CN114958616A - 一种香樟共生真菌yafef008及其分离方法 - Google Patents

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王毅
郑元
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种香樟共生真菌YAFEF008及其分离方法，香樟共生真菌YAFEF008的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211452，真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是黄褐色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，通过实验发现，YAFEF008菌丝体初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为探究新的抗细菌药物提供新的途径，并对开发新型生物农药提供重要指导依据。

Description

一种香樟共生真菌YAFEF008及其分离方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种香樟共生真菌YAFEF008及其分离方法。
背景技术
植物共生真菌(Plant symbiotic fungi)是指生活史的特定阶段或全部阶段寄生在植物组织内，而不引起植物产生有害症状的微生物，包括菌根真菌以及生活在植物表面的内生真菌和潜伏性病原菌。研究表明，在长期共进化过程中，共生菌与宿主植物形成了特殊的生理代谢途径，产生出各种结构新颖的活性化合物，而共生菌的多样性决定了还有很多活性共生菌未被开发，因此研究共生菌的次生代谢产物，对我们开发新的抗菌药物有重要的作用，还能有效的缓解耐药菌株带来的危机。
目前内共生菌的初级代谢和次生代谢产物已成为研究热点，已经有学者在苦楝、香椿、黄芪和党参等多种植物共生菌中发现了具有抗细菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物质。植物的各个部位如叶、花、树皮和根等均含有丰富的次生代谢产物，部分次生代谢产物具有优良的抗菌活性，尤其对一些耐药性细菌具有较强的拮抗活性，如生物碱类、萜类、黄酮类和醌类等。为了杀死植物病菌或者抑制病菌活性，人们发明了抗生素和合成抗菌药物，随着抗菌药物的广泛应用，致病细菌对抗生素产生耐药性，甚至出现了多重耐药性，致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁，研究新的抗菌药物已经成为一个重大的科研命题。
香樟(Cinnamomum camphora)是樟科、樟属常绿乔木，木材及根、枝、叶可提取樟脑和樟油，供医药及香料工业用，还具有涵养水源、固土防沙和美化环境的能力。本研究通过分离筛选香樟的共生菌，得到一株具有抗菌活性的真菌 YAFEF008，通过实验发现，YAFEF008菌液体提取物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的耐药性，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一株抗细菌活性强的香樟根部共生真菌YAFEF008及其分离方法。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
本发明的一株香樟共生真菌YAFEF008，该菌株为香樟根部共生真菌 YAFEF008；保藏名称为Dothideomycetes sp.座囊菌属；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2021年11月19日；保藏编号:CCTCCM20211452。
香樟共生真菌YAFEF008，所述的香樟共生真菌YAFEF008的ITS基因序列包括SEQID No.1所示的核苷酸序列。
进一步的，本发明提供了一种菌剂，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)香樟共生真菌YAFEF008的发酵液初提物；
(b)香樟共生真菌YAFEF008细胞的超声裂解上清；
(c)香樟共生真菌YAFEF008细胞的超声裂解沉淀。
进一步的，本发明提供了一种分离香樟共生真菌YAFEF008的方法，包括以下步骤：
(1)将采集的香樟根部样品用自来水冲洗，然后转入无菌工作台进行消毒处理，消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用；
(2)在超净工作台中用已经高压灭菌的剪子或解剖刀把香樟根部切成0.5cm 大小的组织块，将组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上(PDAKAS抗细菌培养基：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素 50ug/mL)培养，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于26℃培养箱中培养，培养8d左右，期间不定期观察；
(3)将菌丝转接的到固体PDA培养基，培养15d后，对菌株进行分子鉴定，得到香樟根部共生真菌YAFEF008。
进一步的，本发明还提供了香樟共生真菌YAFEF008的发酵液初提物的制备方法，包括以下步骤：
(1)加入1mL的液体PG培养基到2mL离心管中，然后将已长成型的香樟根部共生菌YAFEF008菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中瓶中，置于恒温震荡培养箱中150r·min-1，28℃培养8d；
(2)培养物菌丝体提取：发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中按体积比1:1加入乙酸乙酯超声震荡 40min后静置12h，然后将菌液装在分液漏斗进行分层，分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得香樟根部共生菌YAFEF008培养的发酵液初提物。
进一步的，所述PG液体培养基包括如下组分：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉 5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B1 0.1g/L。
进一步的，所述PDAKAS抗细菌培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基 39g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL，所述PDA固体培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L+琼脂15g/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过分离筛选香樟根部的共生菌，得到一种新的座囊菌属(Dothideomycetes sp.)YAFEF008，真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是黄褐色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，通过实验发现，YAFEF008菌丝体初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为探究新的抗细菌药物提供新的途径。
附图说明
图1为本发明所述的YAFEF008菌丝生长情况图；
图2为本发明的YAFEF008荧光显微镜下菌丝体图；
图3为本发明的YAFEF008对蜡样芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；
图4为本发明的YAFEF008对无乳链球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组， c表示实验组；
图5为本发明的YAFEF008对短小芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；
图6为本发明的YAFEF008对大肠埃希菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组， c表示实验组；
图7为本发明的YAFEF008对鲍曼不动杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；
图8为本发明的YAFEF008对溶血性葡萄球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组；
图9本发明基于ITS构建了香樟共生真菌YAFEF008的***发育树显示图。
具体实施方式
下面本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，本发明中使用的化学物均为分析纯级别，均可以由市场购买。
实施例1
YAFEF008，该菌株为香樟根部共生真菌YAFEF008；保藏名称为Dothideomycetessp.座囊菌属；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2021年11月19日；保藏编号:CCTCCM20211452。该菌株形态如图1和图2所示，真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是黄褐色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，经过测试其效果如图3-7所示，菌株培养后的发酵液初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
实施例2
香樟共生真菌YAFEF008菌株的分离和鉴定
1、香樟共生菌的分离
将采集的香樟根部样品用自来水冲洗12h，清除样品表面的真菌或者其他微生物，然后转入无菌工作台进行消毒处理，先用1L无菌水冲洗样品，放在培养皿中用接种刀切成小段放于50mL无菌离心管中；然后用75％的乙醇浸泡1min(期间不断震荡)，倒掉乙醇后，用无菌水冲洗3次；无菌水冲洗后，倒入10mL配置好的5％H2O2，浸泡3min(期间不断震荡)，倒掉H2O2后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用。
然后在超净工作台中用已经高压灭菌的剪子或解剖刀把香樟根部切成0.5cm 大小的组织块，将组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上(PDAKAS抗细菌培养基：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素 50ug/mL)培养，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于26℃培养箱中培养，培养8d左右，期间不定期观察。
最后将培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到PDA培养基 (马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L)上培养，持续观察8～10d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到香樟共生真菌YAFEF008。
2、香樟共生菌的鉴定
(1)形态的鉴定
真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝是黄褐色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状。
(2)DNA提取
试验前先CTAB水浴65℃以上3；0mi取n香樟共生菌分离纯化培养的菌丝体于2mL的离心管中，并将离心管放到装有液氮的不锈钢罐中浸泡6min，用破碎机破碎1.5min，将菌丝体打碎；离心管中加入1mL的CTAB、20uLβ-巯基乙醇，摇匀(10min)，放到水浴锅水浴1h；水浴结束后，放入离心机离心10min·4；℃·取12上00清0r/液m，in加入1mL(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，振摇10min，离心10min(重复两次)；取上清液，加入50uLNaAc和1mL无水乙醇(-20，℃)摇匀放入-20℃冰箱沉淀1h；沉淀完离心10min，加入500uL75％酒精洗脱2次(3min/每次)，加入500uL无水乙醇洗脱1次；离心3min，弃乙醇，放置干；加入40uL洗脱缓冲剂，瞬时离心，得到真菌YAFEF008基因组DNA。
(3)ITS分析鉴定
用真菌通用引物ITS1(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1 区、5.8S区、ITS4区)序列，所得得ITS测序序列如SEQ ID No.1所示。
(4)构建发育树
基于ITS构建了香樟共生菌YAFEF008的***发育树(图8)，综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与座囊菌属(Dothideomycetes sp.)亲缘关系最近，所以将香樟共生真菌YAFEF008鉴定为座囊菌属(Dothideomycetes sp.)。
实施例3
香樟共生菌YAFEF008活性物质的提取
1、液体发酵培养
液体发酵培养基PG：乳糖15g/L，硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L，微量元素1mL/L，纯净水1L。培养基分装。
加入1mL的液体PG培养基到2mL离心管中，然后将已长成型的香樟根部共生菌YAFEF008菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎样品液取 500μL分别接种到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中瓶中，置于恒温震荡培养箱中150r·min-1，28℃培养10d；
2、培养物菌丝体提取
发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中加入乙酸乙酯(1:1)超声震荡40min后静置12h，然后将菌液装在分液漏斗进行分层，分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得香樟根部共生菌YAFEF008培养的发酵液初提物。
试验例1
香樟共生菌YAFEF008培养物的发酵液初提物的抗菌活性检测
1、致病菌的活化
将实验室保存的致病菌蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌分别取少量加入2mL离心管中，再加入700ul的LB液体培养基，然后将离心管放入37，℃转速为180r·min-1 恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，取出活化好的细菌进行稀释1/10倍。
2、阳性对照所用抗生素及配制
氨苄青霉素(Ampicillin)(批号：0339，纯度：95％)，购于昆明硕阳科技有限公司。精密称取氨苄青霉素50mg，分别置于离心管中，加入1mL DMSO溶液配置成50mg/ml的抗生素DMSO溶液，备用。
3、滤纸片法检测抗菌活性
取适量香樟共生菌YAFEF008发酵液初提物，称重后加入适量DMSO(二甲基亚砜)溶液，稀释到50mg/mL。将活化得到的致病菌液分别均匀涂抹在LB 固体培养基上，晾干后，将吸取了已溶解的香樟共生菌YAFEF008发酵液初提物的5mm的滤纸圆片放在培养基的对应标记处，并用5mm滤纸圆片蘸取DMSO 溶液和氨苄青霉素作为阴性对照，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养 12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。结果香樟共生菌YAFEF008培养物的发酵液初提物(50mg/mL)的抗细菌活性如表1所示：
表1香樟共生真菌YAFEF008初提物抗菌活性与阳性对照比较
Figure BDA0003620538350000071
如图1至图7，以及表1所示，本发明筛选得到一种香樟共生真菌 YAFEF008(座囊菌属Dothideomycetes sp.)，其菌株培养物的发酵液初提物对对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
除了通过培养菌株进行发酵液提取，其他培养或者加工方法，如香樟共生真菌YAFEF008细胞的超声裂解上清；香樟共生真菌YAFEF008细胞的超声裂解沉淀，基于真菌YAFEF008的抗菌效果下，其加工物或者培养物均具备相应的抗菌活性，使用本菌制备相关抗菌活性药物、菌剂等，均在本发明的保护范围内。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 王毅郑元
<120> 一种香樟共生真菌YAFEF008及其分离方法
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 575
<212> DNA
<213> 人工序列（ITS 基因序列）
<400> 1
cgtagtgacc gtgcggaagg atcattaccc tttcaatgca caaggatcga gcgggtgtag 60
gcaactatac cctctctcct tgctgtatta cgcccttgtt tttcaaattc tatttgtttc 120
ctcggcgggg tttcccgccg gttggataaa ctataacctt tttaattttc aatcagcgtc 180
tgaaataaat taataattac aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa 240
gaacgcagcg aaatgcgata agtagtgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300
tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca tggggcatgc ctgttcgagc gtcatttgta 360
ccttcaagct ctgcttggtg ttgggtgttt gtcctcgctc ctctggggta ggactcgcct 420
taaagtaatt ggcagccagt gttttggttt gaagcgcagc acaagtcgcg attcaagctt 480
aatcagtagc tttccataag acatctatca cttttgacct cggatcaggt agggataccc 540
gctgaactta agcatatcaa aagggggggg aaaaa 575

Claims (10)

1.香樟共生真菌YAFEF008，其特征在于，所述的香樟共生真菌YAFEF008的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的香樟共生真菌YAFEF008，其特征在于，所述共生真菌YAFEF008的保藏编号为CCTCC M 20211452。
3.根据权利要求1或2所述的香樟共生真菌YAFEF008的培养物或其加工物。
4.一种根据权利要求1或2所述的香樟共生真菌YAFEF008在制备抗细菌药物中的应用。
5.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求3所述的培养物或其加工物。
6.根据权利要求5所述的一种菌剂，其特征在于，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)香樟共生真菌YAFEF008的发酵液初提物；
(b)香樟共生真菌YAFEF008细胞的超声裂解上清；
(c)香樟共生真菌YAFEF008细胞的超声裂解沉淀。
7.一种分离权利要求1或2所述的香樟共生真菌YAFEF008的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将采集的香樟根部样品用自来水冲洗，然后转入无菌工作台进行消毒处理，消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用；
(2)在超净工作台中用已经高压灭菌的剪子或解剖刀把香樟根部切成0.5cm大小的组织块，将组织块等距离放在PDAKAS抗细菌培养基上(PDAKAS抗细菌培养基：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL)培养，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于26℃培养箱中培养，培养8d左右，期间不定期观察。
(3)将菌丝转接的到固体PDA培养基(PDA培养基：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L)，培养15d后，对菌株进行分子鉴定，得到香樟根部共生真菌YAFEF008。
8.根据权利要求6所述的一种菌剂，其特征在于，所述香樟共生真菌YAFEF008的发酵液初提物的制备方法，包括以下步骤：
(1)加入1mL的液体PDA培养基到2mL离心管中，然后将已长成型的香樟根部共生菌YAFEF008菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中瓶中，置于恒温震荡培养箱中150r·min-1，28℃培养8d；
(2)培养物菌丝体提取：发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中按体积比1:1加入乙酸乙酯超声震荡40min后静置12h，然后将菌液装在分液漏斗进行分层，分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得香樟根部共生菌YAFEF008培养的发酵液初提物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PG液体培养基包括如下组分：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B10.1g/L；所述液体PDA培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PDAKAS抗细菌培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL，所述PDA培养基包括：马铃薯粉葡萄糖琼脂培养基39g/L。
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