001(ARMO Biosciences)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是ENUM 244C8(Enumeral Biomedical Holdings)。ENUM 244C8是抗PD1抗体，可抑制PD-1的功能而不阻止PDL1与PD-1的结合。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是ENUM 388D4(Enumeral Biomedical Holdings)。ENUM 388D4是抗PD1抗体，可竞争性抑制PDL1与PD-1的结合。
在一些实施例中，PD-1抗体包含来自下述文献中描述的PD-1抗体的六个HVR序列(例如三个重链HVR和三个轻链HVR)和/或重链可变结构域和轻链可变结构域：WO2015/112800(申请人:Regeneron)、WO2015/112805(申请人：Regeneron)、WO2015/112900(申请人：Novartis)、US20150210769(转让给Novartis)、WO2016/089873(申请人：Celgene)、WO2015/035606(申请人：Beigene)、WO2015/085847(申请人：Shanghai HengruiPharmaceutical/Jiangsu Hengrui Medicine)、WO2014/206107(申请人：Shanghai JunshiBiosciences/Junmeng Biosciences)、WO2012/145493(申请人：Amplimmune)、US9205148(转让给MedImmune)、WO2015/119930(申请人：Pfizer/Merck)、WO2015/119923(申请人：Pfizer/Merck)、WO2016/032927(申请人：Pfizer/Merck)、WO2014/179664(申请人：AnaptysBio)、WO2016/106160(申请人：Enumeral)和WO2014/194302(申请人：Sorrento)。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。AMP-224(CAS登记号：1422184-00-6；GlaxoSmithKline/MedImmune)，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中所述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是肽或小分子化合物。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是AUNP-12(PierreFabre/Aurigene)。参见，例如WO2012/168944、WO2015/036927、WO2015/044900、WO2015/033303、WO2013/144704、WO2013/132317和WO2011/161699。
在一些实施例中，PDL1结合拮抗剂是抑制PD-1的小分子。在一些实施例中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1的小分子。在一些实施例中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1和VISTA的小分子。在一些实施例中，PDL1结合拮抗剂是CA-170(也称为AUPM-170)。在一些实施例中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1和TIM3的小分子。在一些实施例中，小分子是在WO2015/033301和WO2015/033299中描述的化合物。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂是抗PDL1抗体。本文考虑并描述了多种抗PDL1抗体。在本文的任何实施例中，分离的抗PDL1抗体可以结合人PDL1，例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示的人PDL1，或其变体。在一些实施例中，抗PDL1抗体能够抑制PDL1和PD-1之间和/或PDL1和B7-1之间的结合。在一些实施例中，抗PDL1抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗PDL1抗体是选自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段组成的组的抗体片段。在一些实施例中，抗PDL1抗体是人源化抗体。在一些实施例中，抗PDL1抗体是人抗体。可用于本发明方法的抗PDL1抗体的实例及其制备方法在PCT专利申请WO 2010/077634 A1和美国专利号8,217,149中描述，其通过引用并入本文。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，这些序列分别为GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:1)、AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:2)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:3)，并且
(b)轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，这些序列分别为RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:4)、SASFLYS(SEQ ID NO:5)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是MPDL3280A，也称为阿特珠单抗和
Figure BDA0003642845070000721
(CAS登记号：1422185-06-5)，《WHO药物信息(国际非专利药名)》中拟定的INN描述于2015年1月16日发表的第28卷第4期中(参见第485页)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链可变区序列包含以下氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)和
(b)轻链可变区序列包含以下氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含以下氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:9)和
(b)轻链包含以下氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:10)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是阿维单抗(avelumab)(CAS登记号：1537032-82-8)。阿维单抗，也称为MSB0010718C，是人单克隆IgG1抗PDL1抗体(Merck KGaA，Pfizer)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含以下氨基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:15)和
(b)轻链包含以下氨基酸序列：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:16)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:15的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:16的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:15的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:16的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)(CAS登记号：1428935-60-7)。德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736，是WO2011/066389和US2013/034559中所述的Fc优化的人单克隆IgG1κ抗PDL1抗体(MedImmune，AstraZeneca)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含以下氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:17)和
(b)轻链包含以下氨基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:18)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:17的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:18的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:17的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:18的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是MDX-1105(Bristol Myers Squibb)。MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中所述的抗PDL1抗体。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是LY3300054(Eli Lilly)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是STI-A1014(Sorrento)。STI-A1014是人抗PDL1抗体。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是KN035(Suzhou Alphamab)。KN035是从骆驼噬菌体展示文库生成的单结构域抗体(dAB)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含可裂解的部分或连接基，当被裂解时(例如，通过肿瘤微环境中的蛋白酶)，该部分或连接基激活抗体抗原结合结构域(例如，通过去除非结合的空间部分)以使其结合其抗原。在一些实施例中，抗PDL1抗体是CX-072(CytomXTherapeutics)。
在一些实施例中，PDL1抗体包含来自以下文献所述的PDL1抗体的六个HVR序列(例如，三个重链HVR和三个轻链HVR)和/或重链可变结构域和轻链可变结构域：US20160108123(转让给Novartis)、WO2016/000619(申请人：Beigene)、WO2012/145493(申请人：Amplimmune)、US9205148(转让给MedImmune)、WO2013/181634(申请人：Sorrento)和WO2016/061142(申请人：Novartis)。
在又一特定方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在另一方面，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4组成的组。在又一特定方面，人恒定区是IgG1。在又一个方面，鼠恒定区选自由IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3组成的组。在另一方面，鼠恒定区为IgG2A。
在又一特定方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在又一个具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化突变。在另一实施例中，无效应子Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。在一些实施例中，分离的抗PDL1抗体是去糖基化的。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸，是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接至羟基氨基酸，该羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以除去上述三肽序列之一(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地从抗体上去除糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基取代为另一个氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守取代)来进行改变。
在又一实施例中，本公开提供了包含任何上述抗PDL1抗体与至少一种药用的载体联合的组合物。
在又一实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含如本文提供的抗PDL1、抗PD-1或抗PDL2抗体或其抗原结合片段以及至少一种药用的载体。在一些实施例中，施用于个体的抗PDL1、抗PD-1或抗PDL2抗体或其抗原结合片段是包含一种或多种药用的载体的组合物。可以使用本文所述或本领域已知的任何药用的载体。
V.抗体制备
本文所述的抗体是使用本领域可用于产生抗体的技术制备的，其示例性方法在以下部分中更详细地描述。
抗体针对目标抗原(例如，PD-1或PD-L1，诸如人PD-1或PD-L1)。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有病症的哺乳动物施用抗体可以在该哺乳动物中产生治疗益处。
在某些实施例中，本文提供的的抗体具有≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施例中，通过用Fab形式的目标抗体及其抗原进行放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量Kd，如以下测定所述。通过在一系列未标记的抗原滴定存在下用最小浓度(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为确定测定条件，用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被
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微孔板(Thermo Scientific)过夜，随后在室温(大约23℃)用在PBS中2％(w/v)牛血清白蛋白阻断二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释液混合。然后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温孵育(例如，一小时)。随后移除溶液并且用在PBS中的0.1％聚山梨酯20
Figure BDA0003642845070000773
洗涤该板八次。当板已干燥时，添加150μL/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一实施例，在25℃，用经固定化的抗原CM5芯片，在大约10响应单位(RU)下，使用
Figure BDA0003642845070000774
-2000或
Figure BDA0003642845070000775
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，通过表面等离子体共振测定来测量Kd。简言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM醋酸钠pH 4.8稀释至5μg/mL(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速进行注射以获得大约10响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃，以约25μL/min的流速注射在含有0.05％聚山梨酯20(TWEEN 20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔结合模型(
Figure BDA0003642845070000771
评估软件3.2版)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定得出缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，即如在分光计诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测得的，在浓度渐增的抗原存在下，测量在25℃PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发波长＝295nm；发射波长＝340nm，带通＝16nm)的增加或减少。
嵌合抗体、人源化抗体和人抗体
在某些实施例中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在某些实施例中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr Opin Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg，Curr Opin Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。另见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
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技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003642845070000792
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003642845070000793
技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如：Kozbor J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等人，《单克隆抗体生产技术及应用》(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications)，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.，147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
抗体片段
抗体片段可以通过传统方法(诸如酶消化)或通过重组技术产生。在某些情况下，使用抗体片段而不是全抗体具有优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并可以改善对实体瘤的进入。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而获得(参见例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。但是，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达并从大肠杆菌中分泌出来，因此可轻松生产大量这些片段。可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可替代地，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，并化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。具有增加的体内半衰期的包含挽救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利号5,869,046中。产生抗体片段的其它技术对熟练技术人员将是显而易见的。在某些实施例中，抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点没有恒定区的仅有的种类；因此，它们可能适合于在体内使用期间减少非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基末端或羧基末端产生效应蛋白的融合。参见Borrebaeck编撰的《抗体工程》(Antibody Engineering)，同上。例如，该抗体片段也可以是“线性抗体”，例如美国专利号5,641,870中所述。这样的线性抗体可以是单特异性或双特异性的。
单结构域抗体
在一些实施例中，本公开的抗体是单结构域抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的单个多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利号6,248,516B1)。在一个实施例中，单结构域抗体由抗体的全部或部分重链可变结构域组成。
抗体变体
在一些实施例中，考虑了本文描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的改变或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特性。可以在形成序列时将氨基酸改变引入目标抗体的氨基酸序列中。
取代、***和删除性变体
在某些实施例中，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目的位点包括HVR和FR。保守取代如表3所示。更多实质性改变提供于表1的“示例性置换”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表3.保守取代
Figure BDA0003642845070000811
Figure BDA0003642845070000821
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
a.疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.残基，其影响
链朝向:Gly，Pro；
f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体为亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可发生于HVR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基中(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)(检测所得变体VH或VL的结合亲和力)。通过构建以及从二级文库中重新选择以实现亲和力成熟的方法已描述于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向突变)中的任一个将多样性引入出于成熟目的而挑选的可变基因中。接着创建二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中将若干HVR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施例中，取代、***或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体的抗原结合能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个HVR保持不变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的融合。
糖基化变体
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现。
当抗体包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含具有支链的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本公开的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供了包含Fc区的抗体变体，其中连接至Fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可以改善ADCC功能。具体地，本文考虑相对于在野生型CHO细胞中产生的相同抗体上的岩藻糖的量，具有减少的岩藻糖的抗体。也就是说，它们的特征在于其岩藻糖的量比天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化模式的CHO细胞，诸如含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生的岩藻糖的量低。在某些实施例中，该抗体是一种抗体，其中其上少于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的N-连接聚糖包含岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。在某些实施例中，该抗体是一种抗体，其中其上的N-连接聚糖均不包含岩藻糖，即，其中该抗体完全没有岩藻糖，或没有岩藻糖或被去岩藻糖基化。岩藻糖的量为通过计算相对于通过MALDI-TOF质谱测得的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，糖链中在Asn297处的岩藻糖的平均量，确定，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于位置297上游或下游大约±3个氨基酸，即在位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)和US 2004/0093621(日本协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的示例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1，Adams等人，特别是实例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体还提供有二等分的寡糖，例如，其中附接于抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的示例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；US 2005/0123546(Umana等人)；以及Ferrara等人，Biotechnology andBioengineering,93(5):851-861(2006)中。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施例中，包含本文所述的Fc区的抗体变体能够结合FcγRIII。在某些实施例中，与包含人野生型IgG1 Fc区的其它相同抗体相比，包含本文所述的Fc区的抗体变体在人效应细胞存在下具有ADCC活性，或在人效应细胞存在下具有增加的ADCC活性。
Fc区变体
在某些实施例中，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如置换)。
在某些实施例中，本公开考虑了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为应用的期望候选物，其中体内的抗体的半衰期为重要的而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)为不必要的或有害的。可实施体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003642845070000861
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或附加地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估感兴趣的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie，Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施例中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基根据EU编号)的置换。在一个示例性的实施例中，该抗体在其Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。
在一些实施例中，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述，在Fc区中进行改变，导致改变(即，改善或减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US 2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
VI.药物组合物和制剂
本文还提供了药物组合物和制剂，其例如用于治疗癌症。在一些实施例中，药物组合物和制剂还包含药用的载体。
在制备目的抗体后(例如，生产可以如本文所公开地配制的抗体的技术在本文中阐述并且是本领域已知的)，制备了包含它的药物制剂。在某些实施例中，待配制的抗体未经预先冻干，并且本文目标制剂是水性制剂。在某些实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，制剂中的抗体为抗体片段，诸如F(ab')2，在这种情况下，可能需要解决使用全长抗体时可能不会发生的问题(诸如将抗体剪接到Fab)。制剂中存在的抗体的治疗有效量例如通过考虑所需的剂量体积和施用方式来确定。约25mg/mL至约150mg/mL、或约30mg/mL至约140mg/mL、或约35mg/mL至约130mg/mL、或约40mg/mL至约120mg/mL、或约50mg/mL至约130mg/mL、或约50mg/mL至约125mg/mL、或约50mg/mL至约120mg/mL、或约50mg/mL至约110mg/mL、或约50mg/mL至约100mg/mL、或约50mg/mL至约90mg/mL、或约50mg/mL至约80mg/mL、或约54mg/mL至约66mg/mL是制剂中的示例性抗体浓度。在一些实施例中，本文所述的抗PDL1抗体(诸如阿特珠单抗)以约1200mg的剂量施用。在一些实施例中，本文所述的抗PD1抗体(诸如派姆单抗)以约200mg的剂量施用。在一些实施例中，本文所述的抗PD1抗体(诸如纳武单抗)以约240mg(例如，每2周一次)或480mg(例如，每4周一次)的剂量施用。
在一些实施例中，本文所述的RNA疫苗以约15μg、约25μg、约38μg、约50μg或约100μg的剂量施用。
本文所述的药物组合物和制剂可通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种可选的药用的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16thedition,Osol,A.Ed.(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备。药用载体在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用的载体还包括间质药物分散剂例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，诸如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003642845070000891
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂和组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白、微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)。
可以制备缓释制备物。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，这些基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜的过滤。
阿特珠单抗和派姆单抗的药物制剂可商购获得。例如，阿特珠单抗以商品名(如本文其他地方所述)
Figure BDA0003642845070000901
为人所知。派姆单抗以商品名(如本文其他地方所述)
Figure BDA0003642845070000902
为人所知。在一些实施例中，阿特珠单抗和RNA疫苗或派姆单抗和RNA疫苗提供于单独的容器中。在一些实施例中，如可从市售产品获得的处方信息中所述，阿特珠单抗和/或派姆单抗用于和/或制备用于施用于个体。
VII.治疗方法
本文提供了用于治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，这些方法包括向个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗。在一些实施例中，个体是人。
本公开的PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗中的任一者均可用于本文所述的治疗方法中。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码10-20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗包含一种或多种编码5-20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗配制成脂质体复合物纳米颗粒或脂质体。在一些实施例中，RNA的脂质体复合物纳米颗粒制剂(RNA-脂质体复合物)用于实现本公开的RNA疫苗的静脉内递送。在一些实施例中，PCV以15μg、25μg、38μg、50μg或100μg的剂量经静脉内施用(例如，以脂质体制剂的形式)。在一些实施例中，每剂递送15μg、25μg、38μg、50μg或100μgRNA(即，剂量重量反映施用的RNA的重量而非施用的制剂或脂质体复合物的总重量)。可向受试者施用多于一种PCV，例如，向受试者施用包含新表位的组合的一种PCV并且还施用包含不同的新表位组合的单独PCV。在一些实施例中，联合施用包含十个新表位的第一PCV与包含十个替代表位的第二PCV。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体，其包括但不限于派姆单抗。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-L1抗体，其包括但不限于阿特珠单抗。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂以21天或3周的间隔施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，派姆单抗)，以21天或3周的间隔例如以约200mg的剂量施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，西米普利单抗)以21天或3周的间隔例如以约350mg的剂量施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)施用于个体，以21天或3周的间隔例如以约1200mg的剂量施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂以14天或28天的间隔施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂以2周或4周的间隔施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)，以14天、2周、28天或4周的间隔施用于个体，例如以14天或2周的间隔以约240mg的剂量施用，或以28天或4周的间隔以约480mg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)，以21天或3周的间隔施用于个体，例如以约1mg/kg的剂量以1剂、2剂、3剂或4剂施用于个体，任选地与抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)联合，并且任选地随后以14天、2周、28天或4周的间隔单独施用抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)，例如以14天或2周的间隔以约240mg的剂量施用或以28天或4周的间隔以约480mg的剂量施用。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂以14天或2周的间隔施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-L1抗体(例如，德瓦鲁单抗)，以14天或2周的间隔施用于个体，例如以约10mg/kg的剂量施用(任选地通过静脉输注60分钟进行施用)。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂为抗PD-L1抗体(例如，阿维单抗)，以14天或2周的间隔施用于个体，例如以约10mg/kg的剂量施用(任选地通过静脉输注60分钟进行施用)。
在一些实施例中，RNA疫苗以21天或3周的间隔施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂在第1周期至第8周期的第1天施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天施用于个体，并且PD-1轴结合拮抗剂在第1周期至第8周期的第1天施用于个体。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在第8周期后进一步施用于个体。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在17个另外的21天周期进一步施用于个体，其中PD-1轴结合拮抗剂在第13周期至第29周期的第1天施用于个体，并且/或者其中RNA疫苗在第13周期、第21周期和第29周期的第1天施用于个体。
在某些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，其中PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。在某些实施例中，PD-L1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，其中PD-L1轴结合拮抗剂为阿特珠单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以约1200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天以约25μg的剂量、在第2周期的第8天以约25μg的剂量、在第2周期的第15天以约25μg的剂量并且在第3周期至第7周期中每个周期的第1天以约25μg的剂量施用于个体(也就是说，在第2周期内以3剂总共向个体施用约75μg疫苗)。在一些实施例中，在施用RNA疫苗的第一周期内，以3剂总共向个体施用约75μg疫苗。
在某些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，其中PD-1轴结合拮抗剂为派姆单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以25μg的剂量施用于个体。在某些实施例中，PD-L1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在8个21天周期中施用于个体，其中PD-L1轴结合拮抗剂为阿特珠单抗并且在第1周期至第8周期的第1天以1200mg的剂量施用于个体，并且其中RNA疫苗在第2周期的第1天、第8天和第15天以及第3周期至第7周期的第1天以25μg的剂量施用于个体。在一些实施例中，RNA疫苗在第2周期的第1天以25μg的剂量、在第2周期的第8天以25μg的剂量、在第2周期的第15天以25μg的剂量并且在第3周期至第7周期中每个周期的第1天以25μg的剂量施用于个体(也就是说，在第2周期内以3剂总共向个体施用75μg疫苗)。在一些实施例中，在施用RNA疫苗的第一周期内，以3剂总共向个体施用75μg疫苗。
PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗可以任意顺序施用。例如，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗可依次(在不同时间)或同时(在同一时间)施用。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在单独的组合物中。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在同一组合物中。
在一些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌和头颈部癌。在一些实施例中，癌症为局部晚期或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌或头颈部癌。在一些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌和头颈部癌。在一些实施例中，癌症为局部晚期或转移性非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、三阴性乳腺癌、肾癌或头颈部癌。
在一些实施例中，癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为皮肤黑色素瘤或黏膜黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为皮肤黑色素瘤、粘膜黑色素瘤或肢端黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤并非眼黑色素瘤或肢端黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为转移性或不可切除的局部晚期黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为IV期黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为IIIC期或IIID期黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤为不可切除的或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，所述方法提供了黑色素瘤的辅助治疗。
在一些实施例中，既往未接受过癌症(例如，黑色素瘤)治疗。在一些实施例中，癌症为既往未接受过治疗的晚期黑色素瘤。
在一些实施例中，在根据本文所述的方法中的任一者所述接受PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗治疗之前，个体在接受基于PD-1轴结合拮抗剂的单一疗法(例如，接受不存在RNA疫苗的情况下的派姆单抗治疗)后发生进展或未能产生足够的应答。
PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗可通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。在一些实施例中，通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、心室内或鼻内施用PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施例中，RNA疫苗经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用(例如，以脂质体复合物颗粒或脂质体的形式)。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗通过静脉输注施用。可施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗以预防或治疗疾病。
在一些实施例中，方法可以进一步包括附加疗法。附加疗法可以是放疗、手术(例如，***肿瘤切除术和***切除术)、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。附加疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。在一些实施例中，附加疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施例中，附加疗法为施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或减轻其严重程度的药物，例如止吐剂等)。在一些实施例中，附加疗法为放疗。在一些实施例中，附加疗法为手术。在一些实施例中，附加疗法为放疗与手术的组合。在一些实施例中，附加疗法为伽玛辐照。
VIII.制品或试剂盒
本文进一步提供了包含PD-1轴结合拮抗剂(诸如阿特珠单抗或派姆单抗)的制品或试剂盒。在一些实施例中，制品或试剂盒进一步包含包装插页，该包装插页中包含联合使用PD-1轴结合拮抗剂与RNA疫苗以治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展或增强患者癌症的个体的免疫功能的说明。本文还提供了包含PD-1轴结合拮抗剂(诸如阿特珠单抗或派姆单抗)和RNA疫苗的制品或试剂盒。
在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗在同一容器中或单独的容器中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料形成，例如玻璃、塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施例中，容器容纳制剂，容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度出发期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。在一些实施例中，制品还包括一种或多种其他试剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种试剂的合适容器包括例如瓶、小瓶、袋子和注射器。
该说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文中示出和描述的之外，本发明的各种修改对于根据说明书前文的本领域技术人员而言将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
实例
参考以下实例将更全面地理解本公开。但是，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及本发明所附权利要求的范围内。
实例1：RNA疫苗联合派姆单抗在既往未接受过治疗的晚期黑色素瘤患者中的疗效和安全性的II期、开放标签、多中心、随机研究
理由
如上所述，检查点抑制剂为目前针对转移性黑色素瘤的标准治疗方案。然而，在多种恶性肿瘤(包括黑色素瘤)中，使用靶向PD-L1/PD-1的药物所观察到的持久临床益处似乎仅限于一部分患者。尽管伴随目前广泛使用的免疫疗法的发展，诸如PD-1疗法(纳武单抗、派姆单抗)或抗PD1联合抗CTLA-4疗法(纳武单抗和伊匹单抗)，OS得到改善，但是相当一部分患者对检查点抑制剂的治疗无应答或仅发生短暂的疾病稳定(Robert C,Long GV,BradyB等人,N Engl J Med 2015a；372:320-30；Rosenberg JE,Hoffman-Censits J,Powles T等人,Lancet 2016；387:1909-20)，证明转移性实体瘤患者存在持续未满足的需求。尽管对PD-1抑制剂治疗产生应答的患者中约10％-30％的客观缓解趋于持久，但是这些患者仍有疾病进展的风险。在最近针对接受PD-1阻断治疗的黑色素瘤患者的一项研究中，205例对派姆单抗有客观应答的患者中有53例(26％)在21个月的中位随访期内发生疾病进展(RibasA,Hamid O,Daud A等人JAMA 2016；315:1600-9)。
虽然抗PD1以及抗PD1加抗CTLA-4显著改善了黑色素瘤患者的长期预后，但后者以增加治疗相关毒性为代价。尽管取得了这些进步，但仍有相当一部分患者仍处于疾病进展的风险中并且死于其疾病。需要解决伴随毒性增加的抗性检查点阻断机制的联合疗法。
抗性可能在效应T细胞的水平上发生，该效应T细胞的活性可能由于T细胞刺激不佳而受到限制。在临床前模型中，诱导抗原特异性免疫与同时阻断PD-L1/PD-1通路的组合表现出优于这些通路相应的单药抑制剂的疗效，即使在单药疫苗活性有限的模型中也是如此。在这些研究中，仅当PD-L1被阻断时，肿瘤浸润T细胞才表现出增加的IFN-γ表达(T细胞活化和抗肿瘤活性的标志)(Duraiswamy J,Kaluza KM,Freeman GJ等人Cancer Res 2013；73:3591-603；Fu J,Malm IJ,Kadayakkara DK等人Cancer Res 2014；74:4042-52)。基于这些研究，假设RO7198457与抗PD-L1/PD-1的组合可以导致抗肿瘤免疫反应的活化，从而增强对肿瘤细胞的杀伤并且改善癌症患者的临床应答。
目的
本研究在既往未接受过治疗的晚期黑色素瘤患者中，评价个体化RNA新表位疫苗(PCV)RO7198457加派姆单抗相比于派姆单抗单独治疗的疗效、安全性、药代动力学和患者报告结局(PRO)。下位概述了研究的具体目标和相应终点。
本研究的主要疗效目的是基于以下终点评价RO7198457加派姆单抗相比于派姆单抗单独治疗的疗效：
·随机分组后的无进展存活(PFS)，定义为从随机分组到首次发生疾病进展或因任何原因死亡(以先发生者为准)的时间，由研究者根据实体瘤疗效评价标准1.1版(RECISTv1.1)确定
·客观缓解率(ORR)，定义为相隔≥4周连续两次达到完全缓解(CR)或部分缓解(PR)的患者比例，由研究者根据RECIST v1.1确定
本研究次要疗效目的是基于以下终点评价RNA新表位疫苗加派姆单抗相比于派姆单抗单独治疗的疗效：
·随机分组后的总存活(OS)，定义为从随机分组到因任何原因死亡的时间
·缓解持续时间(DOR)，定义为从首次发生有记录的客观缓解到产生疾病进展或因任何原因死亡的时间，由研究者根据RECIST v1.1确定
·健康相关生活质量(HRQoL)得分较基线的平均变化，其在指定时间点通过欧洲癌症研究与治疗组织生活质量-核心30(EORTC QLQ-C30)的两项总体健康状况(GHS)/HRQoL子量表(问题29和30)进行评估
本研究的另一个次要疗效目的是评价自派姆单抗单一疗法转换为联合疗法(例如，RNA新表位疫苗加派姆单抗)后发生CR或PR的客观缓解的参与者的百分比。
另一个次要目的为基于以下终点，评价在接受派姆单抗单一疗法后产生疾病进展的患者中RNA新表位疫苗加派姆单抗治疗的疗效：
·ORR，定义为在转换时，相隔≥4周连续两次获得CR或PR的患者比例，由研究者根据RECIST v1.1确定
本研究的另一个目的是评估不良事件(AE)的发生率和严重程度。
研究设计
本研究为II期、开放标签、多中心、随机研究，设计用于在既往未接受过治疗的晚期黑色素瘤患者中评价RO7198457(PCV)加派姆单抗相比于派姆单抗单独治疗的疗效和安全性。患者人群包括患有不可切除的局部晚期(IIIC和IIID期)和转移性(复发性或新发IV期)黑色素瘤的患者。本研究将在全球范围内进行。
研究由两个阶段组成：初始安全性导入期和随机分组阶段(图1)。每个阶段均包含分为两部分的筛选期、治疗期和治疗后随访期。
安全性导入期包括单个组，招募约6-12例患者，这些患者接受1个周期(21天)通过IV输注施用的200mg派姆单抗，在后续周期中，每3周(Q3W)接受IV 25μg RO7198457加200mg派姆单抗。在内部监查委员会(IMC)对安全性导入期内接受治疗的前6例患者的安全性数据后，才开始随机分组阶段的计数。
随机分组阶段招募约120例患者，将其按2:1的比例随机分入试验组或对照组：
·A组(对照)：通过IV输注Q3W施用200mg派姆单抗，
·B组(试验)：在1个周期内，通过IV输注施用200mg派姆单抗；在后续周期内，IV施用(Q3W)25μg RO7198457加200mg派姆单抗
确认发生疾病进展后(由研究者根据RECIST v1.1进行评估)，随机分入A组的患者可以选择转换并且接受RO7198457与派姆单抗联合治疗，前提是其符合入组标准。
在筛选期的第一部分(A部分)，对签署知情同意书的患者进行初步资格评估(例如，美国东部肿瘤协作组[ECOG]体能状态、血液化学、血清评估HIV、乙型肝炎病毒[HBV]和丙型肝炎病毒[HCV])，收集组织和血液样品以确定肿瘤特异性体细胞突变，并且进行人白细胞抗原(HLA)分型以实现RO7198457制备。目前计划的制备周转时间为4-6周，从收到足够数量和质量的血液样品和肿瘤样品起计算。筛选期的第二部分(B部分)为第1天之前的28天，用于确认患者的入组资格。
符合条件的患者包括年龄≥18岁并且ECOG体能状态为0或1的男性和女性，其患有可测量并且经组织学确认为IIIC期或IIID期(不可切除)或转移性(复发性或新发IV期)侵入性皮肤黑色素瘤或粘膜黑色素瘤，并且既往未接受过晚期疾病治疗。患有眼黑色素瘤或肢端黑色素瘤或未经治疗的CNS转移的患者不符合入组标准。允许既往接受过伊匹单抗、BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的辅助治疗。允许既往接受过抗PD-1/PD-L1药物的辅助治疗，前提是最后一剂在第1周期的第1天前至少6个月施用。患者必须能够提供用于疫苗制备和PD-L1检测的肿瘤标本。
如图2所示，A组(派姆单抗)患者从第1周期开始接受IV输注200mg派姆单抗(Q3W)。安全性导入期患者和随机分组阶段的B组(25μg RO7198457加200mg派姆单抗)患者从第1周期开始接受IV输注派姆单抗(Q3W)。第1周期为派姆单抗单一疗法导入期，提供时间进行疫苗制备。RO7198457加派姆单抗从第2周期开始，在派姆单抗输注完成后30分钟通过IV输注施用RO7198457。对于安全性导入期和B组，RO7198457从第2周期的第1天开始施用，然后在第2周期的第8天和第15天施用；在第3周期至第7周期(包括端点)的第1天施用，然后从第13周期开始每8个周期施用一次以作为维持治疗(第13周期、第21周期和第29周期)。在获得医学监查员批准的情况下，可允许延迟开始接受RO7198457联合治疗(即，在第2周期的第1天之前无法获得RO7198457)或在RO7198457诱导期间中断治疗的患者晚于第2周期的第1天开始接受联合治疗和/或在初始治疗期的后期接受补充剂量的RO7198457以达到总共8个诱导剂量(例如，错过第2周期的第1天的患者将在第2周期的第8天开始接受RO7198457，并且在第3周期的第8天以计划外访视的形式接受补充剂量，在第2周期的第15天开始接受RO7198457的患者将在第3周期的第8天和第15天以计划外访视的形式接受补充剂量等)。
对于所有患者，本研究的治疗持续时间最长为24个月，只要在综合评估放射学数据和临床数据后，在未发生不可接受的毒性或归因于疾病进展的症状恶化的情况下，经研究者评估，这些患者正获得临床益处。在符合RECIST v1.1疾病进展标准后，可允许患者继续接受治疗。如果符合交换标准，A组患者在确认发生疾病进展后可选择转换未接受RO7198457加派姆单抗联合治疗。此外，如果A组的患者完成24个月的派姆单抗治疗并且在停用派姆单抗＜6个月后确认发生疾病进展，他们可选择接受RO7198457加派姆单抗的交叉治疗。
患者在基线(第1周期第1天)、第12周以及第1周期第1天后前48周内每6周(每2个周期)接受肿瘤评估。如果需要，在筛选期和每次肿瘤评估后首次临床访视时对皮肤病变进行数字摄影。在第1周期第1天起48周后，患者每12(±1)周(约每4个周期)接受一次肿瘤评估。肿瘤评估持续到终止研究治疗、撤回知情同意、申办方终止研究或患者死亡，以先发生者为准。在发生导致治疗中断的疾病进展后，如果可行，同样要求患者在约6(±2)周后返回诊所接受确认性肿瘤评估。因疾病进展以外的原因(例如毒性)中止治疗的患者应继续接受计划的肿瘤评估，直至发生疾病进展、撤回知情同意、申办方终止研究或患者死亡，以先发生者为准。用于肿瘤评估的主要影像数据由申办方采集，以便在需要时对应答终点进行集中、独立的审查。
此外，还要求患者在每个周期开始时完成PRO评估，直至发生疾病进展或治疗中止，以较晚发生者为准。
入组和排除标准
患者必须满足以下条件才能进入研究：
·签署知情同意书时，年龄≥18岁
·经组织学确认患有转移性(复发性或新发IV期)或不可切除的局部晚期(IIIC期或IIID期)皮肤黑色素瘤或粘膜黑色素瘤，其根据AJCC v8.0进行定义(Amin MB,Edge SB,Greene FL等人编，《AJCC癌症分期手册》(AJCC cancer staging manual).第8版，NewYork:Springer；2017)
o粘膜黑色素瘤患者入组人数限于约10例患者
·ECOG体能状态为0或1
·预期寿命≥12周
·具有适当的血液和内脏器官功能，由首次研究治疗(第1周期第1天)前28天内获得的以下实验室结果定义：
oANC≥1,500个细胞/μL(第1周期第1天前2周内无粒细胞集落刺激因子[G-CSF]支持)
oWBC计数≥2,500/μL
o血小板计数≥100,000/μL(第1周期第1天前14天内未输血)
o血红蛋白≥9g/dL(根据当地标准治疗，患者可能需要输血或接受促红细胞生成治疗)
o总胆红素≤1.5×ULN，但以下情况除外：患有已知吉尔伯特病的患者：血清胆红素水平≤3×ULN。
oAST和ALT≤3×ULN
oALP≤2.5×ULN，但以下情况除外：患有经记录的肝转移或骨转移的患者可能发生ALP≤5×ULN。
o血清白蛋白≥2.5g/dL
·基于Cockcroft-Gault肾小球滤过率估算，实测或计算出的肌酐CL≥50mL/min：
(140-年龄)×(体重，千克)×(0.85，如果为女性)
72×(血清肌酐，以mg/dL计)
·根据RECIST v1.1确定的可测量疾病。既往接受过辐照的病灶不应计为靶病灶，除非该病灶经证明存在进展并且不存在其他靶病灶。旨在用于活检的病灶不应计为靶病灶。仅通过体格检查可检测到的皮肤病灶和其他浅表病灶不应计为靶病灶，但可以列为非靶病灶。
·未曾接受过晚期黑色素瘤的全身抗癌治疗(例如，化学疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法或其他生物疗法)，但以下辅助疗法除外：
o接受抗PD1/PD-L1或抗CTLA-4辅助治疗，但是在第1周期第1天前至少6个月中止并且不符合以下任何标准：
■任何归因于既往CIT的免疫相关4级不良事件发生史(通过替代疗法得到控制的内分泌疾病或无症状的血清淀粉酶或脂肪酶升高除外)
■任何归因于既往CIT的免疫相关3级不良事件发生史，其根据当地处方信息、欧洲肿瘤内科学会(ESMO)指南(Haanen JBAG,Carbonnel F,Robert C等人Ann Oncol 2017；28:iv119-iv142)或美国临床肿瘤学会(ASCO)指南(Brahmer JR,Lacchetti C,SchneiderBJ等人J Clin Oncol 2018；36:1714-68)，需要永久终止既往免疫治疗剂治疗
■尚未消退至≤1级的由既往抗癌治疗引起的不良事件，但脱发、白癜风或通过替代疗法得到控制的内分泌疾病除外。在与医疗监查员讨论后，脂肪酶/淀粉酶无症状升高的患者可能符合入组标准。
■尚未消退至基线水平的与既往CIT相关的免疫相关不良事件(通过替代疗法得到控制的内分泌疾病或稳定型白斑病除外)。因免疫相关不良事件接受皮质类固醇治疗的患者必须证明在停用皮质类固醇后≥4周内无相关症状或体征。
o靶向治疗(例如BRAFi/MEKi)辅助治疗，在研究治疗开始前至少2个月停用
o草药疗法辅助治疗，在研究治疗开始前至少7天停用·确认经***固定、石蜡包埋块(首选)中的代表性肿瘤标本
或切片组织(如实验室手册中所述)以及相关病理报告可用。可接受的样品还可以包括用于深层肿瘤组织的芯针活检(至少5个芯针)，用于皮肤、皮下或粘膜病灶的切除、切口、穿孔或活检钳活检。在获得医学监查员批准后，少于5次芯针的患者可被视符合入组标准。不接受细针抽吸样品、刷拭物、来自积液或腹水的细胞沉淀以及灌洗样品。来自骨转移的肿瘤组织很难用于评估PD-L1的表达，应避免使用。但是，如果骨转移部位是唯一可行的组织来源，则在获得医学监查员批准后，可以将其视为可接受的肿瘤标本。在脱钙处理前已脱钙的骨组织为可接受的，因为许多试剂具有破坏用于PD-L1 IHC的抗原和用于测序的核酸的强酸。如有来自不同时间点(诸如初始诊断时间和疾病复发时间)和/或多个转移性肿瘤的足够的组织，应优先考虑最近收集的组织(最好在最近的全身性辅助治疗之后)。基于可用性，可收集给定患者的多个样品；但是，对块状或切片组织的要求应通过单个活检或切除标本来满足。由于需要可评估的肿瘤组织来产生PCV，因此存档组织不足或不可用的患者将不符合资格，除非患者愿意同意并且接受肿瘤治疗前活检样品采集(有关可接受的样品，参见上文)。
·根据申办方的定义，仅招募具有至少五种已鉴定的肿瘤新抗原和足够的肿瘤材料(质量和数量)以允许制备疫苗的患者。对于未棘手过CIT的患者，可接受存档肿瘤组织；其必须在入组前提交并且接受突变评估。对于接受过CIT的患者(即，在辅助治疗中接受过免疫检查点抑制剂治疗的患者)，需要进行基线肿瘤活检，并且必须在入组前提交并且接受突变评估。如果接受过CIT的患者在接受CIT后和入组前经过肿瘤活检，在有足够材料的情况下，可以使用该组织进行筛选。如果可用，患者还应提交存档肿瘤组织进行评价。对于接受过CIT的患者，也可以使用存档组织，以免基线新鲜肿瘤活检不足以制备疫苗。肿瘤组织无法评估或突变数量不足以制备疫苗的患者不符合条件。
·对于有生育能力的女性：同意保持禁欲(避免异性***)或使用避孕措施，并且同意不捐献卵子
·对于男性：同意保持禁欲(避免异性***)或使用避孕套，并且同意不捐献***
符合以下任何条件的患者将被排除在研究之外：
·眼黑色素瘤或肢端黑色素瘤
·妊娠或哺乳，或者计划在研究期间或在最后一剂RO7198457给药后1个月内或在最后一剂派姆单抗给药后4个月内妊娠(以较晚发生者为准)。有生育能力的女性(包括输卵管结扎的女性)在开始研究药物治疗(即第1周期第1天)前14天内的血清妊娠试验结果必须为阴性。
·重大心血管疾病，例如纽约心脏协会心脏病(II级或更高级别)、过去3个月内发生过心肌梗塞、不稳定心律失常和/或不稳定心绞痛。
·已知有临床意义的肝病，包括活动性病毒、酒精性或其他肝炎、肝硬化和遗传性肝病或者目前酗酒
·在第1周期第1天之前28天内接受过大手术，或者预计在研究过程中需要进行大手术
·任何其他疾病、新陈代谢功能障碍、体格检查发现和/或临床实验室发现，根据这些发现合理怀疑存在症禁忌使用研究药物或可能影响对结果的解释或可能使患者处于治疗并发症的高风险中的疾病或病症
·剂量高于7.5mg***龙的皮质类固醇(如果不是用于生理替代)
·既往接受过脾切除术
·已知的原发性免疫缺陷，无论是细胞(例如，DiGeorge综合征、T阴性严重联合免疫缺陷[SCID])或T和B细胞联合免疫缺陷(例如，T和B阴性SCID、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张症、常见变异型免疫缺陷病)
·有症状的、未经治疗的或活动性进展的CNS转移。有CNS病变病史的患者在满足以下所有条件的情况下符合入组标准：
o根据RECIST v1.1确定的可测量疾病必须存在于CNS之外o仅允许幕上和小脑转移(即没有转移到中脑、脑桥、髓质或脊髓)
o视神经器官(视神经和视交叉)10mm以内的转移史
o无需持续使用皮质类固醇治疗CNS疾病
o7天内未接受过立体定向放射治疗
o既往未接受过全脑放射治疗
o在完成CNS定向疗法和筛查射线照相研究之间无临时进展的临床证据
o在筛查扫描中发现新的无症状CNS转移的患者必须接受放射疗法和/或CNS转移手术。治疗后，如果满足所有其他标准，这些患者可能无需在第1周期第1天之前进行额外的脑部扫描
o允许接受稳定剂量的抗惊厥药治疗
o无CNS病变引起的颅内出血史
·转移性软脑膜病史
·无法控制的肿瘤相关疼痛。需要麻醉性止痛药的患者在进入研究时必须采用稳定的治疗方案。适合姑息放疗的症状性病灶(例如，骨转移或引起神经碰触的转移)应在入组前进行治疗。患者应当已从放射治疗的影响中恢复。不要求最短恢复期。在进一步增长的情况下可能导致功能缺陷或顽固性疼痛的无症状性转移性病灶(例如，目前与脊髓压迫无关的硬膜外转移)，应在入组前考虑进行局部区域治疗(如果合适的话)。
·需要每28天重复引流一次以上的无法控制的胸腔积液、心包积液或腹水。允许留置引流导管(例如，
Figure BDA0003642845070001051
)。
·在研究治疗开始前，在转移情形下接受的任何抗癌疗法，无论是试验性疗法还是获得批准的疗法(包括化学疗法、激素疗法和/或放射疗法)，但以下情况除外：
o在第1周期第1天前＞1周，接受过草药疗法
o在第1周期第1天前＞2周，接受过针对疼痛转移或潜在敏感部位(例如硬膜外腔)转移的姑息放疗
o不允许既往接种过癌症疫苗(例如，T-vec)
·在第1周期第1天之前5年内，除正在研究的疾病以外的恶性肿瘤，但转移或死亡风险可忽略不计的恶性肿瘤除外(例如经充分治疗的宫颈原位癌、基底细胞或鳞状细胞皮肤癌、局部***癌或导管原位癌)
·无法控制的高钙血症(＞1.5mmol/L离子钙或Ca+2＞12mg/dL或校正后血清钙≥ULN)或需要继续使用双膦酸盐治疗的症状性高钙血症。正在接受双膦酸盐治疗或地诺单抗专门用于预防骨骼事件并且无临床显著的高钙血症病史的患者符合入组条件。
·未经手术和/或放疗进行明确治疗的脊髓压迫症，或先前经诊断和治疗的脊髓压迫症，但没有证据表明筛选前疾病在临床上稳定≥2周。
·自身免疫性疾病病史，包括但不限于***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病、与抗磷脂综合征相关的血管血栓形成、韦格纳肉芽肿、舍格林综合征、贝尔麻痹、格林巴利综合征、多发性硬化、血管炎或肾小球肾炎，但以下情况除外：
o有自身免疫性甲状腺功能减退症病史并且接受稳定剂量的甲状腺替代激素的患者可能符合入组标准。
o接受稳定胰岛素方案的1型糖尿病得到控制的患者可能符合入组标准。
o患有湿疹、银屑病、慢性单纯性苔藓或仅具有皮肤病表现的白癜风(例如，无银屑病关节炎)的患者可能符合入组标准，前提是其满足以下条件：
■皮疹的面积必须小于体表面积的10％
■疾病被良好控制在基线并且仅需要使用低效局部皮质类固醇
■在过去12个月内，未发生基础疾病的急性加重情况(例如，不需要补骨脂素加紫外线A辐射、甲氨蝶呤、类维生素A、生物制剂、口服钙调磷酸酶抑制剂、高效或口服皮质类固醇)
·在第1周期第1天前3周内接受过单胺氧化酶抑制剂(MAOI)治疗
·在第1周期第1天前2周内接受过全身性免疫抑制药物治疗(包括但不限于***≥7.5mg/天、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、沙利度胺和TNF-α拮抗剂)
o在与医学监查员讨论并获得批准后，接受过急性、低剂量、全身性免疫抑制药物(例如，用于治疗恶心的一次性剂量的***)的患者可以入组研究
o允许使用吸入性皮质类固醇(例如，用于治疗慢性阻塞性肺疾病的氟替卡松)
o允许使用口服盐皮质激素(例如，用于直立性低血压患者的氟氢可的松)
o允许使用生理剂量的皮质类固醇治疗肾上腺功能不全
·特发性肺纤维化、肺炎(包括药物引起的肺炎)、机化性肺炎(即闭塞性细支气管炎、隐源性机化性肺炎等)病史，或在筛查胸部计算机断层扫描(CT)扫描时发现活动性肺炎的证据。允许有辐射场中的放射性肺炎(纤维化)病史。
·HIV感染检测呈阳性
·活动性乙型肝炎(定义为筛选时乙型肝炎表面抗原[HBsAg]检测呈阳性)。既往发生过或已消退的乙型肝炎感染(定义为HBsAg检测阴性且针对乙型肝炎核心抗原的IgG抗体[抗HBc]呈阳性)的患者符合入组标准。必须在第1周期第1天之前获得这些患者的HBVDNA，并且必须证明无活动性感染。
·活动性丙型肝炎。HCV抗体呈阳性的患者仅在HCV RNA的聚合酶链反应(PCR)结果呈阴性时才符合入组标准。
·已知的活动性或潜伏性结核感染。如果研究者认为潜在患者感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的风险增加，则在筛选期间必须根据当地的实践标准遵循潜伏性结核诊断程序
·在第1周期第1天前4周内发生严重感染，包括但不限于因感染、菌血症或严重肺炎的并发症而住院
·最近不符合严重感染标准的感染，包括以下情况：
o在第1周期第1天前2周内出现感染的迹象或症状
o在第1周期第1天前2周内接受过口服或IV抗生素
o接受预防性抗生素(例如，用于预防***或慢性阻塞性肺疾病)的患者符合入组标准
·既往接受过同种异体骨髓移植或既往接受过实体器官移植
·在第1周期第1天之前4周内接种减毒活疫苗或预期在研究期间需要接种此类减毒活疫苗。流感疫苗只应在流感季节给予。在第1周期第1天前4周内或研究期间的任意时间以及最后一次研究治疗后5个月内，患者不得接种减毒活流感疫苗(例如，
Figure BDA0003642845070001071
)。
·已知对疫苗中的活性物质或任何赋形剂有超敏反应
·存在对嵌合或人源化抗体或融合蛋白的重度变应性、过敏或其他超敏反应史
·已知对中国仓鼠卵巢细胞产品有超敏反应
·对派姆单抗制剂成分过敏或有超敏反应
实例2：
本实例描述了用于本文所述的方法中的示例性RNA疫苗。
总体说明
RNA疫苗是一种单链信使核糖核酸(mRNA)分子，其编码恒定序列和患者特异性肿瘤新抗原序列。具体而言，它是5'加帽的单链信使RNA(mRNA)。各mRNA编码多达20个新表位，这些新表位由经过鉴定和选择的患者肿瘤特异性突变来确定。包含患者肿瘤特异性突变的序列通常由81个核苷酸组成。图3所示为mRNA的示意图(在该实例中，示出是编码10个患者特异性新表位的mRNA)。
恒定序列元件包括以下：5'帽(β-S-ARCA)；5'-非翻译区和3'-非翻译区[UTR]；分泌性信号肽[sec2.0]；MHC[主要组织相容性复合物]I类跨膜和胞质结构域[MITD]；以及poly(A)尾巴。这些恒定序列已针对mRNA的翻译效率和稳定性进行了优化并且每个批次完全相同，因此对于所有患者都相同。所有恒定序列元件的作用汇总于表4中；它们侧接患者特异性新表位区和富含甘氨酸/丝氨酸(GS)的连接基。
表4
Figure BDA0003642845070001081
Figure BDA0003642845070001091
缩写：AES＝***的氨基末端增强子；MHC＝主要组织相容性复合物；MITD＝I类MHC跨膜和胞质结构域；UTR＝非翻译区。
恒定序列说明
RNA[1,2-[m2 7·2'·OG-(5'→5')-ppsp-G(Rp异构体)]](恒定5'UTR加sec2.0，连接至恒定MITD加3'UTR和poly(A)尾巴)
序列长度：739个核苷酸(A：255个，C：204个，G：168个，U：112个)
图4所示为示例性RNA疫苗的恒定区的RNA序列。患者特异性序列的***位点(C131-A132)以粗体显示。有关RNA序列中经修饰的碱基和不常见的键，参见表5。
表5
类型 位置 说明
经修饰的碱基 G1 m<sub>2</sub><sup>7·2</sup>'<sup>·O</sup>G
不常见键 G1-G2 (5'→5')-pp<sub>s</sub>p-
不常见键 C131-A132 患者特异性序列的***位点
总之，各RNA的长度在约1000-2000个核苷酸的范围内，具体取决于每个新表位的大小和各RNA上编码的新表位的数量。RNA的恒定区(独立于患者特异性序列)构成739个核糖核苷酸。
参考文献
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序列
所有多核苷酸序列均按5'→3方向显示。所有多肽序列均按N末端至C末端方向显示。
抗PDL1抗体HVR-H1序列(SEQ ID NO:1)
GFTFSDSWIH
抗PDL1抗体HVR-H2序列(SEQ ID NO:2)
AWISPYGGSTYYADSVKG
抗PDL1抗体HVR-H3序列(SEQ ID NO:3)
RHWPGGFDY
抗PDL1抗体HVR-L1序列(SEQ ID NO:4)
RASQDVSTAVA
抗PDL1抗体HVR-L2序列(SEQ ID NO:5)
SASFLYS
抗PDL1抗体HVR-L3序列(SEQ ID NO:6)
QQYLYHPAT
抗PDL1抗体VH序列(SEQ ID NO:7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
抗PDL1抗体VL序列(SEQ ID NO:8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR
抗PDL1抗体重链序列(SEQ ID NO:9)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
抗PDL1抗体轻链序列(SEQ ID NO:10)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
纳武单抗重链序列(SEQ ID NO:11)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
纳武单抗轻链序列(SEQ ID NO:12)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
派姆单抗重链序列(SEQ ID NO:13)
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
派姆单抗轻链序列(SEQ ID NO:14)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
阿维单抗重链序列(SEQ ID NO:15)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
阿维单抗轻链序列(SEQ ID NO:16)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
德瓦鲁单抗重链序列(SEQ ID NO:17)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
德瓦鲁单抗轻链序列(SEQ ID NO:18)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
完整PCV RNA 5'恒定序列(SEQ ID NO:19)
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC
完整PCV RNA 3'恒定序列(SEQ ID NO:20)
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU
完整PCV Kozak RNA(SEQ ID NO:21)
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC
完整PCV Kozak DNA(SEQ ID NO:22)
GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC
短Kozak RNA(SEQ ID NO:23)
UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC
短Kozak DNA(SEQ ID NO:24)
TTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC
sec RNA(SEQ ID NO:25)
AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC
sec DNA(SEQ ID NO:26)
ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC
sec蛋白(SEQ ID NO:27)
MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS
MITD RNA(SEQ ID NO:28)
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC
MITD DNA(SEQ ID NO:29)
ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCC
MITD蛋白(SEQ ID NO:30)
IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA
完整PCV FI RNA(SEQ ID NO:31)
CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU
完整PCV FI DNA(SEQ ID NO:32)
CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT
F元件RNA(SEQ ID NO:33)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC
F元件DNA(SEQ ID NO:34)
CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC
I元件RNA(SEQ ID NO:35)
CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG
I元件DNA(SEQ ID NO:36)
CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG
连接RNA(SEQ ID NO:37)
GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC
连接DNA(SEQ ID NO:38)
GGCGGCTCTGGAGGAGGCGGCTCCGGAGGC
连接蛋白(SEQ ID NO:39)
GGSGGGGSGG
完整PCV DNA 5'恒定序列(SEQ ID NO:40)
GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC
完整PCV DNA 3'恒定序列(SEQ ID NO:41)
ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT
包含来自帽的5'GG的完整PCV RNA(SEQ ID NO:42)
Figure BDA0003642845070001171
序列表
<110> 健泰科生物技术公司(Genentech, Inc.)
生物泰克股份有限公司(BioNTech SE)
<120> 用PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗治疗癌症的方法
<130> 14639-20469.40
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/792,387
<151> 2019-01-14
<150> US 62/795,476
<151> 2019-01-22
<150> US 62/887,410
<151> 2019-08-15
<160> 42
<170> 用于 Windows 的 FastSEQ，4.0 版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 13
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 14
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 15
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 16
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 17
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 18
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
<211> 129
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
ggcgaacuag uauucuucug guccccacag acucagagag aacccgccac caugagagug 60
auggccccca gaacccugau ccugcugcug ucuggcgccc uggcccugac agagacaugg 120
gccggaagc 129
<210> 20
<211> 488
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
aucgugggaa uuguggcagg acuggcagug cuggccgugg uggugaucgg agccguggug 60
gcuaccguga ugugcagacg gaaguccagc ggaggcaagg gcggcagcua cagccaggcc 120
gccagcucug auagcgccca gggcagcgac gugucacuga cagccuagua acucgagcug 180
guacugcaug cacgcaaugc uagcugcccc uuucccgucc uggguacccc gagucucccc 240
cgaccucggg ucccagguau gcucccaccu ccaccugccc cacucaccac cucugcuagu 300
uccagacacc ucccaagcac gcagcaaugc agcucaaaac gcuuagccua gccacacccc 360
cacgggaaac agcagugauu aaccuuuagc aauaaacgaa aguuuaacua agcuauacua 420
accccagggu uggucaauuu cgugccagcc acaccgagac cugguccaga gucgcuagcc 480
gcgucgcu 488
<210> 21
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
ggcgaacuag uauucuucug guccccacag acucagagag aacccgccac c 51
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
ggcgaactag tattcttctg gtccccacag actcagagag aacccgccac c 51
<210> 23
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
uucuucuggu ccccacagac ucagagagaa cccgccacc 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
ttcttctggt ccccacagac tcagagagaa cccgccacc 39
<210> 25
<211> 78
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
augagaguga uggcccccag aacccugauc cugcugcugu cuggcgcccu ggcccugaca 60
gagacauggg ccggaagc 78
<210> 26
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
atgagagtga tggcccccag aaccctgatc ctgctgctgt ctggcgccct ggccctgaca 60
gagacatggg ccggaagc 78
<210> 27
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser
20 25
<210> 28
<211> 165
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
aucgugggaa uuguggcagg acuggcagug cuggccgugg uggugaucgg agccguggug 60
gcuaccguga ugugcagacg gaaguccagc ggaggcaagg gcggcagcua cagccaggcc 120
gccagcucug auagcgccca gggcagcgac gugucacuga cagcc 165
<210> 29
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
atcgtgggaa ttgtggcagg actggcagtg ctggccgtgg tggtgatcgg agccgtggtg 60
gctaccgtga tgtgcagacg gaagtccagc ggaggcaagg gcggcagcta cagccaggcc 120
gccagctctg atagcgccca gggcagcgac gtgtcactga cagcc 165
<210> 30
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile
1 5 10 15
Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly
20 25 30
Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly
35 40 45
Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala
50 55
<210> 31
<211> 317
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
cucgagcugg uacugcaugc acgcaaugcu agcugccccu uucccguccu ggguaccccg 60
agucuccccc gaccucgggu cccagguaug cucccaccuc caccugcccc acucaccacc 120
ucugcuaguu ccagacaccu cccaagcacg cagcaaugca gcucaaaacg cuuagccuag 180
ccacaccccc acgggaaaca gcagugauua accuuuagca auaaacgaaa guuuaacuaa 240
gcuauacuaa ccccaggguu ggucaauuuc gugccagcca caccgagacc ugguccagag 300
ucgcuagccg cgucgcu 317
<210> 32
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
ctggtactgc atgcacgcaa tgctagctgc ccctttcccg tcctgggtac cccgagtctc 60
ccccgacctc gggtcccagg tatgctccca cctccacctg ccccactcac cacctctgct 120
agttccagac acctcccaag cacgcagcaa tgcagctcaa aacgcttagc ctagccacac 180
ccccacggga aacagcagtg attaaccttt agcaataaac gaaagtttaa ctaagctata 240
ctaaccccag ggttggtcaa tttcgtgcca gccacaccga gacctggtcc agagtcgcta 300
gccgcgtcgc t 311
<210> 33
<211> 136
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucuc 60
ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120
aguuccagac accucc 136
<210> 34
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
ctggtactgc atgcacgcaa tgctagctgc ccctttcccg tcctgggtac cccgagtctc 60
ccccgacctc gggtcccagg tatgctccca cctccacctg ccccactcac cacctctgct 120
agttccagac acctcc 136
<210> 35
<211> 143
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60
agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120
ucaauuucgu gccagccaca ccg 143
<210> 36
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
caagcacgca gcaatgcagc tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc 60
agtgattaac ctttagcaat aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg 120
tcaatttcgt gccagccaca ccg 143
<210> 37
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
ggcggcucug gaggaggcgg cuccggaggc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
ggcggctctg gaggaggcgg ctccggaggc 30
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 40
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
ggcgaactag tattcttctg gtccccacag actcagagag aacccgccac catgagagtg 60
atggccccca gaaccctgat cctgctgctg tctggcgccc tggccctgac agagacatgg 120
gccggaagc 129
<210> 41
<211> 488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
atcgtgggaa ttgtggcagg actggcagtg ctggccgtgg tggtgatcgg agccgtggtg 60
gctaccgtga tgtgcagacg gaagtccagc ggaggcaagg gcggcagcta cagccaggcc 120
gccagctctg atagcgccca gggcagcgac gtgtcactga cagcctagta actcgagctg 180
gtactgcatg cacgcaatgc tagctgcccc tttcccgtcc tgggtacccc gagtctcccc 240
cgacctcggg tcccaggtat gctcccacct ccacctgccc cactcaccac ctctgctagt 300
tccagacacc tcccaagcac gcagcaatgc agctcaaaac gcttagccta gccacacccc 360
cacgggaaac agcagtgatt aacctttagc aataaacgaa agtttaacta agctatacta 420
accccagggt tggtcaattt cgtgccagcc acaccgagac ctggtccaga gtcgctagcc 480
gcgtcgct 488
<210> 42
<211> 740
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 1,2
<223> 通过说明书的表 5 和图 5 中所示的 (5'->5')-pp(s)p-连接
<220>
<221> misc_feature
<222> 132
<223> n = A、T、C、G 或 U
<220>
<221> misc_feature
<222> 132
<223> 以说明书中定义的多核苷酸序列存在，并且编码如说明书中所定义的
患者癌症特异性表位（例如图 3）
<400> 42
ggggcgaacu aguauucuuc ugguccccac agacucagag agaacccgcc accaugagag 60
ugauggcccc cagaacccug auccugcugc ugucuggcgc ccuggcccug acagagacau 120
gggccggaag cnaucguggg aauuguggca ggacuggcag ugcuggccgu gguggugauc 180
ggagccgugg uggcuaccgu gaugugcaga cggaagucca gcggaggcaa gggcggcagc 240
uacagccagg ccgccagcuc ugauagcgcc cagggcagcg acgugucacu gacagccuag 300
uaacucgagc ugguacugca ugcacgcaau gcuagcugcc ccuuucccgu ccuggguacc 360
ccgagucucc cccgaccucg ggucccaggu augcucccac cuccaccugc cccacucacc 420
accucugcua guuccagaca ccucccaagc acgcagcaau gcagcucaaa acgcuuagcc 480
uagccacacc cccacgggaa acagcaguga uuaaccuuua gcaauaaacg aaaguuuaac 540
uaagcuauac uaaccccagg guuggucaau uucgugccag ccacaccgag accuggucca 600
gagucgcuag ccgcgucgcu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 740

Claims (10)

1.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和RNA疫苗，其中所述RNA疫苗包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
2.一种在治疗患有癌症的人个体的方法中使用的PD-1轴结合拮抗剂，所述方法包括将有效量的所述PD-1轴结合拮抗剂与RNA疫苗联合施用于所述个体，其中所述RNA疫苗包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
3.一种在治疗患有癌症的人个体的方法中使用的RNA疫苗，所述方法包括将有效量的所述RNA疫苗与PD-1轴结合拮抗剂联合施用于所述个体，其中所述RNA疫苗包含编码一个或多个新表位的一种或多种多核苷酸，所述一个或多个新表位由存在于从所述个体获得的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变产生。
4.一种RNA分子，其在5'→3'方向上包含：
(1)5'帽；
(2)5'非翻译区(UTR)；
(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；
(4)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；
(5)3'UTR，其包含：
(a)***的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和
(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及
(6)poly(A)序列。
5.一种RNA分子，其在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:19)；和多核苷酸序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:20)。
6.一种脂质体，其包含根据权利要求4或5所述的RNA分子以及一种或多种脂质，其中所述一种或多种脂质形成包封所述RNA分子的多层结构。
7.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求4或5所述的RNA分子或根据权利要求6所述的脂质体。
8.一种DNA分子，其在5'→3'方向上包含：
(1)编码5'非翻译区(UTR)的多核苷酸序列；
(2)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；
(3)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；
(4)编码3'UTR的多核苷酸序列，所述3'UTR包含：
(a)***的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和
(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及
(5)编码poly(A)序列的多核苷酸序列。
9.一种DNA分子，其在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:40)；和多核苷酸序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:41)。
10.一种治疗个体的癌症或延缓个体的癌症进展的方法，所述方法包括依照根据权利要求1所述的方法向所述个体施用根据权利要求4或5所述的RNA分子或根据权利要求6所述的脂质体。
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