CN116004392B - 一种牛樟共生真菌yafef009及其分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种牛樟共生真菌YAFEF009及其分离方法，牛樟共生真菌YAFEF009的ITS基因序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211255，真菌在MY培养基上生长良好，菌丝是白色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，通过实验发现，YAFEF009菌丝体初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为探究新的抗细菌药物提供新的途径，并对开发新型生物农药提供重要指导依据。

Description

一种牛樟共生真菌YAFEF009及其分离方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种牛樟共生真菌YAFEF009及其分离方法。

背景技术

植物内生菌(Endophyte)概念一词最早泛指栖息在植物体内，包括寄生、共生和腐生的真菌、细菌、放线菌等一切微生物(Strobel et al.,2004；Strobel,2003)。植物共生真菌(Plant symbiotic fungi)是指生活史的特定阶段或全部阶段寄生在植物组织内，而不引起植物产生有害症状的微生物，包括菌根真菌以及生活在植物表面的内生真菌和潜伏性病原菌(谢泰祥等,2021)。研究表明，内共生真菌的生物学作用主要包括：提高宿主植物的抗逆性、促进宿主植物的生长发育、加速秸秤降解、天然药物来源4个方面。在长期进化过程中，共生菌与宿主植物形成了特殊的生理代谢途径，产生出各种结构新颖的活性化合物。

目前内共生菌的初级代谢和次生代谢产物已成为研究热点，已经有学者在苦楝(王雅琴等,2007)、香椿(田迪英等,2002；欧阳杰等,2008)、黄芪和党参(段琦梅等,2012)等多种植物共生菌中发现了具有抗细菌、抗氧化、抗真菌等的天然活性物质。植物的各个部位如叶、花、树皮和根等均含有丰富的次生代谢产物，部分次生代谢产物具有优良的抗菌活性，尤其对一些耐药性细菌具有较强的拮抗活性，如生物碱类、萜类、黄酮类、醌类和香豆素类等(Momin et al.,2012；Srivastava et al.,2014；Elisha et al.,2017)，为了杀死植物病菌或者抑制病菌活性，人们发明了抗生素和合成抗菌药物。随着抗菌药物的广泛应用，致病细菌对抗生素产生耐药性，甚至出现了多重耐药性，致病菌耐药性的发生和蔓延已构成对人类健康的严重威胁，研究新的抗菌药物已经成为一个重大的科研命题。

牛樟(C.kanehirai)是樟科樟属植物，常绿乔木，全株具樟脑香味，主要用于培养宿生在木材腐朽内壁的牛樟芝，是台湾特有保护植物(薛聪贤和杨宗愈,2015)。牛樟芝三萜类化合物有保护肝脏、抗肿瘤及抑菌等功能(Shi et al.,2011；Du et al.,2012；Gokilaetal.,2013)。Lin等(2018)初步分析鉴定了牛樟茎干的次生代谢产物。Wu等(2017)对牛樟和香樟完整叶绿体基因组序列及化学成分的分析。但关于牛樟共生真菌分离相关研究未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一株抗细菌活性强的牛樟根部共生真菌YAFEF009及其分离方法。

为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

本发明的一株牛樟共生真菌YAFEF009，该菌株为牛樟根部共生真菌YAFEF009；保藏名称为Gongronella sp.YAFEF009；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2021年10月11日；保藏编号:CCTCC NO:M20211255。

牛樟共生真菌YAFEF009，所述的牛樟共生真菌YAFEF009的ITS基因序列包括SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

进一步的，本发明提供了一种菌剂，其活性成分包括如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)牛樟共生真菌YAFEF009的发酵液初提物；

(b)牛樟共生真菌YAFEF009细胞的超声裂解上清；

(c)牛樟共生真菌YAFEF009细胞的超声裂解沉淀。

进一步的，本发明提供了一种分离牛樟共生真菌YAFEF009的方法，包括以下步骤：

(1)将采集的牛樟根部样品用自来水冲洗，然后转入无菌工作台进行消毒处理，消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用；

(2)用灭菌接种刀取处理好的样品，放入离心管中，加入无菌水，然后在细胞破碎匀浆机中震荡破碎，将破碎样品液稀释，取子实体悬浮液涂抹在MYKAS抗细菌培养基上，将接好的培养基放置于26℃恒温培养箱中培养5～8d；

(3)将菌丝转接的到固体MY培养基，培养8～10d后，对菌株进行分子鉴定，得到牛樟根部共生真菌YAFEF009。

进一步的，本发明还提供了牛樟共生真菌YAFEF009的发酵液初提物的制备方法，包括以下步骤：

(1)加入1mL的液体MY培养基到2mL离心管中，然后将已长成型的牛樟根部共生菌YAFEF009菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中瓶中，置于恒温震荡培养箱中150r·min -1 ，28℃培养10d；

(2)培养物菌丝体提取：发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中按体积比1:1加入乙酸乙酯超声震荡40min后静置12h，然后将菌液装在分液漏斗进行分层，分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得牛樟根部共生菌YAFEF009培养的发酵液初提物。

进一步的，所述PG液体培养基包括如下组分：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B 1 0.1g/L；所述液体MY培养基包括：酵母麦芽浸粉肉汤培养基21g/L。

进一步的，所述MYKAS抗细菌培养基包括：酵母麦芽浸粉肉汤21g/L+琼脂15g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL，所述MY培养基包括：酵母麦芽浸粉肉汤培养基21g/L+琼脂15g/L。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过分离筛选牛樟根部的共生菌，得到一种新的Gongronellasp.YAFEF009，真菌在MY培养基上生长良好，菌丝是白色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，通过实验发现，YAFEF009菌丝体初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌等细菌具有较好的抗细菌活性，能有效的缓解耐药菌株带来的危机，为探究新的抗细菌药物提供新的途径，并对开发新型生物农药提供重要指导依据。

附图说明

图1为本发明所述的YAFEF009菌丝生长情况图；

图2为本发明的YAFEF009荧光显微镜下菌丝体图；

图3为本发明的YAFEF009对蜡样芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；

图4为本发明的YAFEF009对无乳链球菌的抑制作用图。a、b、c表示对照组，d表示实验组；

图5为本发明的YAFEF009对缓慢芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；

图6为本发明的YAFEF009对枯草芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；

图7为本发明的YAFEF009对溶血性葡萄球菌的抑制作用图，a、b、c表示对照组，d表示实验组；

图8本发明基于ITS构建了牛樟共生真菌YAFEF009的***发育树显示图。

具体实施方式

下面本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，本发明中使用的化学物均为分析纯级别，均可以由市场购买。

实施例1

YAFEF009，该菌株为牛樟根部共生真菌YAFEF009；保藏名称为Gongronella sp.YAFEF009；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2021年10月11日；保藏编号:CCTCC NO:M20211255。该菌株形态如图1和图2所示，真菌在MY培养基上生长良好，菌丝是白色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状，经过测试其效果如图3-7所示，菌株培养后的发酵液初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。

实施例2

牛樟共生真菌YAFEF009菌株的分离和鉴定

1、牛樟共生菌的分离

将采集的牛樟根部样品用自来水冲洗12h，清除样品表面的真菌或者其他微生物，然后转入无菌工作台进行消毒处理，先用1L无菌水冲洗样品，放在培养皿中用接种刀切成小段放于50mL无菌离心管中；然后用75％的乙醇浸泡1min(期间不断震荡)，倒掉乙醇后，用无菌水冲洗3次；无菌水冲洗后，倒入10mL配置好的5％H 2 O 2 ，浸泡3min(期间不断震荡)，倒掉H 2 O 2 后，再用无菌水冲洗3次；将消毒后的样品用无菌滤纸吸干表面多余的水分，晾干备用。

然后用灭菌接种刀取2g牛樟根部样品放入2mL的离心管中，加入500μL的无菌水，然后在细胞破碎匀浆机中破碎，将破碎液按十分之一、百分之一、千分之一、万分之一稀释后，将200uL悬浮液涂板接种在MYKAS(抗细菌)培养基上，将接好的培养基放置于27℃恒温培养箱中培养(MYKAS抗细菌培养基：酵母麦芽浸粉肉汤21g/L+琼脂15g/L+氨苄青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/mL).

最后将培养基中长出的菌丝，在显微镜下把长出的菌丝转接的到MY培养基(酵母麦芽浸粉肉汤培养基21g/L+琼脂15g/L)上培养，持续观察8～10d后，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到牛樟共生真菌YAFEF009。

2、牛樟共生菌的鉴定

(1)形态的鉴定

真菌在MY培养基上生长良好，菌丝是白色呈放射状向周围生长，菌丝密集，且菌层较薄，菌落呈规则的圆形状。

(2)DNA提取

试验前先CTAB水浴65℃30min以上；取牛樟共生菌分离纯化培养的菌丝体于2mL的离心管中，并将离心管放到装有液氮的不锈钢罐中浸泡6min，用破碎机破碎1.5min，将菌丝体打碎；离心管中加入1mL的CTAB、20uLβ-巯基乙醇，摇匀(10min)，放到水浴锅水浴1h；水浴结束后，放入离心机离心10min·4℃·12000r/min；取上清液，加入1mL(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，振摇10min，离心10min(重复两次)；取上清液，加入50uLNaAc和1mL无水乙醇(-20℃)，摇匀放入-20℃冰箱沉淀1h；沉淀完离心10min，加入500uL75％酒精洗脱2次(3min/每次)，加入500uL无水乙醇洗脱1次；离心3min，弃乙醇，放置干；加入40uL洗脱缓冲剂，瞬时离心，得到真菌YAFEF009基因组DNA。

(3)ITS分析鉴定

用真菌通用引物ITS1(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS2区)序列，所得得ITS测序序列如SEQ ID No.1所示。

(4)构建发育树

基于ITS构建了牛樟共生菌YAFEF009的***发育树(图8)，综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与Gongronella sp.亲缘关系最近，所以将牛樟共生真菌YAFEF009鉴定为Gongronella sp.。

实施例3

牛樟共生菌YAFEF009活性物质的提取

1、液体发酵培养

液体发酵培养基PG：乳糖15g/L，硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L，微量元素1mL/L，纯净水1L。培养基分装。

加入1mL的液体MY培养基(酵母麦芽浸粉肉汤Yeast malt infusion broth21g/L)到2mL离心管中，然后将已长成型的牛樟根部共生菌YAFEF009菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中瓶中，置于恒温震荡培养箱中150r·min-1，28℃培养10d；

2、培养物菌丝体提取

发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中加入乙酸乙酯(1:1)超声震荡40min后静置12h，然后将菌液装在分液漏斗进行分层，分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得牛樟根部共生菌YAFEF009培养的发酵液初提物。

试验例1

牛樟共生菌YAFEF009培养物的发酵液初提物的抗菌活性检测

1、致病菌的活化

将实验室保存的致病菌蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌分别取少量加入2mL离心管中，再加入700ul的LB液体培养基，然后将离心管放入37℃，转速为180r·min-1恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液，置于4℃冰箱备用，取出活化好的细菌进行稀释1/10倍。

2、阳性对照所用抗生素及配制

氨苄青霉素(Ampicillin)(批号：0339，纯度：95％)，购于昆明硕阳科技有限公司。精密称取氨苄青霉素50mg，分别置于离心管中，加入1mL DMSO溶液配置成50mg/ml的抗生素DMSO溶液，备用。

3、滤纸片法检测抗菌活性

取适量牛樟共生菌YAFEF009发酵液初提物，称重后加入适量DMSO(二甲基亚砜)溶液，稀释到50mg/mL。将活化得到的致病菌液分别均匀涂抹在LB固体培养基上，晾干后，将吸取了已溶解的牛樟共生菌YAFEF009发酵液初提物的5mm的滤纸圆片放在培养基的对应标记处，并用5mm滤纸圆片蘸取DMSO溶液和氨苄青霉素作为阴性对照，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养12h，观察是否出现抑菌圈并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。结果牛樟共生菌YAFEF009培养物的发酵液初提物(50mg/mL)的抗细菌活性如表1所示：

表1牛樟共生真菌YAFEF009初提物抗菌活性与阳性对照比较

如图1至图7，以及表1所示，本发明筛选得到一种牛樟共生真菌YAFEF009Gongronella sp.，其菌株培养物的发酵液初提物对蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，致病细菌购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。

除了通过培养菌株进行发酵液提取，其他培养或者加工方法，如牛樟共生真菌YAFEF009细胞的超声裂解上清；牛樟共生真菌YAFEF009细胞的超声裂解沉淀，基于真菌YAFEF009的抗菌效果下，其加工物或者培养物均具备相应的抗菌活性，使用本菌制备相关抗菌活性药物、菌剂等，均在本发明的保护范围内。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 郑元 王毅

<120> 一种牛樟共生真菌YAFEF009及其分离方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 668

<212> DNA

<213> Gongronella sp.

<400> 1

agtcggctgt ctactgatcc gaggtcacct gggaaaatgt tgttggatac ccggctgcag 60

gccggcatcc cctcaaacgc gactttctcc aatctcccaa agcctgatct gattgtattg 120

aggtccgtct gtttttgacc tcattcccgg gaagaacaat caaccaacaa ttgacacggc 180

cttgacgaca tcaccggaaa gccttttggg tgcccataac actgaaacac gtttgccgtg 240

cgacaccctt ggatgcttca tggaatccta catttcatga ttctctaaat gcagatctga 300

ttacatatcg ggagtcgctg cgttcttctt cgatgcttaa gccgataaat gaattgttga 360

cagttgctta ttggtttcct ctctaatcaa tcaagaattt cataaaccat attgaattgc 420

gagacccaaa aaagccccac accagattgt ttccaaagac tacaactcta tgtaactaac 480

tctccaaaat tgaaactaag ctcaacttga gatcactttg aattccttca attgctaaag 540

agaaaagaag agaaattgta tcaaagaatc ccccaaaaag gagagaaact ttgcattgat 600

aatgatcctt ccgcaggttc acctacggaa accttgttac gacttttact tcctctaaat 660

gaccaaga 668

Claims (3)

1.牛樟共生真菌YAFEF009，其特征在于，所述共生真菌YAFEF009的保藏编号为CCTCCNO:M 20211255，。

2.一种菌剂，其特征在于，含牛樟共生真菌YAFEF009的发酵液初提物，所述发酵液初提物制备方法包括以下步骤：

(1)加入1mL的液体MY培养基到2mL离心管中，然后将已长成型的牛樟根部共生菌YAFEF009菌丝体刮取适量放入离心管，破碎90S，然后将破碎样品液取500μL分别接种到每个装有PG液体培养基的锥形瓶中瓶中，置于恒温震荡培养箱中150r·min -1 ，28℃培养10d；

(2)培养物菌丝体提取：发酵培养完成后，得到的真菌菌丝体及培养液，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，并在菌液中按体积比1:1加入乙酸乙酯超声震荡40min后静置12h，然后将菌液装在分液漏斗进行分层，分层的下层废液回收，上层萃取溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得牛樟根部共生菌YAFEF009培养的发酵液初提物；

所述PG液体培养基包括如下组分：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B 1 0.1g/L；所述液体MY培养基包括：酵母麦芽浸粉肉汤培养基21g/L。

3.权利要求1所述的牛樟共生真菌YAFEF009或权利要求2所述的菌剂在制备抗细菌药物中的应用，其特征在于，所述细菌为蜡样芽孢杆菌、无乳链球菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或溶血性葡萄球菌。