CN115806913A - 野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13及应用 - Google Patents

野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9‑13及其应用,属于农作物病害防治技术领域。野尻链霉菌菌株9‑13于2021年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.22798。野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9‑13对引起双孢蘑菇疣孢霉病的3种疣孢霉菌具有拮抗作用,其发酵液对3种疣孢霉菌的菌丝生长具有抑制作用,发酵液不仅对双孢蘑菇疣孢霉病具有优良的防治效果,而且对双孢蘑菇安全。

Description

野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13及应用
技术领域
本发明涉及农作物病害防治技术领域,具体为一株野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13及其应用。
背景技术
双孢蘑菇又称白蘑菇,由于其口感好,兼具营养价值和药用价值,是一种重要的食药用菌。我国是世界上最大的双孢蘑菇生产国,2013年我国的双孢蘑菇产量达到全世界总产量54%。
由丛梗孢科(Moniliaceae)疣孢霉属(Mycogone)真菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病(湿泡病)在世界范围内发生,已成为为害双孢蘑菇最主要的病害之一。目前对疣孢霉病的防治呈现出两个特点:缺少具有抗病性的双孢蘑菇商业栽培品种;疣孢霉与其寄主双孢蘑菇同属真菌,杀菌剂对两者均有抑制作用,因此评价杀菌剂药效的同时还需考虑对双孢蘑菇的安全性。
农用抗生素作为一类具有良好发展前景的生物农药,已经成为我国农药结构中不可缺少的一类品种。我国是农用抗生素生产大国和应用大国,也是农用抗生素研究开展较早的国家。早在20世纪50年代就已开始研究,只是步履缓慢,到70年代以后才取得了很大的进展。相继成功开发了井岗霉素、春雷霉素、农抗120、多抗霉素、灭瘟素、公主岭霉素、济阳霉素、莫能霉素,以及植物生长调节剂赤霉素。日本组合化学工业株式会社选出一种杀菌两用的抗生素,用50~100mg·kg-1对螨类有效,并有杀卵作用,残次期20d以上;并对稻瘟病、桃褐腐病、黄瓜和蔬菜菌核病、苹果和瓜类白粉病、草莓丝壳病、花卉灰霉病、黄瓜和烟草花叶病等均有较好的防效。由中国农科院生物防治研究所研制成功的中生霉素(克菌康)是一种新型农用抗生素,为N-糖苷类碱性水溶性物质。其生产菌为淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces 1avendulae var.hainanesis n.var.)。该菌的加工剂型是一种杀菌谱较广的保护性杀菌剂,对防治水稻、苹果、蔬菜、柑橘、生姜等作物上一些真菌性的病害均有效。
农用抗生素对人畜安全无毒,不污染环境,不破坏生态平衡,具有显著的社会效益和生态效益。
发明内容
本发明的首要目的在于针对双孢蘑菇疣孢霉病的发生阻碍了双孢蘑菇产业的安全生产,使用杀菌剂的同时还需考虑对双孢蘑菇的安全性等问题,提供一株野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13,对引起双孢蘑菇疣孢霉病的3种病原菌均有拮抗作用。
本发明的另一目的在于提供野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液在防治双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现:一株野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13,所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.22798,保藏日期:2021年6月28日。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的16s rRNA序列及rpoB基因序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在高氏一号培养基上基内菌丝软木黄色,气生菌丝白色,无可溶性色素产生。孢子丝直、柔曲、钩状、松敞与紧密螺旋形,孢子椭圆形、柱形。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的生理生化特征为:可产生黑色素,不能还原硝酸盐;能利用葡糖糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、半乳糖等;能利用丙氨酸;不能利用苏氨酸、赖氨酸和脯氨酸。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对引起双孢蘑菇疣孢霉病的有害疣孢霉(Mycogone perniciosa)、红丝疣孢霉(M.rosea)和M.xinjiangensis均具有拮抗作用。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在防治双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液的制备方法,野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13接种于ISP2液体培养基,发酵温度为26-28℃,发酵培养时间7-8d,过滤得发酵液。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液在防治双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液用于抑制双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的菌丝生长;
所述双孢蘑菇疣孢霉病病原菌为有害疣孢霉(Mycogone perniciosa)、红丝疣孢霉(M.rosea)和M.xinjiangensis。
较之现有技术而言,本发明的优点在于:野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13对引起双孢蘑菇疣孢霉病的3种病原菌均具有拮抗作用,其发酵液可以显著抑制3种疣孢霉菌的菌丝生长,制得的发酵液不仅对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果好而且对双孢蘑菇安全。
此外,野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13是从土壤中获得的,与土壤环境和谐相容,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在高氏一号培养基上的培养特征。
图2为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13与双孢蘑菇疣孢霉病的3种疣孢霉菌的对峙培养。注:A为有害疣孢霉(Mycogone perniciosa),B为红丝疣孢霉(M.rosea),C为M.xinjiangensis,CK为对照组。
图3为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液在离体条件下对双孢蘑菇疣孢霉病的3种疣孢霉菌的抑制效果。注:A为有害疣孢霉(Mycogoneperniciosa),B为红丝疣孢霉(M.rosea),C为M.xinjiangensis,CK为对照组。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明:
实施例一:野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的分离及鉴定。
1、土壤样品的采集
从江西井冈山采集土样3份,去除表面的土壤,采集5–20cm深处的土样,标记后带回实验室自然风干。
2、放线菌的分离
采用平板稀释法进行分离。将风干土样用研钵磨碎,称取样品1g悬浮于9mL无菌水中,于40℃、180rpm震荡30min后静置5min,依次稀释10倍,分别配制成10-2、10-3、10-4的悬浮液,分别吸取不同浓度的悬浮液各0.1mL加入到改良的HVA培养基(加入终浓度为100–200ppm的重铬酸钾)平板上,均匀涂布后倒置于28℃培养观察,5–7天后挑取不同的单菌落划线纯化,纯化后的菌株采用甘油法保藏于-80℃冰箱。
3、野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的鉴定
(1)形态特征观察
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在多数培养基上生长良好,都不产可溶性色素(表1)。光学显微镜下野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13孢子丝直、柔曲、钩状、松敞及紧密螺旋形,孢子椭圆形、柱形。
表1野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)9-13的培养特征
Figure BDA0003967804010000051
(2)生理生化特征
参照《链霉菌鉴定手册》中所述的方法测定野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)9-13硝酸盐还原及碳、氮源的利用等特性,结果见表2。
表2野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的生理生化特征
Figure BDA0003967804010000052
Figure BDA0003967804010000061
(3)序列分析
细菌基因组提取试剂盒提取菌株9-13基因组DNA后,分别进行16S rRNA和rpoB基因扩增,得到的序列全长分别为1412bp和859bp,将所得序列提交至GenBank数据库进行BLAST比对分析得出菌株9-13为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)。
实施例二:野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对3种疣孢霉菌的拮抗作用测定。
采用平板对峙培养法,将野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对有害疣孢霉、红丝疣孢霉及M.xinjiangensis进行拮抗测定。首先在PDA培养基靠边缘两侧划线接种野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13,3d后在平板中央接入直径5mm供试病原菌菌饼,25℃下培养5d测量野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对供试病原菌的抑菌带宽度和病原菌直径(表3),以不接拮抗菌的供试病原菌为对照。结果表明,野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对有害疣孢霉、红丝疣孢霉和M.xinjiangensis均具有非常强的拮抗作用(图2)。
表3野尻链霉菌菌株9-13对3种疣孢霉菌的拮抗作用
Figure BDA0003967804010000062
实施例三:野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液对3种疣孢霉菌的抑制作用。
将高氏一号培养基活化的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的孢子接入ISP2液体培养基中,发酵温度为26-28℃,发酵时间7-8d,过滤得发酵液,然后0.22μm微孔滤膜除菌,备用。
取野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液5mL加入到50mLPDA培养基中,混匀后倒入培养皿中,将直径5mm供试病原菌菌饼接入PDA培养基平板中央,置于25℃下培养5d后测量菌落直径。以空白PDA培养基为对照,计算发酵液对3种疣孢霉菌的菌丝生长的抑制率(表4)。结果表明野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液对有害疣孢霉、红丝疣孢霉和M.xinjiangensis的菌丝生长均具有较强的抑制效果(图3)。
表4野尻链霉菌菌株9-13发酵液对3种疣孢霉菌的菌丝生长的抑制作用
Figure BDA0003967804010000071
实施例四:野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液在防治双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
供试的有害疣孢霉、红丝疣孢霉和M.xinjiangensis 25℃培养5d,用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼,将菌饼转入PDB液体培养基中,于150r/min、25℃黑暗振荡培养7d,用血球计数板检测厚垣孢子浓度,制成浓度为1×105个孢子/mL的孢子混合悬浮液,备用。
试验地点选择在福建省福州市埔党村,双孢蘑菇品种为W192。试验设置3个处理,分别为:A.50%咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米、B.野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液、C.清水对照。每处理4次重复,共计12个小区,随机区组排列,每小区4m2。将供试浓度药液定量喷施于待覆土的定量土粒上(每平方米菇床覆盖用土约25kg,喷施药液1.5L),拌匀,保持土壤含水量约70%,用塑料膜覆盖闷土24h后进行覆土,然后每小区接种上述的孢子混合悬浮液100mL。于覆土7d后分别进行第二次施药,将相同剂量药液均匀喷施于床面土粒上,以土粒湿润且不流进菌料内为度。从采收第一潮菇起开始调查,共调查3潮菇,采取全小区调查方式,于每次采收时调查记录培养料上病菇菇粒数或菌团数(菇粒或菌团≥1cm),累计各小区的发病菇粒数,计算防治效果。
防治效果(%)=[(对照区病菇数—处理区病菇数)/对照区病菇数]×100
表5野尻链霉菌菌株9-13的发酵液防治双孢蘑菇疣孢霉病田间药效试验
Figure BDA0003967804010000081
实验结果表明,A.50%咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米、B.野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13的发酵液对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果分别为77.53%和75.62%,均对双孢蘑菇安全,未见药害。野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果在5%显著水平上及1%极显著水平上与50%咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米防效差异均不显著。由此可见,野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13的发酵液对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果与50%咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米防效相当,具备良好的应用前景。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的16s rRNA序列及rpoB基因序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1
TGCGGCGTGCTTACCATGCAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGGGGTCGCATGATCTCCGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCGTGGAGACACGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAATCGTCGAAGG
SEQ ID NO:2
GTACGGCTAAAAAAGCGCGCCTGTCGGCGCTGGGCCCCGGCGGTCTGTCCCGTGAGCGGGCCGGCTTCGAGGTCCGTGACGTTCACCCGTCGCACTACGGCCGCATGTGCCCGATCGAGACCCCTGAAGGCCCGAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTCGCCTCCTACGGTCGCGTCAACGCGTTCGGTTTCGTCGAGACCCCGTACCGCAAGGTCATCGACGGTGTCGTCACCGACGAGGTCGACTACCTGACGGCCGACGAGGAAGACCGCTTCGTCATCGCCCAGGCCAACGCCGGCCTGTCCGAGGACATGCGCTTCACCGAGAACCGCGTGCTGGTGCGCCGTCGTGGCGGCGAGATCGACTACATCGCCGGCGACGACGTCGACTACATGGACGTCTCCCCGCGCCAGATGGTGTCCGTCGCGACCGCGATGATCCCCTTCCTGGAGCACGACGACGCCAACCGTGCCCTCATGGGCGCGAACATGATGCGCCAGGCCGTTCCGCTCATCAAGGCGGAGGCCCCGCTCGTCGGCACCGGCATGGAGTACCGCTGTGCGGTCGACGCCGGTGACTCGATCCGTGCGGAGAAGGACGGTGTCGTCCAGGAGGTCTCGGCCGACTACATCACCGTCGCCAACGACGACGGCACGTACACCACGTACCGCGTCGCCAAGTTCTCCCGCTCGAACCAGGGCACCTCGGTCAACCAGAAGGTCATCGTCAACGAGGGTGACCGGATCATCGAGTCCCAGGTCCTCGCCGACGGTCCCGCGACCGAAGAGGGCGAAATGG
CCCTCGGCAAGAACCTGCTCGTCGCGTTCATGCCGTGGGAGGGCCCAACT
TATACAAAGGA。

Claims (7)

1.一株野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13,其特征在于:
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.22798,保藏日期:2021年6月28日。
2.根据权利要求1所述的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13,其特征在于:
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对引起双孢蘑菇疣孢霉病的有害疣孢霉(Mycogone perniciosa)、红丝疣孢霉(M.rosea)和M.xinjiangensis均具有拮抗作用。
3.如权利要求1所述的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在防治双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
4.如权利要求1所述的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液的制备方法,其特征在于:野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13接种于ISP2液体培养基,发酵温度为26-28℃,发酵培养时间7-8d,过滤得发酵液。
5.一种如权利要求4制备方法所得的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液。
6.如权利要求5所述的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液的应用,其特征在于:野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液在防治双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
7.根据权利要求6所述的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液的应用,其特征在于:
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液用于抑制双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的菌丝生长;
所述双孢蘑菇疣孢霉病病原菌为有害疣孢霉(Mycogone perniciosa)、红丝疣孢霉(M.rosea)和M.xinjiangensis。
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