CN109824658B - 一种从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法，以忧遁草为原料，经过下述步骤：（1）提取；（2）高效液相色谱分离分析；（3）大孔吸附树脂富集；（4）半制备型高效液相色谱分离纯化；（5）化合物的纯度检测及结构鉴定。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇‑水等度洗脱，得到3种高纯度的成分，经核磁共振波谱鉴定分别是肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。
Description
技术领域
本发明属于化工领域，具体是涉及一种从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法。
背景技术
忧遁草为爵床科(Acanthaceae)鳄嘴花属鳄嘴花Clinacanthus nutans(Burro.F.)Lindau的全草，别名有鳄嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草、千里追、汉帝草等，广泛分布于我国南部至西南部，如海南、广东、广西、云南等地区，以及马来西亚、印度尼西亚、泰国等国家。忧遁草味甘、微苦，性凉，入肝、肾经，具有清热利湿、利尿消肿、活血疏经、抗肿瘤等功效。研究表明，忧遁草有良好的抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、免疫调节等生物活性。忧遁草含有多种化学成分，如黄酮、三萜、植物甾醇、脱镁叶绿素、含硫化合物、氨基酸、微量元素、生物碱等，其中，黄酮类物质的含量最高。忧遁草中的黄酮主要是黄酮苷，有降血糖、防辐射、抗菌杀虫、抗病毒、保护肝脏及心脑血管等多种生理活性。为了更好地开发利用该药物资源，本发明提供了一种高效、快速、简便的从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、快速、简便的从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法。
本发明的方案如下：
从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法，其步骤为：
(1)黄酮苷的提取：将忧遁草粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。
(2)黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱(250×4.6mm I.D.,5μm)，流动相为甲醇-水(40：60，V/V)，流速为1.0mL/min，检测波长为330nm，柱温为室温。
(3)黄酮苷的富集：用HPD-100型大孔吸附树脂对粗提物中的黄酮苷进行富集，首先用水洗脱10个柱体积以除去强极性的杂质，再用40％乙醇-水溶液洗脱7个柱体积将黄酮苷洗脱下来。
(4)黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对富集后的黄酮苷进行分离纯化，色谱柱为C18柱(250×25.4mm I.D.,10μm)，流动相为甲醇-水(34：66，V/V)，流速为25mL/min，检测波长为330nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。
(5)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明3种化合物的纯度都达到了95％以上。经核磁共振波谱分析3种化合物分别是肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)提取溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水(优选乙醇)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)提取溶剂(乙醇-水溶液)中乙醇的体积分数为10％-95％(优选75％)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)中提取方法为冷浸、超声和加热回流(优选超声)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)提取时溶剂的用量为10-25倍量(优选20倍量)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)提取时间为15-60分钟(优选30分钟)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(1)提取次数为2-4次(优选3次)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(2)高效液相色谱分离分析流动相中甲醇的体积分数为37％-44％(优选40％)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(3)对黄酮苷进行富集使用的大孔吸附树脂的型号为HPD-100、HPD-400、HPD-600、HPD-750、HPD-826(优选HPD-100)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(3)除去粗黄酮苷中的杂质所用乙醇的浓度为0-20％(优选0％)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(3)将黄酮苷从树脂上解吸下来所用乙醇的浓度为20-95％(优选40％)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(4)对黄酮苷进行半制备型高效液相色谱分离纯化流动相中甲醇的体积分数为30％-37％(优选34％)。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤(4)洗脱液的流速为20-30mL/min(优选25mL/min)。
本发明涉及一种从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法，步骤为：(1)提取：将忧遁草粉碎，用20倍量75％乙醇超声提取3次，每次30分钟，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。(2)高效液相色谱分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱(250×4.6mm I.D.,5μm)，流动相为甲醇-水(40：60，V/V)，流速为1.0mL/min，检测波长为330nm，柱温为室温。(3)富集：用HPD-100型大孔吸附树脂对粗提物中的黄酮苷进行富集，首先用水洗脱10个柱体积以除去强极性杂质，再用40％乙醇-水溶液洗脱7个柱体积将黄酮苷洗脱下来。(4)半制备型高效液相色谱分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对富集后的黄酮苷进行分离纯化，色谱柱为C18柱(250×25.4mm I.D.,10μm)，流动相为甲醇-水(34：:66，V/V)，流速为25mL/min，检测波长为330nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。(5)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明3种化合物的纯度都达到了95％以上。经核磁共振波谱分析3种化合物分别肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷。该工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。
本发明从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷，首先用75％乙醇超声提取黄酮苷类成分，浓缩得到粗提物；其次，用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析；再次，用HPD-100型大孔吸附树脂对粗提物中的杂质进行去除，对黄酮苷进行富集；然后，用半制备型高效液相色谱仪对富集后的黄酮苷进行分离纯化，可以得到3种化合物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的结构进行鉴定。该方法使用HPD-100型大孔吸附树脂除杂的效果很好，这一点可从图1和图2对比看出；该方法使用半制备型高效液相色谱仪对黄酮苷进行分离纯化，所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图4至图6中看出。除此之外，还具有如下优势：
(1)用75％乙醇超声提取忧遁草中的黄酮苷类成分利用了“相似相溶”的原理，黄酮苷类成分具有中等强度的极性，因此在75％乙醇中的溶解度最大，用75％乙醇超声提取可以使忧遁草中的黄酮苷类成分最大程度溶出，而弱极性成分(如三萜、甾醇、脱镁叶绿素等)及强极性成分(如氨基酸、微量元素、维生素等)尽量少溶出。
(2)用高效液相色谱法对粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动相等度洗脱可以在短时间内对3种极性差异较大的目标化合物实现基线分离，峰型对称尖锐，分离度高。
(3)用HPD-100型大孔吸附树脂对粗提物进行除杂，对黄酮苷类成分进行富集的效果很好，黄酮苷的质量分数由纯化前的61％提高到纯化后的91％，大孔吸附树脂可以再生后重复使用，降低了生产成本，洗脱剂为乙醇-水，价廉无污染且容易实现回收再利用。
(4)用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到3种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。
(5)用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速、高效。
(6)提取、分离、纯化过程中仅用到乙醇、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的氯仿、苯、正己烷等有机溶剂，乙醇-水、甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。
(7)优化了层析方法的条件(洗脱液的组成、洗脱模式和流速)，使化合物的纯度和纯化效率都大幅度提高。
附图说明
图1是忧遁草粗提物富集前的分析型高效液相色谱图。
图2是忧遁草粗提物富集后的分析型高效液相色谱图。
图3是忧遁草粗提物富集后的半制备型高效液相色谱图。
图4是化合物I(肥皂草苷)的高效液相色谱图及紫外光谱图。
图5是化合物II(夏佛塔苷)的高效液相色谱图及紫外光谱图。
图6是化合物III(牡荆苷)的高效液相色谱图及紫外光谱图。
在图1-3中，I：肥皂草苷；II：夏佛塔苷；III：牡荆苷。
具体实施方式
下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。忧遁草购于海南五指山地区，试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。
实施例：从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法，其步骤为：
(1)粗提物的制备：将忧遁草粉碎，用20倍量75％乙醇超声提取3次，每次30分钟，过滤，将提取液合并，减压浓缩得粗提物。
(2)粗提物的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱(250×4.6mm I.D.,5μm)，流动相为甲醇-水(40：60，V/V)，流速为1.0mL/min，检测波长为330nm，柱温为室温。
(3)黄酮苷的富集：用HPD-100型大孔吸附树脂对粗提物中的黄酮苷进行富集，首先用水洗脱10个柱体积以除去强极性杂质，再用40％乙醇-水溶液洗脱7个柱体积将黄酮苷洗脱下来。
(4)黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对富集后的黄酮苷类成分进行分离纯化，色谱柱为C18柱(250×25.4mm I.D.,10μm)，流动相为甲醇-水(34：66，V/V)，流速为25mL/min，检测波长为330nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。
(5)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明3种化合物的纯度都达到了95％以上。经核磁共振波谱分析3种化合物分别是肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷。
在半制备型高效液相色谱分离纯化忧遁草中黄酮苷的过程中，发明人通过使用不同浓度的甲醇-水溶液作流动相，采用不同的洗脱模式，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：
表一忧遁草中黄酮苷的半制备型高效液相色谱分离条件
| 洗脱条件 | |
| 实施例1 | 37％甲醇-水等度洗脱 |
| 实施例2 | 30％甲醇-水等度洗脱 |
| 实施例3 | 34％甲醇-水等度洗脱 |
在实施例1中，由于甲醇的比例较高，虽然分离时间较短，但化合物I和II没有实现基线分离，纯度较低。实施例2中，由于甲醇的比例较低，化合物I和II可以实现基线分离，但化合物III的保留时间太长。实施例3中，由于甲醇的比例适中，3种化合物的分离情况及分离时间均令人满意。
图3是当选用实施例3体系时的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离情况良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱峰面积归一化法分析测试，纯度均高于95％，这一点可从图4至图6中看出。
经核磁共振波谱分析3个化合物的化学结构式如下：
3个化合物的鉴定结果如下：
肥皂草苷：1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm:13.68(1H,brs,5-OH),10.54(1H,brs,4’-OH),7.96(2H,d,J＝8.5Hz,H-2’,6’),6.95(2H,d,J＝8.5Hz,H-3’,5’),6.92(1H,s,H-3),6.89(1H,s,H-8),5.30(1H,J＝8.0Hz,H-1”’),4.57(1H,J＝8.0Hz,H-1”),2.50～5.10(13H,m,糖上质子).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm:164.74(C-2),103.54(C-3),182.57(C-4),159.84(C-5),111.0(C-6),162.95(C-7),94.27(C-8),156.93(C-9),105.33(C-10),121.12(C-1’),129.09(C-2’,6’),116.27(C-3’,5’),161.48(C-4’),74.26(C-1”),71.75(C-2”),79.40(C-3”),71.33(C-4”),81.44(C-5”),61.13(C-6”),101.68(C-1”’),73.13(C-2”’),76.23(C-3”’),69.97(C-4”’),77.71(C-5”’),61.13(C-6”’)。
夏佛塔苷：1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm:13.85(1H,s,5-OH),10.40(1H,s,7-OH),9.28(1H,s,4′-OH),7.99(2H,d,J＝9.0Hz,H-2′,6′),6.94(2H,d,J＝9.0Hz,H-3′,5′),6.84(1H,s,H-3).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm:164.81(C-2),102.82(C-3),182.84(C-4),161.69(C-5),108.72(C-6),161.65(C-7),105.61(C-8),155.75(C-9),104.23(C-10),121.69(C-1’),129.31(C-2’),116.52(C-3’),158.95(C-4’),116.30(C-5’),129.31(C-6’),76.22(C-1”),69.06(C-2”),74.27(C-3”),69.71(C-4”),70.55(C-5”),74.88(C-1”’),69.06(C-2”’),79.68(C-3”’),70.55(C-4”’),79.42(C-5”’),61.79(C-6”’)。
牡荆苷：1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm:7.80(2H,d,J＝8.5Hz,H-2’,6’),6.92(2H,d,J＝8.5Hz,H-3’,5’),6.43(1H,s,H-3),6.21(1H,s,H-6),4.65(1H,d,J＝9.5Hz,H-1”),4.22(1H,t,J＝9.5Hz,H-2”),3.88(1H,d,J＝11.5Hz,H-6eq″),3.78(1H,1dd,J＝6.5,12.0Hz,H-6ax″),3.42-3.52(3H,m,H-3”,4”,5”).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm:164.03(C-2),102.60(C-3),181.12(C-4),156.89(C-5),98.22(C-6),162.74(C-7),104.25(C-8),159.17(C-9),104.62(C-10),121.66(C-1’),128.13(C-2’,6’),115.84(C-3’,5’),161.00(C-4’),73.42(C-1”),70.59(C-2”),78.71(C-3”),70.98(C-4”),81.80(C-5”),61.31(C-6”)。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
Claims (5)
1.一种从忧遁草中提取、分离纯化3种黄酮苷的方法,其特征是，步骤为：
（1）黄酮苷的提取：将忧遁草粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物；
（2）黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱，250×4.6 mm I.D., 5μm，流动相为甲醇-水，40:60，V/V，流速为1.0 mL/min，检测波长为330 nm，柱温为室温；
（3）黄酮苷的富集：用HPD-100型大孔吸附树脂对粗提物中的黄酮苷进行富集，首先用水洗脱10个柱体积以除去强极性的杂质，再用40%乙醇-水溶液洗脱7个柱体积将黄酮苷洗脱下来；
（4）黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对富集后的黄酮苷进行分离纯化，色谱柱为C18柱，250×25.4 mm I.D., 10μm，流动相为甲醇-水，34:66，V/V，流速为25 mL/min，检测波长为330 nm，柱温为室温；根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；
（5）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2）；经核磁共振波谱分析3种化合物分别是肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取溶剂乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为10%-95%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）中提取方法为冷浸、超声或加热回流。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取时溶剂的用量为10-25倍量，提取时间为15-60分钟，提取次数为2-4次。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 252000 No.1 Hunan Road, Dongchangfu District, Liaocheng City, Shandong Province Applicant after: LIAOCHENG University Address before: 252059 No. 34, Wenhua Road, Shandong, Liaocheng Applicant before: LIAOCHENG University |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |