CN110954645A - 一种高质量四黄止痢颗粒的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高质量四黄止痢颗粒的检测方法，所述质量检测方法以薄层色谱法鉴别制剂中黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根和甘草，同时采用HPLC测定制剂中黄芩苷的含量。本发明质量工艺改变后黄芩苷的含量显著提升，结合本发明提供的检测方法，检测结果稳定可靠、专属性强、重现性好，能全面有效地控制四黄止痢颗粒的质量，有利于市场中稳定产品质量，确保兽用药安全、有效，从而更好地满足市场的需要。

Description

一种高质量四黄止痢颗粒的检测方法
技术领域
本发明属于兽药检测技术领域，涉及一种高质量四黄止痢颗粒质量的检测方法，该方法可用于对质量提升后的四黄止痢颗粒进行综合质量评价。
背景技术
四黄止痢颗粒由黄连、黄柏、大黄、黄芪、板蓝根、甘草6味中药经提取加工成四黄止痢浸膏后，与蔗糖、糊精按一定的比例混合制成的颗粒，具有清热泻火、止痢的功效，临床主要用于湿热泻痢和鸡大肠杆菌病的治疗，如鸡的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌感染及病毒性疾病继发感染引起的湿热泻痢、白痢、黄白色痢疾、水样泻痢等；猪大肠杆菌、沙门氏菌引起的腹泻、黄白痢、传染性胃肠炎、流行性腹泻、轮状病毒腹泻等病毒性疾病引起的严重喷射状水样腹泻等。因其确切的疗效和良好的口碑，被收录于中华人民共和国兽药典2010版2部P587。
关于四黄止痢颗粒的质量控制只有《中华人民共和国兽药典》2010版二部标准，其中记载：“四黄止痢颗粒，其处方为：黄连200g、黄柏200g、大黄100g、黄芩200g、板蓝根200g、甘草100
制备方法为：以上6味加水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.32～1.35的稠膏，加入蔗糖和糊精适量，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
最终的产品为黄色至棕黄色颗粒。
鉴别方法：(1)取本品10g，加硅藻土2.5g研匀，加甲醇50mL，置水浴上回流1小时，放冷，滤过，滤液浓缩至5mL作为待测样品溶液。另取黄连对照药材2g，加甲醇20mL，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液(6:3:1.5:1.5:0.5)为展开剂，置氨蒸气饱和的展缸内，预饱和30min，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。待测样品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应位置上，显相同的一个黄色荧光斑点。
(2)取本品2g，加甲醇50mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，置水浴上加热30min，立即冷却，用***分两次提取，每次20mL，合并***液，水浴蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为待测样品溶液。另取大黄对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录32页)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。待测样品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
关于四黄止痢颗粒的专利国内也有较多，例如：
中国专利200910066083.3专利公开了一种四黄止痢泡腾颗粒的制备方法，该四黄止痢泡腾颗粒由下述重量份的原料和辅料制备而成：原料：黄连200，黄柏200，大黄100，黄芩200，板蓝根200，甘草100；辅料：碳酸氢钠108～132，富马酸90～110，稀释剂549～671，矫味剂18～22。同时采用酸碱分开制粒的方法制备泡腾颗粒。本发明采用碳酸氢钠作为碱性剂，采用富马酸作为酸性剂，并添加其它辅料制备四黄止痢泡腾颗粒能减少辅料用量，制备工艺简单，易成型，不易吸湿，泡腾速度快，泡腾效果好，溶化性好，泡腾后药液澄清度好、无焦屑异物等。
中国专利201310739482.8公开了一种检验四黄止痢颗粒质量的方法本发明涉及一种检验四黄止痢颗粒质量的方法，该方法是在四黄止痢颗粒原标准的基础上结合实际情况进行适当改进，对产品质量标准进行修订获得，其增加了黄芩的鉴别，同时提供一种盐酸小檗碱的高效液相色谱(HPLC)测定方法。该方法经方法学验证，能够更有效地控制产品的内在质量，并保证产品质量的稳定。该方法操作简单，达到了中药产品含量测定项要求对有效成分种类尽可能多地加以控制，使产品的质量水平提升，可以增加产品的市场竞争力。
以上技术中对四黄止痢颗粒进行了普通的水煮浓缩，有效物质在高温之后降解的很明显，另外，目前还没有关于全面检查或检测四黄止痢颗粒质量的检测方法，因此，寻求比较完善的全方面的检测方法显得极为重要。
发明内容
鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种全方面检测四黄止痢颗粒的方法，从而控制已上市或产品工艺改进之后的兽药产品的质量层次，可有效的具有清热泻火、止痢的功效。
具体而言本发明是这样实现的：
一种四黄止痢颗粒的质量检测方法，该方法以薄层色谱法鉴别制剂中黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根和甘草，同时采用HPLC测定制剂中黄芩苷的含量。其中的四黄止痢颗粒由黄连、黄柏、大黄、黄芪、板蓝根、甘草6味中药经提取加工成。
进一步地，薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中黄连包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，加硅藻土2.5g研匀，加甲醇50mL，超声提取30min，振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，***提取2次，每次20mL，合并***液，低温挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取盐酸小檗碱对照品加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；另取黄连对照药材2g，加甲醇20mL，同法制成对照药材溶液；
3)点样、展开：吸取供试品溶液2-5μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60-90℃四氯化碳：乙酸乙酯：异丙醇：甲酸：水＝3：3：1.5:1.5：1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
进一步地，薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中黄柏包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨试液调pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各1-2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以四氯化碳：甲醇：氨水＝7:0.5:0.3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
进一步地，薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中大黄包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细并加甲醇50mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，残渣加三氯甲烷2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取大黄酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取供试品溶液2-5μL，对照品溶液5μL，分别点于同一用硅胶G薄层板上，以正己烷：四氯甲烷：乙酸乙酯：水＝5：4.5：2：0.5的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
进一步地，薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中黄芩包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，用30％乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.5小时，滤过合并，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取黄芩苷品，对照中加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以四氯化碳：正丁醇：甲酸：水＝13：8：2：1的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，分别365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。
进一步地，薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中板蓝根包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，用乙酸乙酯-甲醇(3:1)回流提取30min，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取精氨酸对照品，加稀乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各1-2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷：正丁醇：甲醇：甲酸＝8：2：1：1为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
进一步地，薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中甘草包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，超声提取30min，时加振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，合并***液，低温挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：甘草酸单铵盐对照品，加甲醇制成每lm l含2mg的溶液，作为对照品溶液。
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各2-5μL，分别点于1％氢氧化钠溶液制备的同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：氨水：甲酸：水＝7：1：1为展开剂，展开，取出，晾干，10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。
进一步地，高效液相色谱法测定四黄止痢颗粒中的黄芩苷的含量包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取四黄止痢颗粒适量，研细取2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯：甲醇＝1:50溶液50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，称定重量，用甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液3mL，加在100-200目中性氧化铝柱上，用甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀，滤过，即得；
2)对照品溶液制备：在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.06mg的溶液，摇匀，即得；
3)HPLC色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为280nm，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；
4)测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10uL，注入高效液相色谱仪，按照步骤3)所述色谱条件测定，即得。
其中，所述高效液相法步骤3)梯度洗脱程序为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-10 15 85
10-20 28 72
20-30 28 72
本发明的第二个目的在于，提供一种四黄止痢颗粒的有效物质含量提升的工艺，虽然四黄止痢颗粒只含有六种中药成分，但有效成份较为复杂，传统的方法，尤其是高温煎煮使得部分有效成分变性，而失去作用。因此，本发明对其中的中药材例如将黄连、甘草粉在低温下提取，避免了高温的破坏，最终获得高质量的四黄止痢颗粒。具体的四黄止痢颗粒制备工艺为：
(1)制备黄连、甘草淸膏：
(2)制备板蓝根挥发油包合物，板蓝根蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液，备用；
(3)黄芩、黄柏、大黄的煎液与蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液混合，浓缩、干燥与药学上可接受的辅料结合，干燥制粒，过筛，即得中药颗粒。
进一步地，黄连、甘草淸膏的制备过程为：
(1)将黄连、甘草粉碎至20～80目的颗粒或粉末；
(2)向步骤(1)的黄连、甘草颗粒或粉末中加10～60倍量的水，调节pH值至2.0-3.5，20～60℃浸泡3～6小时，过滤，得滤液；
(3)与步骤(2)得到滤液浓缩合并干燥，得到黄连、甘草淸膏。
所述的板蓝根挥发油包合物的制备过程为：板蓝根加水浸泡1-4小时，蒸馏提取6-8小时，收集挥发油备用，蒸馏后药渣及水溶液备用；得到板蓝根挥发油，加β-环糊精制成包合物；蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液，备用。
所述的步骤(3)的过程为：取蒸馏后所得药渣Ⅰ与处方量黄芩、黄柏、大黄加水煎煮1-3次，每次1-2小时，得煎液与药渣Ⅰ水溶液合并滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08-1.20(80℃)的清膏，加乙醇使含醇量达45％，静止24小时，滤过，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.28-1.33(80℃)的稠膏，与，黄连、甘草淸膏淸膏混合加入蔗糖，经过干燥过20目筛，即得。
本发明在四黄止痢原质量检测方法的基础上，经过优化和升级改造，建立了四黄止痢颗粒质量检测的新方法。该方法采用薄层色谱法分别对颗粒中黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根和甘草进行定性鉴别，达到多成分联合控制，同时利用HPLC定量测定制剂中黄芩的黄芩苷含量，能够进一步有效控制四黄止痢颗粒的质量，实现对制剂质量进行全面地评价，从而最大限度地保证了产品质量的稳定性及兽用药的安全性、有效性。
本发明所采用的检测方法科学合理，条件可控，专属性强，稳定性高，具有很强的实用性；本质量检测方法的应用，可确保四黄止痢颗粒的临床疗效，更好地满足畜牧和养殖市场的需要。
本发明方法优化升级了四黄止痢颗粒原检测方法各项鉴别，减少了有害试剂的使用，并增加了全类别的TLC检测的鉴别，提高了准确率。与原有质量检测方法相比，板蓝根挥发油采用环糊精包合，性质更稳定，更适合储存，但是检测过程提取效率不高，本发明采用甲醇溶解之后再用乙醇三次提取，提取率较高，按原色谱条件展开，显色，阴性无干扰，方法专属性好。
附图
图1为四黄止痢颗粒黄芩中黄芩苷的高效液相色谱图，从上往下依次是为黄芩苷对照品、阴性对照色谱图、供试品色谱图。
图2为四黄止痢颗粒中黄连的薄层色谱图，按从左到右的顺序，其中1、4是小檗碱对照品，2是供试品，3是缺小檗碱的阴性制剂样品。
图3为四黄止痢颗粒中板蓝根的薄层色谱图，按从左到右的顺序，其中1、4是板蓝根对照品，2是缺板蓝根的阴性制剂样品，3是供试品。
图4为四黄止痢颗粒中大黄的薄层色谱图，按从左到右的顺序，其中1、4是大黄对照药材，3是缺大黄的阴性制剂样品，2是样品。
图5为四黄止痢颗粒中黄芩的薄层色谱图，按从左到右的顺序，其中1是缺黄芩苷的阴性制剂样品，3是样品，2、4是黄芩苷对照品。
图6为四黄止痢颗粒中黄柏的薄层色谱图，按从左到右的顺序，其中1、4是黄柏碱对照品，2是样品，3是样品是缺黄柏的阴性制剂样品。
图7为四黄止痢颗粒中甘草的薄层色谱图，按从左到右的顺序，其中1、4是甘草酸对照药材，2是样品，3是缺甘草的阴性制剂样品。
具体实施方式
实施例1黄芩中黄芩苷的HPLC方法学研究
1)仪器与试剂：Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2)色谱条件：Kromasil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)检测波长为346nm；流速1mL/min。理论板数按黄芩中黄芩苷峰计算应不低于2500。
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-10 15 85
10-20 28 72
20-30 28 72
3)供试品溶液制备：供试品溶液制备：取四黄止痢颗粒适量，研细取2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯：甲醇＝1:50溶液50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，称定重量，用甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液3mL，加在100-200目中性氧化铝柱上，用甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀，滤过，即得。
4)对照品溶液制备：在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.06mg的溶液，摇匀，即得。
5)阴性对照溶液制备：取不含黄芩药材的阴性对照，照供试品溶液制备项下同法操作，制成阴性对照溶液，从色谱图可以看出，在黄芩苷位置处无干扰。见图1。
6)线性关系考察：精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇配成0.0529mg/mL的溶液，在上述色谱条件下进行测定，分别进样0.4μL、0.6μL、0.8μL、1μL、1.2μL、1.5μL，测定峰面积，如表1。以测得峰面积为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y＝5024.8x-0.69，R2＝0.9998，黄芩苷进样量在0.02115～0.0794μg范围内线性良好。
表1线性关系考察结果
Figure BDA0002195218610000071
7)精密度试验：精密吸取对照品溶液，重复进样6次，每次5μL，峰面积RSD＝0.45％，表明仪器精密度良好。结果见表2。
表2精密度试验结果
Figure BDA0002195218610000072
8)稳定性试验：取同一样品溶液，分别于配制后0h，2h，4h，6h，8h，测定，结果表明样品在8h内稳定。结果见表3。
表3稳定性试验结果
Figure BDA0002195218610000073
9)重复性试验：分别取同一批号的样品6份，照“样品测定”项下的样品制备方法操作，分别测定，计算含量，RSD为0.96％。结果见表4。
表4重复性试验结果
Figure BDA0002195218610000074
Figure BDA0002195218610000081
10)回收率试验：精密称定已知含量的样品6份，分别加入对照品适量，同“供试品溶液制备”项下的制备方法测定，得黄芩苷平均回收率为％，RSD为0.594％。结果见表5
表5回收率试验结果
Figure BDA0002195218610000082
实施例2：薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中黄连包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，加硅藻土2.5g研匀，加甲醇50mL，超声提取30min，振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，***提取2次，每次20mL，合并***液，低温挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取盐酸小檗碱对照品加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；另取黄连对照药材2g，加甲醇20mL，同法制成对照药材溶液；
3)点样、展开：吸取供试品溶液2-5μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60-90℃四氯化碳：乙酸乙酯：异丙醇：甲酸：水＝3：3：1.5:1.5：1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例3：薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中黄柏包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨试液调pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各1-2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以四氯化碳：甲醇：氨水＝7:0.5:0.3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例4：薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中大黄包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细并加甲醇50mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，残渣加三氯甲烷2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取大黄酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取供试品溶液2-5μL，对照品溶液5μL，分别点于同一用硅胶G薄层板上，以正己烷：四氯甲烷：乙酸乙酯：水＝5：4.5：2：0.5的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例5：薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中黄芩包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，用30％乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.5小时，滤过合并，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取黄芩苷品，对照中加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以四氯化碳：正丁醇：甲酸：水＝13：8：2：1的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，分别365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。
实施例6：薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中板蓝根包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，用乙酸乙酯-甲醇(3:1)回流提取30min，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取精氨酸对照品，加稀乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各1-2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷：正丁醇：甲醇：甲酸＝8：2：1：1为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例7：薄层色谱法鉴别四黄止痢颗粒中甘草包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，超声提取30min，时加振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，合并***液，低温挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：甘草酸单铵盐对照品，加甲醇制成每lm l含2mg的溶液，作为对照品溶液。
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各2-5μL，分别点于1％氢氧化钠溶液制备的同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：氨水：甲酸：水＝7：1：1为展开剂，展开，取出，晾干，10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。
实施例8：一种四黄止痢颗粒，其含量以及制备工艺为：
黄连200g，黄柏200g，大黄100g，黄芩200g，板蓝根200g，甘草100g
制备工艺为：
(1)将黄连、甘草粉碎至20～80目的颗粒或粉末；
(2)向步骤(1)的黄连、甘草颗粒或粉末中加10～60倍量的水，调节pH值至2.0-3.5，20～60℃浸泡3～6小时，过滤，得滤液；
(3)与步骤(2)得到滤液浓缩合并干燥，得到黄连、甘草淸膏。
(4)板蓝根加水浸泡1-4小时，蒸馏提取6-8小时，收集挥发油备用，蒸馏后药渣及水溶液备用；得到板蓝根挥发油，加β-环糊精制成包合物；蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液，备用。
(5)取蒸馏后所得药渣Ⅰ与处方量黄芩、黄柏、大黄加水煎煮1-3次，每次1-2小时，得煎液与药渣Ⅰ水溶液合并滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08-1.20(80℃)的清膏，加乙醇使含醇量达45％，静止24小时，滤过，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.28-1.33(80℃)的稠膏，加入蔗糖，经过干燥过20目筛，制成1000g即得。
经检测和计算，本品每1g含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，含量为6.69mg，以本发明实施例1的方法检测，5min溶出98.5％，10min溶出100.1％。
实施例9：一种四黄止痢颗粒，其含量以及制备工艺为：
黄连200g，黄柏200g，大黄100g，黄芩200g，板蓝根200g，甘草100g，以上6味加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.32～1.35的稠膏，加蔗糖和糊精适量，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
经检测和计算，本品每1g含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，含量为5.28mg，以本发明实施例1的方法检测，5min溶出68.3％，10min溶出90.6％。
实施例10：一种四黄止痢颗粒，其含量以及制备工艺为：
黄连200g，黄柏200g，大黄100g，黄芩200g，板蓝根200g，甘草100g
制备工艺为：
(1)板蓝根加水浸泡1-4小时，蒸馏提取6-8小时，收集挥发油备用，蒸馏后药渣及水溶液备用；得到板蓝根挥发油，加β-环糊精制成包合物；蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液，备用。
(2)取蒸馏后所得药渣Ⅰ与处方量黄连、甘草、黄芩、黄柏、大黄加水煎煮1-3次，每次1-2小时，得煎液与药渣Ⅰ水溶液合并滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08-1.20(80℃)的清膏，加乙醇使含醇量达45％，静止24小时，滤过，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.28-1.33(80℃)的稠膏，加入蔗糖，经过干燥过20目筛，制成1000g即得。
经检测和计算，本品每1g含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，含量为5.33mg，以本发明实施例1的方法检测，5min溶出59.9％，10min溶出72.7％。
实施例11：一种四黄止痢颗粒，其含量以及制备工艺为：
黄连200g，黄柏200g，大黄100g，黄芩200g，板蓝根200g，甘草100g
制备工艺为：
(1)将黄连、甘草粉碎至20～80目的颗粒或粉末；
(2)向步骤(1)的黄连、甘草颗粒或粉末中加10～60倍量的水，调节pH值至2.0-3.5，20～60℃浸泡3～6小时，过滤，得滤液；
(3)与步骤(2)得到滤液浓缩合并干燥，得到黄连、甘草淸膏。
(4)处方量黄芩、板蓝根、黄柏、大黄加水煎煮1-3次，每次1-2小时，得煎液，滤液浓缩至相对密度为1.08-1.20(80℃)的清膏，加乙醇使含醇量达45％，静止24小时，滤过，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.28-1.33(80℃)的稠膏，加入蔗糖，经过干燥过20目筛，制成1000g即得。
经检测和计算，本品每1g含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，含量为6.15mg，以本发明实施例1的方法检测，5min溶出65.5％，10min溶出88.3％。

Claims (10)

1.一种四黄止痢颗粒的质量检测方法，其特征在于，该方法以薄层色谱法鉴别制剂中黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根和甘草，同时采用HPLC测定制剂中黄芩苷的含量。
2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，薄层色谱法鉴别制剂中黄连包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，加硅藻土2.5g研匀，加甲醇50mL，超声提取30min，振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，***提取2次，每次20mL，合并***液，低温挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取盐酸小檗碱对照品加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作为对照品溶液；另取黄连对照药材2g，加甲醇20mL，同法制成对照药材溶液；
3)点样、展开：吸取供试品溶液2-5μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60-90℃四氯化碳：乙酸乙酯：异丙醇：甲酸：水＝3：3：1.5:1.5：1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
3.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，薄层色谱法鉴别制剂中黄柏包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细并加甲醇50mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨试液调pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各1-2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以四氯化碳：甲醇：氨水＝7:0.5:0.3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，薄层色谱法鉴别制剂中大黄包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细并加甲醇50mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，残渣加三氯甲烷2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取大黄酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取供试品溶液2-5μL，对照品溶液5μL，分别点于同一用硅胶G薄层板上，以正己烷：四氯甲烷：乙酸乙酯：水＝5：4.5：2：0.5的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，薄层色谱法鉴别制剂中黄芩包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，用30％乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.5小时，滤过合并，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用稀盐酸调pH值至1-2，用***提取2次，每次20mL，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取黄芩苷纯品，对照中加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以四氯化碳：正丁醇：甲酸：水＝13：8：2：1的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，分别365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。
6.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，薄层色谱法鉴别制剂中板蓝根包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，用乙酸乙酯-甲醇(3:1)回流提取30min，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：取精氨酸对照品，加稀乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各1-2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷：正丁醇：甲醇：甲酸＝8：2：1：1为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
7.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，薄层色谱法鉴别制剂中甘草包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取本品10g，研细，加甲醇50mL，超声提取30min，时加振摇，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，用***提取2次，每次20mL，合并***液，低温挥干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
2)对照品溶液制备：甘草酸单铵盐对照品，加甲醇制成每lm l含2mg的溶液，作为对照品溶液。
3)点样、展开：吸取上述两种溶液各2-5μL，分别点于1％氢氧化钠溶液制备的同一硅胶G薄层板上，以正丁醇：氨水：甲酸：水＝7：1：1为展开剂，展开，取出，晾干，10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高效液相色谱法测定制剂中黄芩苷的含量包括以下步骤：
1)供试品溶液制备：取四黄止痢颗粒适量，研细取2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯：甲醇＝1:50溶液50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，称定重量，用甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液3mL，加在100-200目中性氧化铝柱上，用甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀，滤过，即得；
2)对照品溶液制备：在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.06mg的溶液，摇匀，即得；
3)HPLC色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为280nm，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500；
4)测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10uL，注入高效液相色谱仪，按照步骤3)所述色谱条件测定，即得。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的四黄止痢颗粒，其特征在于，所述的四黄止痢颗粒制备工艺为：
(1)制备黄连、甘草淸膏：
(2)制备板蓝根挥发油包合物，板蓝根蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液，备用；
(3)黄芩、黄柏、大黄的煎液与步骤(2)蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液混合，浓缩得稠膏再与步骤(1)淸膏混合，加入药学上可接受的辅料，干燥制粒，过筛，即得中药颗粒。
10.如权利要求9所述的四黄止痢颗粒，其特征在于：所述的黄连、甘草淸膏的制备过程为：将200g黄连和100g甘草粉碎至20～80目的颗粒或粉末，加10～60倍量的水，调节pH值至2.0-3.5，20～60℃浸泡3～6小时，过滤，得滤液，浓缩、干燥，得到淸膏；所述的板蓝根挥发油的制备过程为：200g板蓝根加水浸泡1-4小时，蒸馏提取6-8小时，收集挥发油备用，蒸馏后药渣及水溶液备用；得到板蓝根挥发油，加β-环糊精制成包合物；蒸馏后所得药渣Ⅰ水溶液，备用；所述的步骤(3)的过程为：取蒸馏后所得药渣Ⅰ与处方量200g黄芩、200g黄柏、100g大黄加水煎煮1-3次，每次1-2小时，得煎液与药渣Ⅰ水溶液合并滤过，滤液浓缩至相对密度为1.08-1.20的清膏，加乙醇使含醇量达45％，静止24小时，滤过，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.28-1.33的稠膏，与步骤(1)淸膏混合加入蔗糖，经过干燥过20目筛，即得。
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