CN110241029A - 一株黄连土壤阿魏酸降解菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株黄连土壤阿魏酸降解菌及其用途，属于微生物领域。一株齿孢青霉(Penicillium daleae)，其对土壤化感物质阿魏酸具有高效降解作用，且对立枯病菌、锈腐病菌和黑斑病菌等植物病原菌有抑菌效果，对于连作土壤有修复、生防作用。该菌株由石柱县五年生黄连土壤中分离纯化得到，确定其对阿魏酸具有降解效果后，经ITS鉴定种属，并测试了不同阿魏酸添加量和不同发酵时间下该菌株对阿魏酸的降解效率，最终确定最佳发酵时间为96小时，培养基中添加阿魏酸量大于800微克/毫升时降解效率明显降低。该菌株于2018年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15675。

Description

一株黄连土壤阿魏酸降解菌及其用途

技术领域

本发明涉及一株黄连土壤阿魏酸降解菌及其用途，属于微生物领域。

背景技术

黄连为毛莨科多年生草本植物，其根茎呈黄色连珠状。作为中药常用于治疗肠胃湿热、呕吐等胃肠道疾病。其中有效成分为小檗碱(又称黄连素)，小檗碱在中西医临床中应用广泛，具有广谱抑菌活性，有抗炎、抗病毒等效果，近年来研究表明小檗碱还有降低血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的作用，具有降血糖和保护心血管的功效。

包括黄连、太子参、地黄在内的根茎类药材普遍存在由于土壤理化性质改变和土壤微生态失衡而造成的连作障碍。比如种植一轮黄连后的土壤需要休地5～10年才能再次种植黄连，这严重限制黄连产业的发展。造成连作障碍的一大原因是植株分泌的化感物质随种植年限增加而在土壤中不断积累。高浓度酚酸类化感物质抑制种子萌发所需的关键酶，抑制黄连幼苗的生长，干扰植物的光合作用、干扰植物对矿质营养元素的吸收，从而影响植株的正常生长。阿魏酸是造成作物连作障碍的重要因素之一，导致植株体内保护酶活性急剧下降进而强烈抑制幼苗根生长。

近年来通过对土壤微生物进行人为管理以缓解连作障碍的研究越发深入，对酚酸有良好降解效果的黄孢原毛平革菌在土壤环境中高效降解酚酸；丛枝菌根真菌则是土壤生态***中同时具有微生物特性和植物根系的互惠共生体，能够有效缓解连作障碍。因此从土著微生物中筛选化感物质降解菌，并对土壤微生物群落结构进行人为管理可以加快连作障碍的修复效率，有利于药材种植。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一株黄连土壤阿魏酸降解菌。

本发明要解决的第二个技术问题是提供该黄连土壤阿魏酸降解菌的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

重庆石柱县为首个通过国家GAP认证的黄连高产示范基地，其年产量2000吨，占全国黄连产量60％以上。本研究从石柱黄连种植土壤中分离得到多株对阿魏酸有降解作用的真菌，并挑选降解效果最好的菌株进行鉴定和降解效率测试，丰富了黄连土壤来源的阿魏酸降解菌资源，为修复黄连连作障碍奠定基础。

一株黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056，保藏编号为CGMCC No.15675。

本发明菌株F-0056为齿孢青霉(Penicillium daleae)，于2018年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15675。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

另一方面，本发明提供保藏编号为CGMCC No.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的应用。

所述应用为制备土壤阿魏酸降解剂或生物防菌剂。齿孢青霉对根腐病菌、立枯病菌、锈腐病菌和黑斑病菌具有抑菌效果，因此可作为生防菌剂在药材种植过程中施用。

所述土壤为中药材黄连的种植土壤，或三七、太子参等根茎类中草药种植土壤，或苹果、草莓等农作物种植土壤。酚酸降解菌剂可缓解上述中药材种植过程中的连作障碍。

另一方面，本发明提供一种降解黄连土壤阿魏酸的方法，其特征在于：向土壤中加入权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056，进行培养。

所述培养的条件为：

将有效菌数为1×10⁹cfu/g的F-0056孢子悬液，以100克/亩的量溶解后浇灌于正茬种植一轮后的土壤，可快速降解土壤中积累的酚酸，达到修复土壤的目的。

另一方面，本发明提供一种降解黄连土壤阿魏酸的生态制剂，含有保藏编号为CGMCC No.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056。

所述制剂由保藏编号为CGMCC No.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的孢子粉与有机肥料、防腐剂以及哈茨木霉、枯草芽孢杆菌混合制成。

所述制剂中黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的有效活菌数为1×10⁹cfu/g。所述生态制剂为干粉剂、可湿性粉剂或溶液。

土壤中酚酸类化感物质的积累是造成中药材连作障碍的重要因素之一，从黄连土壤中分离纯化酚酸降解菌对于缓解连作障碍十分必要。本研究从分离得到多株阿魏酸降解菌中挑选降解效果最好的菌株F-0056进行种属鉴定，测试其在不同发酵时间和不同阿魏酸添加量下的降解效率，最终确定发酵时间达96小时阿魏酸完全降解，阿魏酸添加量为200μg·ml^-1(微克/毫升)时降解效率最高。

本发明的优点是：自土壤环境中菌株CGMCC No.15675仍能有效分解土壤中的阿魏酸，减缓种植土壤中的酚酸积累。这项工作丰富了黄连土壤来源的阿魏酸降解菌资源，为筛选能有效修复黄连连作障碍的微生物打下基础。本发明发酵工艺简单、稳定，真菌孢子易于制备，且孢子的保存条件较菌丝体更为方便，可常温运输。

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，并非对本发明的限制。凡是依照本公开所做的本领域等同替换，均属于本专利保护范围。

附图说明

图1筛选所得阿魏酸降解菌

图2固体培养不同时间的菌落形态

图3菌株F-0056的分生孢子梗

图4基于ITS序列的F-0056***发育树

图5添加不同浓度阿魏酸时F-0056的降解效率

图6不同发酵时间F-0056对阿魏酸的降解效果

图7土壤环境下F-0056对阿魏酸的降解效果

具体实施方式

实施例1

1.材料与方法

1.1样品采集和处理

样品为五年生黄连的根际土壤，于2016年10月采自重庆石柱县黄连种植基地(108°23′E，30°15′N)，以无菌袋带回实验室当日处理。

1.2土壤中微生物的分离纯化

将土壤样品中根系、落叶、石块等杂质去除后过20目筛，将5克土壤样品加入到50毫升无菌水中，稀释10000倍，均匀涂板于加入氯霉素(25毫克/毫升)的马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基上。于25℃培养3～5天，形成可见菌落后，转接至无抗PDA固体培养基中纯化培养。

1.3酚酸降菌筛选

分离纯化所得的真菌挑取单菌落于PDA固体培养基上涂板，25℃培养4～5天至可见大量孢子产生，使用无菌水洗下孢子制成有效菌数为1×10⁷cfu/ml的孢子悬液。将孢子悬液以1％的接种量接入50ml无机盐培养基，分别加入200微克/毫升的阿魏酸作为唯一碳源，28℃条件下转速180rpm培养3天。收集菌体烘干至恒重，计菌体增重量。取发酵液与等体积乙酸乙酯均匀混合后，超声30分钟后静置过夜，取上层乙酸乙酯旋转蒸干并回溶于2ml甲醇。色谱条件：分离柱为Waters公司的symmetey C18柱，检测波长为280nm，柱温30℃，进样量为20μl，流动相组分为甲醇和水(流动相中超纯水用分析纯的冰醋酸调节pH至2.8)，体积流量为1ml·min^-1。梯度洗脱设置：在12分钟时，甲醇和水的体积比为40∶60，其他时间(0、0.1、20分钟)二者的体积比为30∶70。

无机盐培养基配方(1L)

1.4基因组DNA提取

刮取培养4天的菌丝适量，加入裂解缓冲液600微升和10粒玻璃珠，使用均质机震荡80秒；加入7摩尔的乙酸铵275微升后65℃孵育10分钟，冰上放置5分钟后加入500微升氯仿，涡旋1分钟并13400转离心5分钟。吸取上清液700微升与等体积异丙醇混匀后-20℃孵育30分钟，13400转离心7分钟后弃上清，使用70％乙醇洗涤沉淀块3次，弃乙醇待完全挥干后用无菌水溶解沉淀块。

裂解缓冲液配方：

1M Tris(pH＝8.0) 10％

0.5M EDTA 10％

10％ SDS 10％

1.5基因间隔序列(ITS)鉴定

以提取的基因组作为模板，真菌ITS通用引物(27F：AGAGTTTGATCMT GGCTCAG/1525R：AAGGAGGTGWTCCARCC，序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)进行PCR反应，PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共30个循环。扩增所得片段电泳检测后送华大基因公司测序。得到的序列信息利用BLAST比对分析，挑选与目的序列相近的可靠参考序列，用软件MEGA7.0进行***发育分析。

1.6不同阿魏酸浓度发酵条件探索

分别于50毫升无机盐培养基中加入浓度为200μg·ml^-1、400μg·ml^-1、600μg·ml^-1、800μg·ml^-1和1000μg·ml^-1的阿魏酸，将有效菌数为1×10⁷cfu/ml的真菌F-0056孢子悬液以1％的接种量接种，加入等量无菌水为对照组，在28℃条件下转速180rpm培养3天。发酵液萃取后回溶于2ml甲醇，HPLC检测，检测条件见1.3。

1.7不同发酵时间条件探索

于无机盐培养基中加入阿魏酸200μg·ml^-1和1％的有效菌数为1×10⁷cfu/ml的真菌F-0056孢子悬液，28℃条件转速下180rpm分别培养24小时、48小时、72小时和96小时。发酵液萃取后回溶于2毫升甲醇，HPLC检测，检测条件见1.3。

1.8土壤环境下F-0056对阿魏酸的降解效果监测

挖取适量森林土壤，将有效菌数为1×10⁷cfu/ml的F-0056孢子悬液以10∶1的比列接种至1千克每盆的土壤中，以添加等量无菌水为对照，外源阿魏酸添加量为1mg·ml^-1。每隔6天各组取50g土壤，以150ml乙酸乙酯萃取，HPLC检测阿魏酸含量变化，检测条件见1.3。

2.结果与分析

2.1降解菌筛选

从五年生黄连土壤中共分离得到真菌46株，初步筛选得到10株能够在以阿魏酸为唯一碳源的培养基中生长的真菌，这些真菌在以阿魏酸为唯一碳源的条件下菌体生长情况见图1。根据对阿魏酸的降解情况和产孢效率，最终挑选菌株F-0056进行进一步研究。

2.2菌株F-0056的鉴定

固体培养2天时F-0056菌落为白色丝状，边缘整齐，3天开始产生绿色孢子，于PDA上培养不同时间的菌落形态见图2；显微镜下镜检可青霉所特有的分生孢子梗和孢子链，见图3。

将菌株F-0056进行ITS片段扩增后测序，所得序列如下，GenBank序列号为SUB4477629 F-0056MH817153：

＞F-0056

将ITS序列进行BLAST比对后，发现F-0056菌株与GenBank编号为KF313087.1、AF033442.1和KM357338.1的ITS序列三株齿孢青霉相似度达99％，故鉴定为齿孢青霉(Penicillium daleae)，基于ITS序列邻接法构建***发育树如图4所示。

菌株F-0056于2018年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15675。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.3菌株F-0056在添加不同浓度阿魏酸时的降解效率

使用添加不同量外源阿魏酸的无机盐培养基对菌株F-0056的酚酸降解效率进行测试，发现当向无机盐培养基中添加外源阿魏酸量为200μg·ml^-1时，降解效率最高，随着外源阿魏酸添加量的增加菌株F-0056对阿魏酸的降解效果逐渐下降，阿魏酸添加量增加至800μg·ml^-1时降解效率明显降低，见图5。

2.4菌株F-0056发酵不同时间对阿魏酸的降解效果

当添加的外源阿魏酸量为200μg·ml^-1，测试加入F-0056孢子悬液和加入等量无菌水作为对照发酵24小时、48小时、72小时、96小时时阿魏酸的降解效率，相较于对照组，加入F-0056后对阿魏酸的降解率随发酵时间延长而增加，96小时时阿魏酸几乎完全降解，见图6。

2.5菌株F-0056在土壤环境下对阿魏酸的降解效果

从图7可见，土壤中加入降解菌F-0056后对阿魏酸降解效果明显，第6天时土壤中阿魏酸降解率达71.8％，明显高于未加入降解菌的土壤中阿魏酸的降解速率。证明这株阿魏酸降解菌在土壤环境下能快速、有效地分解阿魏酸，降低土壤中阿魏酸的含量。

实施例2阿魏酸降解菌单一成分制剂

F-0056孢子粉制备方法：

将保藏的F-0056菌株于PDA固体培养基上划线，25℃培养2天活化。将活化好的真菌挑取单菌落于PDA固体培养基上，温度25℃培养3～4天，以无菌水洗下培养基上的孢子。无菌水洗涤孢子2遍后冻干制成孢子粉。

可将有效菌数为1×10⁹cfu/g的F-0056孢子粉，以100g/亩的量溶解后浇灌于正茬种植一轮后的土壤，可快速降解土壤中积累的酚酸，达到修复土壤的目的；

该制剂可以作为土壤阿魏酸降解的单一制剂，也可以作为土壤修护添加剂混合到其他土壤制剂中。

实施例3阿魏酸降解菌组合制剂

将实施例2制备的阿魏酸降解菌单一成分制剂，与哈茨木霉、枯草芽孢杆菌等其他生防菌、有机肥料混合制成混合制剂，剂型为粉剂。混合制剂中，黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的有效活菌数为1×10⁹cfu/g。

组合制剂成分包括：秸秆粉80～85％，复合肥10～15％，粘合剂1％，配方菌2％。

在黄连苗移栽前以含F-0056有效菌的组合制剂以100克/亩的施加量对土壤进行搅拌处理，能够在黄连生长期间有效抑制立枯病菌、锈腐病菌、黑斑病菌引起的根部病害、减缓土壤中酚酸类化感物质的积累。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一株黄连土壤阿魏酸降解菌及其用途

<130> XDRC18I017

<141> 2018-09-26

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

aaggaggtgw tccarcc 17

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

ggctcccggg tgagactctg ggtccacctc ccacccgtgt ttatcgtacc ttgttgcttc 60

ggcgggcccg cctcacggcc gccggggggc acccgccccc gggcccgcgc ccgccgaaga 120

caccattgaa cgctgtctga agattgcagt ctgagcatct tagctaaatc agttaaaact 180

ttcaacaacg gatctcttgg ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta 240

atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc gccccctggt 300

attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccct caagcacggc ttgtgtgttg 360

ggcccccgcc ccccggctcc cggggggcgg gcccgaaagg cagcggcggc accgcgtccg 420

gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg ctctgtaggc ccggccggcg cccgccggcg 480

acccccctca atctttccag gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag 540

catatcaata aaagcccggg aggattttaa 570

Claims (10)

1.一株黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056，保藏编号为CGMCC No.15675。

2.权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为制备土壤阿魏酸降解剂或生防菌剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述土壤为中药材黄连的种植土壤，或三七、太子参等根茎类中草药种植土壤，或苹果、草莓等农作物种植土壤。

5.一种降解黄连土壤阿魏酸的方法，其特征在于：向土壤中加入权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056，进行发酵培养。

6.根据权利要求5所述的降解黄连土壤阿魏酸的方法，其特征在于所述培养的条件为：将有效菌数为1×10⁹cfu/g(菌落形成单位/克)的F-0056孢子悬液，以100克/亩的量溶解后浇灌于正茬种植一轮后的土壤，可快速降解土壤中积累的酚酸，达到修复土壤的目的。

7.一种降解黄连土壤阿魏酸的生态制剂，其特征在于：含有保藏编号为CGMCCNo.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056。

8.根据权利要求7所述的生态制剂，其特征在于：所述制剂由保藏编号为CGMCCNo.15675的黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的孢子粉与有机肥料、防腐剂以及哈茨木霉、枯草芽孢杆菌混合制成。

9.根据权利要求8所述的生态制剂，其特征在于：所述制剂中黄连土壤阿魏酸降解菌F-0056的有效活菌数为1×10⁹cfu/g。

10.根据权利要求7至9中任何一项所述的生态制剂，其特征在于：所述生态制剂为干粉剂、可湿性粉剂或溶液。