CN114689729B

CN114689729B - 一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法

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Publication number: CN114689729B
Application number: CN202011629070.5A
Authority: CN
Inventors: 张贵民; 陈小伟; 杨永; 刘忠
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN114689729A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法，本发明采用高效液相色谱法进行分析检测，以辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A和流动相B的混合溶液进行洗脱，所述流动相A为0.01％～0.04％三氟乙酸溶液，所述流动相B为乙腈‑甲醇‑异丙醇的混合溶液。发明通过HPLC***同时测定荆防颗粒中的四种有效成分的含量，涵盖荆芥、防风、枳壳、甘草等药味，能够有效的控制荆防颗粒的质量。本发明的方法专属性好，灵敏度高，重现性好，准确可靠；各种成分之间色谱峰均能获得良好的分离，峰形好，无拖尾现象。

Description

一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的含量测定方法

背景技术

荆防颗粒的处方出自明朝张时初《摄生众妙方》中所载荆防败毒散，由荆芥、防风、柴胡、川芎、羌活、独活、前胡、茯苓、桔梗、枳壳、甘草共11味中药组成。方中荆芥微温而发散，善散风解表；防风辛散甘缓微温，为治风通用药，善祛风胜湿、发表止痛。二者相须为用药力更强，治外感风寒或兼湿邪者功著，故为君药。羌活辛温苦燥，主入膀胱经，善除在上在表之风寒湿邪；独活辛散苦燥，主入肾经，主散在里在下之风寒湿邪；两药相合，既解表散寒，又散一身上下之风湿，通利关节而止痹痛。川芎辛温行散，善活血行气、祛风止痛。三药合用，助君药散风寒、祛风湿、止痹痛，故为臣药。柴胡苦泄辛散微寒，善解表退热；前胡辛散苦泄微寒，善疏风宣肺；桔梗辛散苦泄而平，善开宣肺气、祛痰止咳；茯苓甘淡渗利而平，善健脾利湿；枳壳苦泄辛散微寒，善理气行滞，气畅则湿散。五药合用，可助君臣药解表散寒、祛风胜湿、止痛，故为佐药。甘草甘平，调和诸药，为使药。诸药配伍，辛温燥散，共奏解表散寒、祛风胜湿之功，故善治外感风寒挟湿所致的感冒。

制法：以上十一味，荆芥、防风、羌活、独活、前胡、川芎和枳壳分别提取挥发油，川芎、枳壳蒸馏后的水溶液另器收集；川芎、枳壳的药渣与茯苓照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用上述水溶液配成25％乙醇溶液作溶剂，进行渗漉；荆芥、防风、羌活、独活和前胡的药渣与其余柴胡、桔梗、甘草等三味加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；合并漉液和稠膏，混匀，静置，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.30(80～85℃)的清膏，取清膏1份，加蔗糖6份，混匀制成颗粒，干燥，加入上述荆芥等挥发油，混匀，即得。

荆防颗粒能够发汗解表，散风祛湿，主要用于风寒感冒，症见恶寒无汗，头痛身痛，鼻塞清涕，咳嗽白痰，临床效果较为显著。

荆防颗粒的现行标准为***标准WA₃-B-0328-90，载于《中药成方制剂》第2册，其中只有性状项和颗粒剂检查项，无法有效控制荆防颗粒的质量，有必要增加含量测定项对其中的指标性成分进行测定。

专利CN103954724B涉及一种荆防颗粒的检测方法，包括性状、鉴别、检查、含量测定项目。其中，含量检测是仅对枳壳中盐酸麻黄碱的含量的测定，缺少对君药、臣药等药味中有效成分的控制。

焦灵利等采用HPLC法对荆防抗感泡腾片中升麻苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量进行了测定；冉康等采用HPLC法对复方荆防合剂中牛蒡苷的含量进行了测定；黄莉等利用UV法对荆防小儿止咳口服液中的总皂苷进行了含量测定。刘雯等采用HPLC同时测定荆防颗粒中升麻素苷、阿魏酸、柚皮苷、胡薄荷酮、蛇床子素、异欧前胡素6种成分。中国药典2020版一部中采用HPLC法检测防风中升麻素苷的含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(40：60)为流动相；检测波长为254nm。采用HPLC法检测枳壳中柚皮苷的含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(20：80)(用磷酸调pH值至3)为流动相；检测波长为283nm。采用HPLC法检测甘草中甘草苷的含量，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按程序进行梯度洗脱；检测波长为237nm。以上色谱条件均无法同时进行荆防颗粒中黄酮苷类成分的含量测定，各成分色谱峰无法达到有效分离。

荆防颗粒中含香豆素类、黄酮苷类、挥发油、三萜类、皂苷等多种有效成分，其中黄酮苷类成分具有发汗、解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒等药理作用。目前国内有13家荆防颗粒上市，尚未有完善的检测方法对有效成分进行测定，无法保证药品的安全性和有效性。很有必要对荆防颗粒中黄铜苷类成分进行含量测定。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的含量检测方法，能够较好的进行多种有效成分的同时测定，并且具有操作简便、精密度高、稳定性好、重现性好的特点。

荆防颗粒中黄酮苷类成分包括升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷，其中升麻素苷存在于防风中，可减轻疼痛，通过减少脊髓COX-2对炎症性伤害感受的抗伤害作用；诱导急性淋巴细胞白血病细胞的细胞周期停滞和凋亡，抵抗发热。甘草苷存在于甘草中，甘草苷是甘草黄酮类化合物中重要的单体活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗促癌、抗致突等作用。橙皮苷存在于荆芥和枳壳中，具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗突变、抗过敏、抗溃疡、镇痛、降血压活性，能降血胆固醇、减少血栓的形成，改善局部微循环和营养供给，可用于生产防治心脑血管疾病。柚皮苷存在于枳壳中，具有抗炎和抗病毒作用，并有一定的抗菌作用。

本发明的发明目的是采用如下的技术方案实现的。

一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法，该方法以高效液相色谱法测定荆防颗粒中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。

一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法，采用高效液相色谱法进行分析检测，以辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A和流动相B的混合溶液进行洗脱，所述流动相A为0.01％～0.04％三氟乙酸溶液，所述流动相B为乙腈-甲醇-异丙醇的混合溶液。

优选地，所述的色谱柱为Ultimate XB-C18，Ultimate SX-C18，Agilent ZORBAXSB-C18，Agilent Eclipse XDB-C18，Xbridge ShieldRP8，Thermo BDS HYPERSIL C18，Ultimate XB-C8。

优选地，所述的色谱柱温度为25～40℃。

优选地，所述的流动相A为0.01～0.04％三氟乙酸溶液；进一步优选地，所述的流动相A为0.02～0.03％三氟乙酸溶液；更进一步地，所述的流动相A为0.025％三氟乙酸。

优选地，所述的流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为86～94：(3～7)：(3～7)。

进一步优选地，所述的流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为88～92：(4～6)：(4～6)。

在一个实施方式中，所述流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为92:4:4；在另一个实施方式中，所述流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为91:5:4；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为90:5:5；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为90:3:7；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为90:4:6；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为90:6:4；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为90:7:3；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比89:6:5；在另一个实施方式中，流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为88:6:6。

优选地，所述洗脱方式为梯度洗脱，0～46min，流动相B5％～80％。

进一步优选地，梯度洗脱条件如下：

更进一步地，梯度洗脱条件如下：

在一个优选的实施方式中，梯度洗脱条件如下：

优选地，流动相的流速为0.6～1.0ml/min，进一步优选，流速为0.8～1.0ml/min。

优选地，所述的检测波长为210～230nm。

优选地，所述的色谱柱温度为25～40℃。

优选地，进样量为5～20μl。

下面进一步详细说明本发明的技术方案：

一种测定荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液配制

称取升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷对照品适量，加甲醇配制成每1ml中约含升麻素苷2.5～10μg、甘草苷1.25～5μg、橙皮苷2.5～10μg、柚皮苷25～100μg的溶液，作为对照品溶液。

(2)供试品溶液配制

取荆防颗粒研细，精密称定15g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀释剂甲醇50～200ml，超声处理，放冷，再称定重量，用稀释剂甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

(3)HPLC检测

将对照品和供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：辛烷基或十八烷基硅烷键合色谱柱；

流动相：流动相A为0.01～0.04％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为86～92：(3～7):(3～7)的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.6～1.0ml/min；

波长：210～230nm；

进样量：5～20μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

(4)记录色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。

优选地，所述的流动相A为0.02～0.03％三氟乙酸溶液；进一步地，所述的流动相A为0.025％三氟乙酸。

优选地，所述的流动相B中乙腈、甲醇、异丙醇的体积比为88～92：(4～6)：(4～6)。

优选地，梯度洗脱条件如下：

在一个优选的实施方式中，梯度洗脱条件如下：

优选地，流动相的流速为0.8～1.0ml/min。

优选地，所述的检测波长为220nm。

优选地，进样量为10μl。

需要说明的是，供试品溶液配制中，稀释剂可以是50～100％甲醇溶液。

本发明通过HPLC***同时测定荆防颗粒中的四种有效成分的含量，涵盖荆芥、防风、枳壳、甘草等药味，能够有效的控制荆防颗粒的质量。本发明的方法专属性好，灵敏度高，重现性好，准确可靠；各种成分之间色谱峰均能获得良好的分离，峰形好，无拖尾现象。

附图说明

图1：实施例1混合对照品溶液色谱图；

图2：实施例1供试品溶液色谱图；

图3：实施例2混合对照品溶液色谱图；

图4：实施例2供试品溶液色谱图；

图5：实施例3混合对照品溶液色谱图；

图6：实施例3供试品溶液色谱图；

图7：实施例4混合对照品溶液色谱图；

图8：实施例4供试品溶液色谱图；

图9：实施例5混合对照品溶液色谱图；

图10：实施例5供试品溶液色谱图；

图11：实施例6混合对照品溶液色谱图；

图12：实施例6供试品溶液色谱图；

图13：实施例7混合对照品溶液色谱图；

图14：实施例7供试品溶液色谱图；

图15：实施例8升麻素苷对照品溶液色谱图；

图16：实施例8甘草苷对照品溶液色谱图；

图17：实施例8橙皮苷对照品溶液色谱图；

图18：实施例8柚皮苷对照品溶液色谱图；

图19：实施例8混合对照品溶液色谱图；

图20：对比实施例1升麻素苷对照品溶液色谱图；

图21：对比实施例1甘草苷对照品溶液色谱图；

图22：对比实施例1橙皮苷对照品溶液色谱图；

图23：对比实施例1柚皮苷对照品溶液色谱图；

图24：对比实施例1混合对照品溶液色谱图；

图25：对比实施例2升麻素苷对照品溶液色谱图；

图26：对比实施例2甘草苷对照品溶液色谱图；

图27：对比实施例2橙皮苷对照品溶液色谱图；

图28：对比实施例2柚皮苷对照品溶液色谱图；

图29：对比实施例2混合对照品溶液色谱图；

图30：对比实施例3混合对照品溶液色谱图；

图31：对比实施例3供试品溶液色谱图；

图32：对比实施例4混合对照品溶液色谱图；

图33：对比实施例4供试品溶液色谱图。

具体实施方式

下面通过一些实施例来进一步说明本发明，应当理解的是，以下实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不用来限制本发明的保护范围。以下实施例所用到的对照品均可通过商业途径获得；荆防颗粒产品由山东新时代药业有限公司提供，每袋荆防颗粒产品含量15g。

实施例1荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

(1)对照品溶液的配制

对照品储备液：精密称取升麻素苷对照品25.0mg，甘草苷对照品12.5mg，橙皮苷对照品25.0mg，分别置于50ml容量瓶中，加入甲醇溶并解稀释至刻度，摇匀，即得各对照品储备液。精密称取柚皮苷对照品50.0mg置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶并解稀释至刻度，摇匀，即得柚皮苷对照品储备液。

对照品定位溶液：精密量取各对照品储备液1.0ml，分别置于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。

混合对照品溶液：分别精密量取各对照品储备液1.0ml，置于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的配制

取荆防颗粒产品，研细，精密称定15g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过作为供试品溶液。

(3)HPLC检测

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×25cm，3.5μm)；

柱温：35℃；

流动相：流动相A为0.025％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为90:5:5的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.8ml/min；

波长：220nm；

进样量：10μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

(4)记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为12.105min、22.704min、25.535min、26.310min，混合对照品溶液的色谱图见图1，从图1可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图2，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表1。

表1荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

实施例2荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

(1)溶液配制

对照品储备液：精密称取升麻素苷对照品25.0mg，甘草苷对照品12.5mg，橙皮苷对照品25.0mg，分别置于50ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各对照品储备液。精密称取柚皮苷对照品50.0mg置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得柚皮苷对照品储备液。

对照品定位溶液：精密量取各对照品储备液1.0ml，分别置于50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。

混合对照品溶液：分别精密量取各对照品储备液1.0ml，置于50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的配制

(3)HPLC检测

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×15cm，3.5μm)；

柱温：40℃；

流动相：流动相A为0.01％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为92:4:4的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.6ml/min；

波长：210nm；

进样量：5μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为12.145min、22.758min、25.571min、26.358min，混合对照品溶液的色谱图见图3，从图3可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图4，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表2。

表2荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

检测成分	升麻素苷	甘草苷	橙皮苷	柚皮苷
					含量(mg/袋)	1.53	0.51	1.08	12.01

实施例3荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

(1)溶液配制

对照品定位溶液：精密量取各对照品储备液0.5ml，分别置于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。

混合对照品溶液：分别精密量取各对照品储备液0.5ml，置于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的配制

取荆防颗粒产品，研细，精密称定15g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇200ml，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过作为供试品溶液。

(3)HPLC检测

色谱柱：Ultimate XB-C8(4.6mm×25cm，3μm)；

柱温：25℃；

流动相：流动相A为0.04％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为88:6:6的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：1.0ml/min；

波长：230nm；

进样量：20μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为11.713min、22.186min、24.397min、25.709min，混合对照品溶液的色谱图见图5，从图5可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图6，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表3。

表3荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

检测成分	升麻素苷	甘草苷	橙皮苷	柚皮苷
					含量(mg/袋)	1.50	0.53	1.05	12.09

实施例4荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

按照实施例1的方法配制的对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定：

色谱柱：Ultimate SX-C18(4.6mm×15cm，3μm)；

柱温：30℃；

流动相：流动相A为0.03％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为90:3:7的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.8ml/min；

波长：220nm；

进样量：10μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为12.110min、22.724min、25.536min、26.317min，混合对照品溶液的色谱图见图7，从图7可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图8，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表4。

表4荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

检测成分	升麻素苷	甘草苷	橙皮苷	柚皮苷
					含量(mg/袋)	1.54	0.50	0.99	11.98

实施例5荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×25cm，3.5μm)；

柱温：30℃；

流动相：流动相A为0.02％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为90:7:3的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.8ml/min；

波长：220nm；

进样量：10μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为12.131min、22.730min、25.579min、26.346min，混合对照品溶液的色谱图见图9，从图9可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图10，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表5。

表5荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

检测成分	升麻素苷	甘草苷	橙皮苷	柚皮苷
					含量(mg/袋)	1.50	0.54	1.11	12.05

实施例6荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18(4.6mm×25cm，5μm)；

柱温：30℃；

流动相：流动相A为0.025％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为90:4:6的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.8ml/min；

波长：220nm；

进样量：10μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为11.690min、22.170min、24.916min、25.680min，混合对照品溶液的色谱图见图11，从图11可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图12，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表6。

表6荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

检测成分	升麻素苷	甘草苷	橙皮苷	柚皮苷
					含量(mg/袋)	1.52	0.53	1.07	12.05

实施例7荆防颗粒中黄铜苷类成分含量的测定

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×25cm，5μm)；

柱温：30℃；

流动相：流动相A为0.025％三氟乙酸溶液，流动相B为体积比为90:6:4的乙腈-甲醇-异丙醇；

流速：0.8ml/min；

波长：220nm；

进样量：10μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱梯度如下：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为12.915min、23.847min、26.489min、27.270min，混合对照品溶液的色谱图见图13，从图13可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷成分可以完全有效分离，各组分测定互不干扰，分离度良好。供试品溶液的色谱图见图14，供试品中升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量测定见表7。

表7荆防颗粒黄酮苷类成分含量测定结果

检测成分	升麻素苷	甘草苷	橙皮苷	柚皮苷
					含量(mg/袋)	1.55	0.54	0.98	12.02

实施例8

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×25cm，3.5μm)；

柱温：30℃；

流速：0.8ml/min；

检测波长：220nm；

进样量：10μl；

流动相A为0.025％三氟乙酸溶液，流动相B为乙腈-甲醇-异丙醇(90:5:5)，按以下程序进行梯度洗脱：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图由对照品中各组分保留时间定性，按照外标法计算供试品中的升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的含量。升麻素苷对照品溶液的色谱图见图15，甘草苷对照品溶液的色谱图见图16，橙皮苷对照品溶液的色谱图见图17，柚皮苷对照品溶液色谱图见图18，混合对照品溶液色谱图见图19。从图15可以看出，升麻素苷未出峰，可能与溶剂峰重叠；由图16-19可知，甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间接近，混合对照品溶液的色谱图中升麻素苷、甘草苷峰完全重叠，橙皮苷和柚皮苷峰分离度不符合要求，无法进行含量测定。

对比实施例1

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×25cm，3.5μm)；

柱温：25℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：254nm；

进样量：10μl；

流动相：甲醇-水(40：60)；

采用等度洗脱。

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图。升麻素苷对照品溶液色谱图见图20，甘草苷对照品溶液色谱图见图21，橙皮苷对照品溶液色谱图见图22，柚皮苷对照品溶液色谱图见图23，混合对照品溶液的色谱图见24。从图20-23可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的保留时间分别为8.226min、8.378min、12.976min、14.403min，保留时间接近，从图24可以看出升麻素苷、甘草苷峰完全重叠，橙皮苷和柚皮苷峰分离度不符合要求，无法进行含量测定。

对比实施例2

色谱柱：Ultimate XB-C18(4.6mm×15cm，3μm)；

柱温：25℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：283nm；

进样量：10μl；

流动相：乙腈-水(20：80)(用磷酸调节pH至3.0)；

采用等度洗脱。

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图。升麻素苷对照品溶液色谱图见图25，甘草苷对照品溶液色谱图见图26，橙皮苷对照品溶液色谱图见图27，柚皮苷对照品溶液色谱图见图28，混合对照品溶液色谱图见图29。从图25-29可以看出，升麻素苷未出峰，甘草苷、橙皮苷和柚皮苷的相对保留时间分别为7.205min、7.593min、8.006min，混合对照品色谱图中各峰分离度不符合要求，无法进行含量测定。

对比实施例3

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×25cm，3.5μm)；

柱温：30℃；

流速：0.8ml/min；

检测波长：220nm；

进样量：10μl；

流动相A为0.025％三氟乙酸溶液，流动相B为乙腈，按以下程序进行梯度洗脱：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，混合对照品溶液色谱图如30所示，供试品溶液色谱图见图31，供试品中柚皮苷有拖尾现象，拖尾因子不符合要求。

对比实施例4

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×25cm，3.5μm)；

柱温：30℃；

流速：0.8ml/min；

检测波长：220nm；

进样量：10μl；

流动相A为0.025％三氟乙酸溶液，流动相B为乙腈：甲醇(90:10)，按以下程序进行梯度洗脱：

记录对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱图，混合对照品溶液色谱图如32所示，供试品色谱图如附图33所示，供试品中柚皮苷有拖尾现象，拖尾因子不符合要求。

验证实施例

(1)***适用性试验

称取升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷对照品各适量，加甲醇配成每1ml中约含升麻素苷10μg、甘草苷5μg、橙皮苷10μg、柚皮苷100μg的混合溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品液、供试品液各5μl，注入液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果见表8。

表8荆防颗粒黄酮苷类含量测定方法***适用性试验结果

从表1结果可知，连续进样6次，峰面积的RSD均小于为2.0％，保留时间的RSD均小于为1.0％，说明色谱***稳定。理论板数均大于10000，橙皮苷与柚皮苷的分离度均大于2.0，符合规定。

(2)线性与范围试验

分别称取升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷对照品适量，加甲醇配制成约含升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷分别为100μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、1mg/ml的储备液，分别取0.2ml，0.4ml，0.8ml，1.6ml、2.0ml、4.0ml、8.0ml于20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按照实施例1的色谱条件进行检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程和相关系数。线性和范围试验结果见表9。

表9黄酮苷类成分线性和范围试验结果

从表2结果可以看出，升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷的浓度-峰面积线性关系良好，r>0.999。

(3)准确性试验

取升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升各含0.5mg的溶液，分别作为升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷储备液；精密量取升麻素苷储备液2.0ml、甘草苷储备液1.4、橙皮苷储备液4.8ml，置同一20ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，混匀，作为混合对照品储备液。

取荆防颗粒15g，精密称定，精密加甲醇50ml，称定，超声处理，放冷，补足减失重量，混匀，静置，精密量取上清液5ml，置10ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，混匀，取续滤液作为校正溶液。

取荆防颗粒15g，精密称定，精密加甲醇50ml，称定，超声处理放冷，补足减失重量，混匀，静置，精密量取上清液5ml，置10ml量瓶，再精密量取混合对照品储备液1.0ml、柚皮苷储备液2ml用甲醇稀释至刻度，混匀，取续滤液作为100％供试品溶液，同法制备50％、150％供试品溶液，每个浓度制备3份。

另精密量取升麻素苷储备液0.2ml，甘草苷储备液0.1ml，橙皮苷储备液0.2ml，柚皮苷储备液2.0ml，置同一10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，作为对照品溶液。平行配制2份。

取上述溶液，按实施例1进行检测，按外标法以峰面积计算含量，并计算相对标准偏差，结果见表10。

表10黄酮苷含量测定准确度试验结果

由结果可知，各组分3个浓度9份回收率RSD均小于5％，符合要求，说明各组分准确度良好。

(4)精密度试验

a.重复性试验

取升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升含升麻素苷10μg、甘草苷5μg、橙皮苷10μg、柚皮苷100μg的混合溶液，平行稀释两份，作为对照品溶液。

取荆防颗粒15g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定，超声处理30min，补足减失重量，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，平行配制6份。按实施例1的色谱条件进行检测，按照外标法计算含量，以相对标准偏差RSD验证重复性结果。

表11荆防颗粒黄酮苷类含量重复性试验结果

由结果可见，各组分重复6次配样所得含量RSD均小于2％，本方法重复性良好。

b.中间精密度试验

取荆防颗粒15g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定，超声处理30min，补足减失重量，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，平行配制6份。

分别由两个实验员按上述对照品溶液、供试品溶液进行配制，并用两台仪器测定按照实施例1的色谱条件进行检测，计算RSD值，结果见表12。

表12荆防颗粒黄酮苷类含量中间精密度试验结果

由结果可见，各组分重复6次配样所得含量RSD均小于2％，本法的中间精密度良好。

(5)溶液稳定性试验

按照实施例1的方法配制升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷对照溶液，在常温下分别放置24h，于不同时间点按照实施例1色谱条件进行测定分析，结果见表13。

表13荆防颗粒黄酮苷含量测定供试品溶液稳定性试验结果

结果表明：本品溶液在室温条件下24h内峰面积的RSD均小于2％，稳定性较好。

经过验证，本发明的其他技术方案也能达到与实施例1类似的技术效果，其稳定性好、精密度高、专属性耐用性好。

Claims

1.一种荆防颗粒中黄酮苷类成分的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行分析检测，以辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以流动相A和流动相B的混合溶液进行洗脱，检测波长为210~230nm；所述流动相A为0.01%~0.04%三氟乙酸溶液，所述流动相B为体积比为86~94：3~7：3~7的乙腈-甲醇-异丙醇的混合溶液；所述的色谱柱选自Ultimate XB-C18，Ultimate SX-C18，Agilent ZORBAX SB-C18，Agilent Eclipse XDB-C18，Xbridge Shield RP8，Thermo BDS HYPERSIL C18，Ultimate XB-C8中的一种；

洗脱梯度如下：

所述黄酮苷类成分为升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、柚皮苷。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的色谱柱温度为25~40℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相A为0.02~0.03%三氟乙酸溶液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度如下：

。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相流速为0.6~1.0ml/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进样量为5~20μl。