CN109971655B - 一株黄芪内生球毛壳菌（Chaetomium sp.）HQ-1及其应用 - Google Patents

一株黄芪内生球毛壳菌（Chaetomium sp.）HQ-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株具有较好抗菌活性的黄芪内生真菌Chaetomium sp.HQ‑1。所述黄芪内生菌HQ‑1活性产物differanisole A对G+菌金黄色葡萄球菌S.aureus,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA,单核增生李斯特菌L.monocytogenes表现出中等抑制活性。对病原真菌白绢病菌S.rolfsii表现出较强的抑制作用，说明differanisole A具有作为农用抗生素的潜力。本发明提供的黄芪内生真菌Chaetomium sp.HQ‑1可为生产抗菌药物，特别是生产抗植物病原真菌的农用抗生素提供新的资源和途径。

Description

一株黄芪内生球毛壳菌（Chaetomium sp.）HQ-1及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1及其应用。
背景技术
近年来我们对抗生素的滥用，已到了无以复加的地步。无指征、无目标、超剂量、超疗程、多联地使用抗生素，催生了超级细菌的出现。耐甲氧西林金葡菌，耐万古霉素肠球菌，多重耐药铜绿假单胞菌，产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶泛耐药肠杆科细菌等相继出现，表明细菌耐药性已成为一个日益严重的全球性公共卫生问题。
然而，抗生素的发现高潮已过去半个多世纪，如今新药研发似乎陷入了难以反弹的谷底。1983-2012年间美国FDA批准的抗细菌药种类不断减少；2013-2017 年仅有五类抗细菌药物被FDA批准，其中包括一类抗体药物；四十多年前发现的氟喹诺酮类竟是目前最新的抗革兰氏阴性菌药。新的疾病和严重的细菌耐药性不断侵蚀着人类健康的最后防线，寻找新药是全世界科学家刻不容缓的任务。
内生菌是一类非常重要的微生物资源，它们具有独特的生理和代谢机制，使其能够适应生物体内部特殊的环境，同时还能够产生多种活性物质，一直以来是天然产物学家的研究热点。
研究表明，内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分。利用植物内生菌的次生代谢物质开发新的药物将是今后医药方面的研究方向之一。
黄芪是一种传统中药，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、免疫调节等功效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1及其应用。本发明从中药植物黄芪中分离得到一株具有抗菌活性的内生菌 Chaetomium sp.HQ-1，通过液体发酵、改变培养基组分等方式，对该菌的活性代谢产物进行了研究，从中分离得到一个化合物，经高分辨质谱和核磁分析确定为 differanisole A。进一步活性实验表明该化合物具有中等的抗细菌活性和良好的抗病原真菌Selerotium rolfsii活性。本专利为研制抗细菌、抗真菌类药物提供新的资源和途径。
本发明所述的一种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1，已于2019 年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 17474。
所述黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1的菌落形态为：本发明所述的黄芪内生菌HQ-1，在PDA培养基上的菌落表面呈白色绒状、背面淡黄色，生长迅速。提取其基因组DNA，利用ITS通用引物ITS1和ITS4进行扩增分析，得到长度为532bp的单一DNA条带，提交GenBank数据库中进行Blast比对，筛选相似度最高的序列，建立***进化树，最终鉴定为球毛壳属(Chaetomium sp.)。
所述黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1的制备方法为：
(1)菌种分离：本发明提供的所述黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.) HQ-1通过组织分离法，从严格的表面消毒的药用植物黄芪的叶中分离出来。
(2)菌种发酵：本发明所述的黄芪内生菌Chaetomium sp.HQ-1，其液体发酵培养基为PD培养基和ME培养基，摇床(28℃，150r/min)振荡培养10d。采用牛津杯法对Chaetomiumsp.HQ-1的两种发酵液进行筛选。结果发现，ME 发酵液对5种病原细菌都有抑菌圈，且抑菌圈直径都比PD发酵液大，因此选择其ME培养基进一步扩大培养，分析其中活性代谢产物。
对所述黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1活性产物分离鉴定：利用 ME培养基对黄芪内生菌Chaetomium sp.HQ-1进行液体发酵培养，获得10L发酵液，发酵液经乙酸乙酯萃取，蒸干后获得5.2g粗提物。粗浸膏用200～300目硅胶层析和凝胶LH-20分离获得51mg纯的化合物。该化合物经高分辨质谱 (HR-MS)和核磁(1H NMR及13C NMR)鉴定为differanisole A。
所述化合物differanisole A的抗细菌活性：向梯度稀释的differanisole A溶液中，加入过夜培养的病原细菌，使化合物的终浓度为128，64，32，16，8，4， 2以及1μg/mL。混合物于37℃200rpm培养24h，测定该化合物对各种病原细菌的最小抑菌浓度(MIC值)。相同浓度梯度的氨苄青霉素作为阳性对照。本申请选择的细菌为3种G+菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，单核增生李斯特菌Listeriamonocytogenes以及2种G-菌大肠杆菌E.coli和肠炎沙门氏菌Salmonella entericasubsp.enterica serovar。结果表明该化合物对3种G+菌有中等的抗菌活性。
所述化合物differanisole A的抗真菌活性：采用平板扩散法向PDA平板上加入不同浓度的differanisole A，使其终浓度为128，64，32，16，8，4，2以及1μg/mL。向含有化合物的PDA平板上分别接种植物病原真菌(白绢病菌Selerotium rolfsii，串珠镰刀菌Fusariummoniliforme，层生镰刀菌Fusarium stratum以及尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum)，在不加化合物的PDA平板上接种病原菌作为对照。平板置于28℃培养6天后，测定化合物的抑菌率。结果表明化合物differanisole A 对白绢病菌S.rolfsii的抑制效果良好。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供了一株具有较好抗菌活性的黄芪内生真菌Chaetomium sp. HQ-1。
2.本发明提供的黄芪内生菌HQ-1活性产物differanisole A对G+菌金黄色葡萄球菌S.aureus，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，单核增生李斯特菌L. monocytogenes表现出中等抑制活性。
3.本发明提供的黄芪内生菌HQ-1活性产物differanisole A对病原真菌白绢病菌S.rolfsii表现出较强的抑制作用，说明differanisole A具有作为农用抗生素的潜力。
4.本发明提供的黄芪内生真菌Chaetomium sp.HQ-1可为生产抗菌药物，特别是生产抗植物病原真菌的农用抗生素提供新的资源和途径。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为黄芪内生菌HQ-1的菌落形态(PDA培养基)；
图2为黄芪内生菌HQ-1的***发育树；
图3为黄芪内生菌HQ-1的液体培养状态；
图4为化合物的1H NMR(600MHz,acetone-d6)图；
图5为化合物的13C NMR(150MHz,acetone-d6)图；
图6为化合物differanisole A的化学结构。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明提供了一种黄芪内生毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1；
本发明还提供了所述黄芪内生毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1的分离和发酵方法；
本发明还提供了这种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1在抗菌领域的应用，包括抗细菌和抗真菌领域的应用。
具体的，所述细菌包括3种G+菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，单核增生李斯特菌Listeria monocytogenes 以及2种G-菌：大肠杆菌E.coli和肠炎沙门氏菌Salmonella enterica subsp. enterica serovar。
具体的，所述真菌包括白绢病菌Selerotium rolfsii，串珠镰刀菌Fusariummoniliforme，层生镰刀菌Fusarium stratum以及尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。
实施例1:黄芪内生菌HQ-1的分离
于泰山采集健康无症状的黄芪植株，用清水冲洗干净，置于滤纸上自然风干。将黄芪叶子置于干净的培养皿中。在超净工作台中，用75％乙醇处理2min，无菌水冲洗5次，5％次氯酸钠处理3min，再用无菌水冲洗5次，最后再用75％酒精漂洗2min，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分。用无菌的刀片将叶片切成1cm2的小片，置于添加青霉素(50μg/mL)的PDA培养基中，28℃恒温培养。同时将上述经表面灭菌的材料不做任何处理直接种植于PDA培养基中，同条件培养，检查表面消毒是否彻底。培养过程中及时采用尖端菌丝挑取法，挑取材料切口处长出的形态不同的菌丝，转接到新鲜PDA培养基上进一步培养，纯化3～4次以保证所得菌落为纯培养，将此菌株命名为HQ-1。
实施例2：黄芪内生菌HQ-1的鉴定
(1)形态鉴定：
黄芪内生菌HQ-1，如图1所示。在PDA培养基上的菌落表面呈白色绒状、背面淡黄色，生长迅速。
(2)分子鉴定：
提取其基因组DNA，利用ITS通用引物ITS1和ITS4进行扩增分析，得到长度为532bp的单一DNA条带，其GenBank号为MK597925，ITS rDNA序列为：
GCTCCCTAACCATTGTGACGTTACCTAAACCGTTGCTTCGGCGGGCGGCCC CGGGGTTTACCCCCCGGGCGCCCCTGGGCCCCACCGCGGGCGCCCGCCGG AGGTCACCAAACTCTTGATAATTTATGGCCTCTCTGAGTCTTCTGTACTGAA TAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCATCAAGCCCCCGGGCTTGTGTTGGGGACCTGCGGC TGCCGCAGGCCCTGAAAAGCAGTGGCGGGCTCGCTGTCACACCGAGCGTA GTAGCATACATCTCGCTCTGGGCGTGCTGCGGGTTCCGGCCGTTAAACCAC CTTTTAACCCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAAGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
提交GenBank数据库中进行Blast比对，筛选相似度最高的典型菌株序列，建立***进化树，如图2所示，结果发现HQ-1与Chaetomium rectangulare IRAN1641C 聚在同一分支，相似度为99.44％，最终鉴定黄芪内生菌HQ-1为球毛壳属 (Chaetomium sp.)。
实施例3：黄芪内生菌HQ-1发酵及培养基筛选
挑取在PDA培养基上活化的内生真菌Chaetomium sp.HQ-1分别接种在ME 液体培养液和PD液体培养基中，摇床(28℃，150r/min)振荡培养10d。如图3所示，左图为ME培养基、右图为PD培养基，在两种液体培养基中HQ-1均形成较大球状，可产棕色物质，但ME液体培养基颜色更深。四层纱布过滤除去菌丝体，收集ME发酵液和PD发酵液。采用牛津杯法对两种发酵液进行筛选，具体步骤如下：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿 15mL，凝固后形成下层平板。以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。此外，将融化的PDA培养基冷却到55℃左右混入病原细菌(金黄色葡萄球菌S.aureus，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，单核增生李斯特菌L.monocytogenes，大肠杆菌E.coli或肠炎沙门氏菌 S.enterica subsp.entericaserovar)，将混有菌的培养基5mL加到已凝固的琼脂上凝固成为上层平板。将牛津杯从上层平板中轻轻拔出，在上层平板上形成直径8 mm的小洞。向洞中加入100μL发酵液。加满后置37℃培养16-18小时，测量抑菌圈。
表1菌株HQ-1的ME发酵液和PD发酵液对不同病原细菌的抑菌圈直径(mm)
Figure BDA0002026278320000061
根据表1结果发现，ME发酵液对5种病原细菌都有抑菌圈，且抑菌圈直径都比PD发酵液大，因此选择其ME培养基进一步扩大培养，分析其中活性代谢产物。
实施例4：黄芪内生菌HQ-1活性产物分离鉴定
利用ME培养基对黄芪内生菌Chaetomium sp.HQ-1进行液体发酵培养，每 1L的三角瓶中装有400mL发酵液，共发酵10L。发酵液经乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩蒸干后获得5.2g粗浸膏。粗浸膏用200～300目硅胶柱，以不同体积比的石油醚/丙酮混合物进行洗脱，洗脱顺序为100:1，50:1，25:1，10:1，5:1，共获得5个组分。对组分1(100:1洗脱获得)进一步用凝胶LH-20进行分离纯化，获得51mg纯的化合物。
该化合物经高分辨质谱(HR-MS)测定，分子式为C11H12Cl2O4。其1H NMR (600MHz,acetone-d6,δ,ppm,J/Hz):3.91(3H,s),3.09(2H,t,J＝8.4),1.63(2H,dt, J＝7.8,8.4),1.00(3H,t,J＝7.8)，如图4所示。13C NMR(150MHz,acetone-d6,δ, ppm):171.9,157.8,157.1,142.8,121.5,115.8,113.3,60.9,34.7,23.8,14.5，如图5 所示。鉴定为已知化合物differanisole A，其化学结构见图6。该化合物曾被证实有诱导友白血病细胞分化的功能，但没有发现其抗菌活性。
实施例5：differanisole A的抗细菌活性
向5mL的离心管中加入向梯度稀释的differanisole A溶液中，加入过夜培养的病原细菌，使化合物的终浓度为128，64，32，16，8，4，2以及1μg/mL。混合物于37℃200rpm培养24h，测定该化合物对各种病原细菌的最小抑菌浓度(MIC值)。相同浓度梯度的氨苄青霉素作为阳性对照。本申请选择的细菌为3种G+菌金黄色葡萄球菌S.aureus，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，单核增生李斯特菌L.monocytogenes以及2种G-菌大肠杆菌E.coli和肠炎沙门氏菌 S.enterica subsp.enterica serovar。
表2化合物differanisole A和氨苄青霉素对五种病原细菌的MIC值
Tested organisms Compound 1(μg/mL) Ampicillin(μg/mL)
S.aureus 128 1
MRSA 128 >128
L.monocytogenes 16 2
E.coli >128 8
S.enterica subsp.enterica serovar >128 2
根据表2结果表明该化合物(表2中化合物1)对3种G+菌有中等的抗菌活性，对L.monocytogenes的MIC值为16μg/mL，对S.aureus和MRSA的MIC 值为128μg/mL。与氨苄青霉素相比，differanisole A对MRSA的抑菌能力更强。这是首次关于differanisole A抗细菌活性的结果。
实施例6：differanisole A的抗真菌活性
采用平板扩散法：向融化的PDA平板上加入不同浓度的differanisole A，冷却使其凝固。最终化合物在PDA平板上得终浓度为128，64，32，16，8，4，2 以及1μg/mL。向含有不同浓度化合物的PDA平板上分别接种植物病原真菌(白绢病菌Selerotium rolfsii，串珠镰刀菌Fusarium moniliforme，层生镰刀菌 Fusarium stratum以及尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum)，在不加化合物的PDA 平板上接种病原菌作为对照。平板置于28℃培养6天后，根据以下公式测定化合物的抑菌率：(1–Da/Db)×100。Da为实验平板上的病原菌的直径，Db为对照平板上病原菌的直径。
表3不同浓度的differanisole A(浓度单位μg/mL)对植物病原的抑制作用
Figure BDA0002026278320000071
Figure BDA0002026278320000081
根据表3结果表明化合物differanisole A对四种植物病原菌均表现出不同程度的抑制作用，其中对白绢病菌S.rolfsii的抑制效果良好，半数抑制浓度IC50小于16μg/mL。这是首次关于differanisole A抗植物病原真菌活性的报道。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1，其特征在于，于2019年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.17474。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1的应用，其特征在于，用于研制抗细菌和抗真菌类药物，所述细菌选自金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌，所述真菌为白绢病菌。
3.根据权利要求1所述的一种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1的应用，其特征在于，用于制备化合物differanisole A。
4.根据权利要求3所述的一种黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1的应用，其特征在于，所述黄芪内生球毛壳菌(Chaetomium sp.)HQ-1用于制备化合物differanisole A包括如下步骤：利用ME培养基对黄芪内生菌Chaetomium sp.HQ-1进行液体发酵培养，获得发酵液，发酵液经乙酸乙酯萃取，蒸干后获得粗浸膏，将粗浸膏用200～300目硅胶层析和凝胶LH-20分离获得化合物differanisole A。
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