CN114467978B

CN114467978B - 刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用

Info

Publication number: CN114467978B
Application number: CN202210249069.2A
Authority: CN
Inventors: 姜于兰; 张洪
Original assignee: GUIZHOU ACADEMY OF TESTING AND ANALYSIS; Guizhou University
Current assignee: GUIZHOU ACADEMY OF TESTING AND ANALYSIS; Guizhou University
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-03-14
Also published as: CN114467978A

Abstract

本发明公开了一种刺梨内生真菌及其代谢产物在广谱抗菌剂中的应用及制备，所述代谢产物由Epicoccum latusicollum经发酵，过滤，弃去菌丝体，发酵液采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至恒重，获得刺梨内生真菌代谢产物，即为广谱抗菌剂。本发明提供一株刺梨内生真菌及其代谢产物对Lasiodiplodia theobromae、Botryosphaeria dothidea、Colletotrichum capsici、Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、Sclerotinia sclerotiorum、Talaromyces kabodanensis、Pseudomonas syringae pv.actinidiae、Pantoea agglomerans、Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa的最低抑菌浓度分别为1.25、2.50、10.00、1.25、10.00、1.25、1.25、0.31、1.25、5.00、0.62、2.50和2.50 mg/mL。通过微生物发酵获得具有广谱抗菌活性的成分，工艺简单，安全，环保。

Description

刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物的应用，特别涉及一种刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用。

背景技术

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物体内细胞中或在其生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害的一类真菌。近年来，已经从植物内生真菌中发现了许多具有强效抗病原真菌、抗病原细菌、杀虫、抗氧化、细胞毒性和抗癌特性的次生代谢产物。内生真菌不仅可以产生植物激素以促进宿主植物的生长，产生生物活性化合物以增加植物对环境胁迫的抵抗力，还可以促进植物最初产生的次生代谢产物的积累，包括药物成分。刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)以富含维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和类黄酮而著称。在传统医学刺梨主要以根、叶及果实入药，用于治疗消食、痢疾、高血压、维生素C缺乏症等疾病，其药理作用在《本草纲目拾遗》中有详实记载。现代药理学研究表明从刺梨中提取的多种植物化学成分还具有抗真菌、抗细菌、抗氧化、调节机体免疫功能、预防和治疗2型糖尿病等生物活性。由于刺梨是一种抗菌化合物的植物来源，因此，它也是一种筛选抗菌潜力内生真菌的理想资源。从刺梨中分离内生真菌，寻找具有潜在生物活性的内生真菌，以开发生物活性天然产物。

发明内容

本发明目的是提供一种刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum及其代谢产物在制备广谱抗菌剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum及其代谢产物在广谱抗菌剂中的应用，刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum，保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，生物保藏号：CGMCC NO.40110，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，请求保***对其培养物指定的名称、株号或符号：Epicoccum latusicollumHGUP191049。

所述刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum HGUP191049菌落是白色、絮状、圆形、浅灰色，靠近中心有浅红色的色素沉淀。

刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum及其代谢产物在广谱抗菌剂中的应用，所述所述的广谱抗菌剂对应为可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和Talaromyces kabodanensis抗真菌剂，以及丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠肝菌(Escherichia coli)和铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)抗细菌剂。

所述的刺梨内生真菌代谢产物的制备方法是，将刺梨内生真菌Epicoccumlatusicollum经发酵培养获得培养液，通过抽滤或高速离心将培养液分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体；发酵液采用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得Epicoccumlatusicollum代谢产物，即为广谱抗菌剂。

所述的刺梨内生真菌代谢产物的制备方法是：将刺梨内生真菌Epicoccumlatusicollum经发酵培养获得培养液，通过抽滤或高速离心将培养液分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体；发酵液采用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得Epicoccumlatusicollum HGUP191049代谢产物：将刺梨内生真菌Epicoccum latusicollumHGUP191049接种于PDB发酵培养基中，28±1℃，160～220r/min培养5～14d，获得培养液，通过抽滤或高速离心(10000～12000r/min)将培养液分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体。发酵液采用乙酸乙酯萃取(体积比1:1～1:2)，重复萃取3次，35～55℃减压浓缩至恒重，获得Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物，即为广谱抗菌剂。所述培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH自然。

更进一步，所述刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum发酵前先活化培养，然后直接(或4℃低温保存5～30d后)接入发酵培养基。所述活化培养为：将Epicoccumlatusicollum HGUP191049接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，28±1℃，培养3～7d。所述PDA培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH自然。

与现有技术相比，本发明提供一种刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum，通过微生物发酵得到广谱抗菌活性成分，Epicoccum latusicollum代谢产物可作为广谱抗菌剂，经过试验，对可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、Talaromyces kabodanensis、丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠肝菌(Escherichiacoli)和铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的最低抑菌浓度分别为1.25、2.50、10.00、1.25、10.00、1.25、1.25、0.31、1.25、5.00、0.62、2.50和2.50mg/mL。因其成分天然，而天然成分的广谱抗菌剂是未来市场趋势，工艺简单，安全，环保，试验结果见图4和图5。

附图说明

图1为菌株HGUP191049的菌落形态(正反面)；

图2为菌株HGUP191049的***发育树；图2基于多基因(ITS、LSU、TUB和RPB2)序列使用最大似然法构建的***发育树。最大似然法自展支持率(ML≥50％)和贝叶斯后验概率(PP≥0.90)标注于节点附近(ML/PP)。Epicoccum latusicollum HGUP191049.1、Epicoccumlatusicollum HGUP191049.2与Epicoccum latusicollum HGUP191049.3分别代表Epicoccum latusicollum HGUP191049的3次独立测序结果。T：模式菌株。

图3为菌株HGUP191049发酵5～14d的培养液；

图4为Epicoccum latusicollum发酵物乙酸乙酯萃取相的抗真菌活性图片；

图中A为Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物(20mg/mL)，B为多菌灵阳性对照(20mg/mL)，C为二甲基亚砜(DMSO)阴性对照。1为抑制可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)；2为抑制葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)；3为辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)；4为抑制水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；5为抑制尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)；6为抑制核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，7为抑制Talaromyces kabodanensis。

图5为Epicoccum latusicollum发酵物乙酸乙酯萃取相的抗细菌活性图片；

图中A为Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物(20mg/mL)，B为硫酸链霉素或青霉素钠(20mg/mL)阳性对照，C为二甲基亚砜(DMSO)阴性对照。1为丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)；2为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)；3为金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；4为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；5为大肠肝菌(Escherichia coli)；6为铜绿色假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum于2022年3月6日寄出至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，请求保***对其培养物指定的名称、株号或符号：Epicoccum latusicollumHGUP191049。

刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum，保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，生物保藏号：CGMCC NO.40110，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，请求保***对其培养物指定的名称、株号或符号：Epicoccumlatusicollum HGUP191049

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述刺梨(学名：Rosa roxburghii Tratt.)是蔷薇科蔷薇属落叶灌木。果实被誉为水果中的“Vc之王”。

实施例1：

所用材料双蒸水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有杂质，无细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。所述无菌双蒸水是双蒸水经过高压蒸汽灭菌锅进行灭菌获得，条件为121℃，15～30分钟。

1.植物样本采集：新鲜健康的刺梨组织(根、茎、叶、花、果实和种子)样本采集于贵州省贵阳市修文县、贵州省六盘水市盘州市。所有样品立即送到实验室，并储存于4℃冰箱。样本组织在采集后48小时内完成内生真菌分离。

2.内生真菌分离：所有组织在自来水下冲洗30分钟，用双蒸水冲洗10分钟，在自然条件下晾干。然后将组织切成小块，转移到超净工作台进行表面消毒。所有样品用75％的乙醇进行表面消毒(1分钟)，并用无菌双蒸水漂洗3次。随后用次氯酸钠水溶液(1％有效氯)进行表面消毒(根和果实，2分钟；茎和种子，3分钟；叶和花，1分钟)，再用无菌双蒸水漂洗3次。漂洗后，用无菌滤纸吸干组织的表面水，转移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。为了避免细菌污染，在PDA培养基中加入30μg/mL链霉素。每个培养板包含3～5个组织片段，28±1℃培养3～7天后，将菌丝传代到新鲜的PDA平板上，以获得内生真菌纯培养物。采用3种方法检测表面消毒效果以确保所分离的菌株全部为刺梨内生真菌：(1)在超净工作台中，放置PDA培养基的无菌平板作为空白对照1，用于检查超净工作台的洁净程度；(2)将最终漂洗液100μL接种于PDA培养基的无菌平板作为空白对照2，用于漂洗液的检查；(3)将表面消毒后的刺梨组织，置于PDA培养基的无菌平板中滚动一圈，放置20分钟后取出，作为空白对照3，该对照为植物组织印迹法筛选无菌的组织块。PDA培养基组成：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。

3.DNA提取：用灭过菌的手术刀刮取1～3周的纯培养物菌丝体50mg，利用真菌DNA试剂盒Fungal gDNA Kit GD2416(Biomiga公司生产)，按其说明书提取真菌DNA。DNA产物置于-20℃冰箱保存备用。

4.PCR扩增：用多聚核苷酸链式反应(PCR)的方法来扩增核糖体内转录间隔区(ITS)(ITS4/ITS5)、核糖体大亚基rDNA(LSU)(LR5/LR0R)、β-微管蛋白基因(TUB)(Bt2a/Bt2b)和RNA聚合酶II第二大亚基基因(RPB2)(fRPB2-5F/fRPB2-7cR)，共4个基因片段。

ITS扩增引物为ITS4(5′-TCCTCCgCTTATTgATATgC-3′)和

ITS55′-ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg-3′)；LSU扩增引物为LR5

(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)和LR0R(5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′)；TUB扩增引物为Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和Bt2b

(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)；RPB2扩增引物为fRPB2-5F

(5′-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3′)，fRPB2-7cR(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′)，其中M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T。

反应体系为：DNA模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、PCRMix 12.5μL、ddH2O9.5μL。

PCR扩增程序：ITS和LSU为94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。TUB为95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。RPB2为94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸65s，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。

5.PCR反应产物确认：取5μL PCR产物与1μL DAN Green染料混合后点样于1.2％琼脂糖凝胶，110V条件下电泳15min，于凝胶成像***中观察条带，如条带清晰，则初步判断扩增成功。

6.PCR反应产物测序：将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测

序，菌株HGUP191049的ITS、LSU、TUB和RPB2序列见SEQ ID NO.1所示。

7.数据分析：用Blast比对将菌株HGUP191049的序列与GenBank中的序列进行同源性比对，BLAST检索表明，菌株HGUP191049的ITS序列可能为Epicoccum属，通过查阅最新参考文献，绘制多基因***发育树见图2所示。由图2可知，根据基因亲缘性对比确定菌株HGUP191049为Epicoccum latusicollum，保藏于贵州大学农学院植物病理学实验室，保藏编号为GUCC 191049，等同于本发明中的HGUP191049，保藏日期为2020年4月25日，地址为中国贵阳，贵州大学，邮编550025；同时刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum，保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，生物保藏号：CGMCC NO.40110，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，请求保***对其培养物指定的名称、株号或符号：Epicoccum latusicollum HGUP191049。

实施例2：刺梨内生菌代谢产物的分离

1.菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的Epicoccum latusicollum HGUP191049接种于PDA培养基中，置于28±1℃恒温培养箱中培养3～7d。

2.刺梨内生菌代谢产物的制备：在超净工作台中，用无菌打孔器将步骤1的HGUP191049菌株沿着菌落边缘打直径为6mm的菌饼，接种于含100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，28±1℃，220r/min培养5～14d。取发酵完成的培养液，通过抽滤或高速离心(10000～12000r/min)将培养液分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体。发酵液采用乙酸乙酯萃取(体积比1:1～1:2)，重复萃取3次，35～55℃减压浓缩至恒重，获得Epicoccumlatusicollum HGUP191049代谢产物，-20℃保存。

所述发酵培养基组成：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH自然。采用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，灭菌条件为121℃，15min.

3.抗真菌试验如下：

供试真菌活化：将植物病原真菌可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和Talaromyces kabodanensis在超净工作台中接种于PDA培养基，28±1℃恒温培养箱中培养3～7d，作为供试真菌。

称取步骤2获得的Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物20mg，溶于1mLDMSO中，配置20mg/mL的储备液，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后备用。采用滤纸片扩散法进行抗真菌试验：将滤纸用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，121℃，30min高温灭菌后备用。在超净工作台上，将供试菌的菌饼(直径：6mm)接种到PDA平板(直径：9cm)上，距离边缘2cm。并将无菌滤纸片以相等的距离放在平板的另一边缘，然后用10μL代谢产物(20mg/mL)浸渍滤纸片。DMSO和多菌灵水溶液(20mg/mL)分别作为阴性和阳性对照。所有平板在28℃下培养2～7d，测量阴性对照平板菌丝径向生长半径R1和含有代谢产物的实验平板菌丝径向生长半径(R2)，抑制率(％)＝(R1-R2)/R1×100％。抑制率越大，说明对供试菌的抑菌效果越好。

PDA培养基组成：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。

4.抗细菌试验如下：

供试菌活化：在超净工作台中，将丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠肝菌(Escherichiacoli)和铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)通过划线接种于营养琼脂(NA)培养基，丁香假单胞猕猴桃致病变种和成团泛菌25℃恒温培养箱中培养48h后，挑取单菌落接种于LB培养基中，220r/min，25℃培养12～24h，作为供试细菌；金黃葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠肝菌和铜绿色假单胞菌37℃恒温培养箱中培养48h后，挑取单菌落接种于LB培养基中，220r/min，37℃培养12～24h，作为供试细菌。

称取步骤2获得的Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物20mg，溶于1mLDMSO中，配置20mg/mL的储备液，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后备用。采用滤纸片扩散法进行抗细菌试验：将滤纸用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，121℃，30min高温灭菌后备用。在超净工作台上，将供试细菌菌悬液，迅速加入到尚未凝固的NA培养基(45～55℃)中，每100mL NA培养基加10mL供试细菌菌悬液，摇匀后迅速倒入平板中，冷却后得到不同供试细菌的培养基。将无菌滤纸片(直径：6mm)置于供试细菌的NA板中心，然后用10μL代谢产物(20mg/mL)浸渍滤纸片。DMSO作为阴性对照，硫酸链霉素水溶液或青霉素钠溶液(均为20mg/mL)作为阳性对照。含丁香假单胞猕猴桃致病变种和成团泛菌的平板置于25℃恒温培养箱，含金黃葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠肝菌和铜绿色假单胞菌的平板置于37℃恒温培养箱，培养24～48h后，观察Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物对供试细菌的抑制效果，各处理组抑菌圈直径见表1和图4。当抑菌圈直径大于8mm，说明该菌株发酵液中含有抗细菌活性成分，抑菌圈直径越大，说明对供试细菌的抑菌效果越好。

NA培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.3±0.1。

LB培养基组成：蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠10.0g，pH值7.0。

5.抗真菌试验结果：Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物抗真菌活性见图4和表1。

表1

6.抗细菌试验结果：Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物抗细菌活性见图5和表2。

表2

实施例3：刺梨内生真菌代谢产物对可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和Talaromyces kabodanensis抑制能力的测定。

刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物对可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和Talaromyces kabodanensis最低抑制浓度的测定。

供试菌活化：将植物病原真菌可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和Talaromyces kabodanensis在超净工作台中接种于PDA培养基，28±1℃恒温培养箱中培养3～7d，作为供试菌。

称取步骤2获得的Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物20mg，溶于1mLDMSO中，配置20mg/mL的储备液，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用DMSO依次稀释为不同浓度的代谢产物(10.00，5.00，2.50，1.25，0.62，0.31mg/mL)。将滤纸用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，121℃，30min高温灭菌后备用。在超净工作台上，将供试菌的菌饼(直径：6mm)接种到PDA平板(直径：9cm)上，距离边缘2cm。并将无菌滤纸片以相等的距离放在平板的另一边缘，然后用10μL不同浓度代谢产物浸渍滤纸片。DMSO作为阴性对照。所有平板在28℃下培养2～7d，测量阴性对照平板菌丝径向生长半径R1和含有代谢产物的实验平板菌丝径向生长半径(R2)，抑制率(％)＝(R1-R2)/R1×100％。抑制率接近于0，则说明没有抑菌效果，即为最低抑菌浓度，重复三次。试验结果见表3。

表3

实施例4：刺梨内生真菌代谢产物对丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠肝菌(Escherichiacoli)和铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)抑制能力的测定。

刺梨内生真菌Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物对丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠肝菌(Escherichia coli)和铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)最低抑制浓度的测定。

供试细菌活化：在超净工作台中，将丁香假单胞猕猴桃致病变种、成团泛菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠肝菌和铜绿色假单胞菌通过划线接种于营养琼脂(NA)培养基，丁香假单胞猕猴桃致病变种和成团泛菌25℃恒温培养箱中培养48h后，挑取单菌落接种于LB培养基中，220r/min，25℃培养12～24h，作为供试细菌；金黃葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠肝菌和铜绿色假单胞菌37℃恒温培养箱中培养48h后，挑取单菌落接种于LB培养基中，220r/min，37℃培养12～24h，作为供试细菌。

称取步骤2获得的Epicoccum latusicollum HGUP191049代谢产物20mg，溶于1mLDMSO中，配置20mg/mL的储备液，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用DMSO依次稀释为不同浓度的代谢产物(10.00，5.00，2.50，1.25，0.62，0.31mg/mL)。将滤纸用打孔器制成直径为6mm的圆形滤纸片，121℃，30min高温灭菌后备用。在超净工作台上，将供试细菌菌悬液，迅速加入到尚未凝固的NA培养基(45～55℃)中，每100mL NA培养基加10mL供试细菌菌悬液，摇匀后迅速倒入平板中，冷却后得到不同供试细菌的培养基。将无菌滤纸片(直径：6mm)置于供试细菌的NA板中心，然后用10μL代谢产物(20mg/mL)浸渍滤纸片。DMSO作为阴性对照，硫酸链霉素水溶液或青霉素钠溶液(均为20mg/mL)作为阳性对照。含丁香假单胞猕猴桃致病变种和成团泛菌的平板置于25℃恒温培养箱，含金黃葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠肝菌和铜绿色假单胞菌的平板置于37℃恒温培养箱，培养24～48h后，观察Epicoccum latusicollumHGUP191049代谢产物对供试细菌的抑制效果。抑菌圈直径小于等于8mm，则说明没有抑菌效果，重复三次。试验结果见表4。

表4

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序列表

<110> 贵州大学，贵州省分析测试研究院

<120> 一种刺梨内生真菌Epicoccumlatusicollum及在制备广谱抗真菌剂中的应用

<130> 2022

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 530

<212> DNA

<213> Epicoccum latusicollum

<400> 1

tatggggtcg tactgatcga ggtcagagtg taaaaatgta cttttggatg tcgtcgtcat 60

gagtgcaaag cgcgagatgt actgcgctcc gaaatcaata cgccggctgc caattgtttt 120

aaggcgagtc tacaggagac aaacacccaa caccaagcag agcttgaagg tacaaatgac 180

gctcgaacag gcatgcccca tggaatacca aggggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat 240

gattcactga attctgcaat tcacactact tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg 300

ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt gtaactatta agttttttca gacgctgatt 360

tcaactgcaa agggtttaaa tttgtccaat cggtgggcga acccaccgag gaaacgtaag 420

gtactcaaaa gacatgggta agagatagca ggcaaagcct acaactctag gtaatgatcc 480

ttccgcaggt tcacctacgg aaaccttgtt acgattttta cttccactcg 530

<210> 2

<211> 844

<212> DNA

<213> Epicoccum latusicollum

<400> 2

cgattagtct ttcgccccta tgcccaaatt tgacgatcga tttgcacgtc agaaccgctg 60

cgagcctcca ccagagtttc ctctggcttc accctattca agcatagttc accatctttc 120

gggtcccaac agctatgctc ttactcaaat ccatccgaag acatcaggat cggtcgatgg 180

tgcaccccga aaggttccca cctccgttca ctttcattac gcgctcgggc ttgacaccca 240

aacactcgca tagatgttag actccttggt ccgtgtttca agacgggccg cttacagcca 300

ttacgccagc atcctagcag atgcgcggac ctcagtccgg gctggttgca tgtcgtctcc 360

cctataagtt ctccccgaga ggaggtacat gacagagacc tttatccaac cgcccaaact 420

gatgctggcc tgcccgtaga agagtgcacc gggtaaaaac ccggatgagc aactacaggc 480

aagtctggct gcaagcgctt ccctttcaac aatttcacgt gctttttaac tctctttcca 540

aagtgctttt catctttcga tcactctact tgtgcgctat cggtctctgg ccagtattta 600

gctttagaag aaatttacct cccatttaga gctgcattcc caaacaactc gactcgtcga 660

aggggcttta cacggtagag gctagcgacc acgtacggga ttctcaccct ctgtgacgtc 720

ctgttccaag gaacttggac cgctgccaat gccaaagcgc cctctgcaaa ttacaactcg 780

gacgccaaag acgccagatt tcaaatttga gctgttgccg cttcactcgc cgttactagg 840

gcaa 844

<210> 3

<211> 334

<212> DNA

<213> Epicoccum latusicollum

<400> 3

cctcagtgta gtgacccttg gcccagttgt taccagcacc agactggccg aagacgaagt 60

tgtcgggacg gaagaagctg accgaaggga ccagcgcgga cagcgtccat tgtgccgggc 120

tccaaatcga cgaggacggc acggggaacg aacttgttgc cagaggcctg tggaaggtca 180

gcactcgcag tccgtctatg ggaagagtgt catttctagt acctcgttga agtagacgtt 240

catgcgctcg agctggaggt ccgaggtgcc gttgtagaca ccggagccgt cgaggccatg 300

ctcgccggag atggtctgcc agaaagcagc accg 334

<210> 4

<211> 866

<212> DNA

<213> Epicoccum latusicollum

<400> 4

cagtgttgac agatacactt acgcatccac attatcgcat ttgcgccgta cgaatacacc 60

agtcggccgt gacggcaagc tcgcaaagcc ccgccaattg cacaacagtc attggggtct 120

cgtgtgcccc gctgagacgc ctgaagggca agcctgtggt cttgtcaaga acttgtctct 180

gatgtgctac gtcagtgtcg gcagtgatgc cgggcccatt tctgatttca tgagccagcg 240

aaacatgcag ctactcgagg agtacgatca aaatcagaat cccgatgcta ccaaggtttt 300

cgtcaacggt gtttgggtcg gtgtgcattc caacgcacag cagcttgtct ccacagtgca 360

ggaattgcgt cgtaatggaa cactgtccta tgagatgagt ttgatccgtg acatccgtga 420

ccgagagttc aagatcttca cggacgctgg acgtgtcatg agaccacttt tcgtggtgga 480

gagcgatgtt cgcaagccaa accgcaacca tctcgtcttc agccaagagc actacaacaa 540

gctggttgaa gagcagcagg cgatggcaca agcaggcata ggcgaggagg agaagacaga 600

actctcttat ggctggaagg gtctaattca agacggtgtc attgaatatc ttgacgccga 660

agaagaggag actgccatga ttgtcatgtc acccgaggac ctcggtgagt ggcgcgacat 720

gaagatgggt atccctcagg acgatcgcaa ccctcaagga aaggaccgtc ttgcacgcat 780

caagcctaag cctgaccctc gcatccatgc ctacactcat tgcgaaattc atcctgctat 840

gattcttggt atctgtgcta gtatca 866

Claims

1.一种刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用，所述的广谱抗菌剂对应为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）抗真菌剂，以及丁香假单胞猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、成团泛菌（Pantoea agglomerans）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠肝菌（Escherichia coli）和铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）抗细菌剂；所述的刺梨内生真菌代谢产物的制备方法是将刺梨内生真菌（Epicoccum latusicollum）HGUP191049经发酵培养获得培养液，通过抽滤或高速离心将培养液分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体；发酵液采用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得刺梨内生真菌（Epicoccum latusicollum） HGUP191049 代谢产物，所述刺梨内生真菌的生物保藏号为：CGMCC NO.40110。

2.根据权利要求1所述的刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用，其特征在于：将刺梨内生真菌（Epicoccum latusicollum）HGUP191049接种于发酵培养基中，28±1℃，160～220 r/min培养5～14 d，获得培养液，通过抽滤或高速离心10000～12000 r/min将培养液分离成发酵液和菌丝体，弃去菌丝体，发酵液采用乙酸乙酯萃取，体积比1:1～1:2，重复萃取3次，35～55℃减压浓缩至恒重，获得刺梨内生真菌（Epicoccum latusicollum） HGUP191049 代谢产物。

3.根据权利要求2所述的刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用，其特征在于：所述培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL，pH自然。

4.根据权利要求3所述的刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用，其特征在于：所述刺梨内生真菌（Epicoccum latusicollum）HGUP191049发酵前先活化培养，然后4℃低温保存5～30 d后或直接接入发酵培养基；所述活化培养为：将刺梨内生真菌（Epicoccum latusicollum）HGUP191049接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基中，28±1℃，培养3～7 d。

5.根据权利要求4所述的刺梨内生真菌的代谢产物在作为广谱抗菌剂中的应用，其特征在于：所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。