CN111004727B

CN111004727B - 一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌z1

Info

Publication number: CN111004727B
Application number: CN201911360725.0A
Authority: CN
Inventors: 李键; 龙凤; 洪滔; 林勇明; 谢安强
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111004727A

Abstract

本发明公开了一种能在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1，属于微生物领域。该内生真菌Z1的分类命名为：葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.），于2019年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；菌种保藏编号为：CGMCC NO.18817。将内生真菌Z1的菌液通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于高盐环境下木麻黄苗木的种植，能够增加木麻黄生物量。通过建立木麻黄‑内生真菌共生体系，提高木麻黄在高盐胁迫下的生长，为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为木麻黄工林经营制造生物菌肥提供数据基础和参考依据。

Description

一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1。

背景技术

盐胁迫严重影响着农作物以及林地植物的生长发育，是世界范围内主要的非生物胁迫。过量的盐分离子，如Na⁺、K⁺、Cl^-等被植物摄取后会使得植物细胞内离子浓度增高，而植物细胞内的各种生物酶只能在较狭窄范围离子浓度才具有活性，如对Na⁺离子和Cl^-离子要求低于50mM，对于K⁺离子而言则是0.1-0.2M。因此，离子浓度的改变影响生物酶活性，从而影响植物的生长。盐胁迫亦能通过影响细胞质膜的组分、透性、运输等一系列的变化，使植物细胞膜功能受损，从而在一定程度上破坏细胞的代谢以及各种生理功能。

短枝木麻黄（Casuarina equisetifolia L.）是世界各国引种最早且人工栽培面积最大的木麻黄科树种，目前也是我国华南和东南沿海最主要的造林树种。现有研究表明，木麻黄本身具有一定的耐盐能力，但其抗盐性的提高有助于发挥更大的生态作用。因此，如何增加木麻黄耐盐能力，提高生态适应性是将来研究的重点。

前人的一系列研究都表明植物内生真菌与宿主的共生体有利于宿主本身应对不利环境，同时还促进植物的生长发育，但这方面的研究大部分集中在禾草科植物，而木本植物内生真菌研究较少。从木麻黄组织中分离鉴定其内生真菌，寻找具有促生效果且具有一定耐盐性的内生真菌，建立木麻黄-内生真菌共生体系，提高木麻黄在高盐胁迫下的生长，可为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为木麻黄工林经营制造生物菌肥提供数据基础和参考依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种能在高盐环境下促进木麻黄生物量增加的内生真菌Z1，该内生真菌Z1的分类命名为：葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.），已于2019 年 11月20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏号为CGMCC NO.18817。

该内生真菌Z1在土豆葡萄糖培养基（PDA培养基）上培养时，初期菌落成白色，菌丝纺锤形生长，培养后期菌落颜色开始变深，逐渐呈墨绿色至黑色。上述内生真菌Z1葡萄座腔菌菌株是从木麻黄的种子中分离纯化得到的，其能制备成菌液，通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于高盐环境下木麻黄苗木的种植。

所述菌液的制备方法为：将所述内生真菌Z1葡萄座腔菌菌株接入液体培养基中，摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释至5.5×10⁶个•L^-1，即得。

所述液体培养基配方为：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）20.0g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0g，硫酸镁（MgSO₄•7H₂O）0.5g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。

本发明的优点在于：

所得菌株能够缓解盐胁迫条件对植株生物量的制约，能够在高盐环境下促进木麻黄植株生物量的增加。

附图说明：

图1内生真菌Z1菌丝、菌落形态图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此

实施例1 木麻黄生真菌的分离

1. 主要仪器设备

AX224ZH电子天平(OHAUS)、LS-75HD高压蒸汽灭菌锅（济南来宝医疗器械有限公司）、JB-CJ-1500FX超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）、DNP-9162恒温培养箱(上海精宏)、ZHWY2111B恒温震荡培养箱(上海智城)、Beckman超速离心机（美国）等。菌株鉴定主要仪器：FQD-48APCR扩增仪(BIOER)、EPS-100核酸电泳仪(上海天能科技)、SeqStudioDNA测序仪(美国)，研钵，冰袋，泡沫盒，移液器（Thermo），1.5ml和2mlEP管（Axygen）。

2. 主要试剂和培养基

试剂：70%酒精、次氯酸钠、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯葡萄糖(PDB)培养基、NaCl，Taq酶及PCR相关试剂、引物（ITS1/ITS4），OMEGA真菌基因组试剂盒，液氮，无水乙醇（天津大茂化学试剂厂），去离子水。

3. 内生真菌的分离

（1）采用组织分离法，将木麻黄样本根据其根、茎、叶、以及种子不同组织分成四个个部分，经流水冲洗干净阴干后于超净台内进行组织表面消毒。其操作流程为：70%酒精浸泡30s→无菌水清洗3次→10%次氯酸钠浸泡7min→无菌水清洗3次。将采集回来的木麻黄样品不同组织材料分别用手术刀切开，平放于已经灭菌过的平板培养基中后，于28︒C恒温培养箱内培养5-7天。

（2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的PDA培养基上，28℃恒温培养4~7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本组织于未使用的PDA培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培养4~7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。

4. 内生真菌的纯化

待平板培养基上的组织材料培养3~5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温培养箱内，28℃恒温避光培养4~7d。反复纯化3~4次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入斜面培养基，于4℃保存。

5. 内生真菌的筛选

（1）平板初筛：采用三点接种法，将活化后的菌株接种于含有不同浓度（1%、3%、5%、10%）NaCl的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，将菌株接种后于28︒C恒温培养7天，观察生长情况。每组实验平行三次，观察菌株生长状态，筛选在含NaCl的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长良好的菌株得到目标菌株。

6. 内生真菌的DNA提取和鉴定

（1）菌株总DNA的提取

从保存目标菌株的斜面培养基转接到平板培养基，28︒C培养一周。基因组DNA的提取采用OMEGA真菌基因组试剂盒（Fungal DNA Kit 50）进行。

（2）菌株18S rDNA的PCR扩增

利用真菌18S rDNA通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）为正、反引物，扩增其ITS序列。

ITS区域扩增选择真核生物ITS通用扩增引物ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)，PCR反应条件为预变性94︒C 5min，变性94︒C1min，退火55︒C 30s，延伸72︒C 1min，共35个循环，最后延伸72︒C10min。

PCR扩增反应采用50ul的反应体系，包括ddH₂O 40.5µl，PCR Buffer（10х，Mg⁺plus）5µl，dNTP(2.5mM)1µl，ITS1(20µM)1µl，ITS4(20µM)1µl，DNA1µl，Taq polymerase(5U/µl)0.5µl。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后交由公司进行DNA测序。获得ITS序列：SEQ ID NO.1后，在NCBI中BLAST进行同源性搜索，从中找到与该序列相似性较高的核酸序列，确定该菌株为何种菌属。

（3）菌株18S rDNA序列分析

获得序列后，在NCBI中BLAST进行同源性搜索，从中找到与该序列相似性较高（99%）的核酸序列，确定该菌株为何种菌属。初步确定Z1菌株的为葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.）。

实施例2

菌液制备：将活化后的耐盐葡萄座腔属内生真菌Z1菌株接种于60mL马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于恒温摇床上培养72h（28℃、160 r•min^-1）。用血球计数法计算孢子数量，将培养后的菌液用无菌水按十倍稀释法稀释成5.5×10⁶个•L^-1。

本试验采用土培盆栽试验，试验所选木麻黄为一年生实生苗，平均苗高为20cm，平均地径为3.0mm，由福建省惠安赤湖国有林场提供。在2017年7月3日选取长势一致的木麻黄定植于直径15cm、高10cm的塑料盆内。实验所需土壤经过混匀称量，每盆放入等量（4kg）的黄心土，该土壤中养分含量见表1。经一个月恢复性生长后，于2017年8月3日开始接菌，连续3天于木麻黄根际土壤施入100mL菌液。每种菌液处理4次重复，并以蒸馏水处理为空白对照。

NaCl胁迫：根据预备试验和有关资料，以NaCl设计了正常胁迫（0）、轻度胁迫（5%），中度胁迫（10%）和重度胁迫（15%）4个盐胁迫处理，每个处理3个重复。于2017年8月18日进行NaCl胁迫试验，在胁迫至60d时进行全部木麻黄幼苗生物量的测定。结果见表2。

由表2可见，当胁迫60d后，盐胁迫为0时，Z1菌株侵染的木麻黄地上部分鲜重显著大于未侵染植株，并且Z1侵染的植株的地下部分干重也显著大于未侵染植株(P<0.05)；轻度胁迫下，Z1侵染的木麻黄植株地上与地下部分的鲜重和干重均显著大于未侵染植株(P<0.05)；中度胁迫下，Z1侵染的植株地上和地下部分的干重均显著大于未侵染植株，其余各处理间均不存在显著差异；重度胁迫下，Z1侵染的木麻黄植株地上与地下部分的鲜重和干重均显著大于未侵染植株(P<0.05)。不同浓度NaCl处理下，Z1菌株侵染植株后，随着盐胁迫浓度增加，生物量也增加；而未被侵染的植株的生物量均波动减少。Z1菌株的侵染能够在一定胁迫浓度为下（10%）提高根冠比，从而提高木麻黄植株的生物量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 526

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

atcctcccac cctttgtgta cctacctctg ttgctttggc gggccgcggt cctccgcggc 60

cgccccctcc ccgggggtgg ccagcgcccg ccagaggacc atcaaactcc agtcagtaaa 120

cgatgcagtc tgaaaaatat tcaataaact aaaactttca acaacggatc tcttggttct 180

ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 240

tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc tttggtattc cgaagggcat gcctgttcga 300

gcgtcattac aaccctcaag ctctgcttgg tattgggcac cgtcctttgc gggcgcgcct 360

caaagacctc ggcggtggcg tcttgcctca agcgtagtag aacatacatc tcgcttcgga 420

gcgcagggcg tcgcccgccg gacgaacctt ctgaactttt ctcaaggttg acctcggatc 480

aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gaggaa 526

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> ITS1

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1，其特征在于：所述内生真菌Z1的分类命名为：葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.），于2019年11 月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；菌种保藏编号为：CGMCC NO.18817。

2.如权利要求1所述的一株在高盐环境下增加木麻黄生物量的内生真菌Z1在高盐环境下增加木麻黄生物量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将内生真菌Z1的菌液通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于高盐环境下木麻黄苗木的种植。