CN107389821A - 一种测定藿香正气口服液中有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用两阶段梯度洗脱法对藿香正气口服液中橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚三种成分含量同时测定的方法。本发明的方法适用高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱仪（UPLC）及其它色相色谱仪，并适用于各种型号和规格的十八烷基硅烷键合硅胶（C18）为填料的色谱柱。本发明方法同样适用于藿香正气水中橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚三种成分含量同时测定，即本发明方法适用于藿香正气口服液和藿香正气水的质量控制。本发明方法在各种液相色谱仪和C18为填料的色谱柱上通用性好，并且样品制备方法简单、稳定性高，操作简便、安全、快速、准确可靠、效率高。

Description

一种测定藿香正气口服液中有效成分的方法

技术领域

本发明涉及藿香正气口服液中成分含量测定的方法，具体涉及一种藿香正气口服液中有效成分同时测定的方法，属于中成药成分的检测方法领域。

背景技术

藿香正气口服液原方出自宋代的《太平惠民和剂局方》，其有效成分为厚朴酚、和厚朴酚及橙皮苷。经过千年的加减演变，由现代工艺改造为一种便于携带且疗效好的现代型制剂。本方以广藿香为君，芳香化湿解暑，解表散寒，避秽止呕，悦脾和中，兼治表里；紫苏、白芷为臣，芳香走窜，辛散温通，解表散寒而兼化湿邪。陈皮理气燥湿和中，茯苓、苍术健脾利湿，大腹皮行气利湿，桔梗宣肺利膈，生姜、调和脾胃共为佐药，甘草调和诸药为使。具有解表化湿、理气和中的功效，用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒，症见头痛昏重、胸膈脾闷、脘腹胀痛、呕吐泄泻，或胃肠型感冒症状者。

2015年版《中华人民共和国药典》收录的藿香正气口服液、藿香正气水、藿香正气软胶囊及藿香正气滴丸，均采用高效液相色谱法对陈皮中的橙皮苷、厚朴中的和厚朴酚及厚朴酚三种成分进行含量测定。其中藿香正气口服液、藿香正气水、藿香正气软胶囊三种产品均采用分步法对橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行含量测定，藿香正气滴丸采用梯度洗脱法一次性对橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行含量测定，但其梯度洗脱采用时间控制，仪器不同、色谱柱不同，色谱条件变化后，结果无法重现。藿香正气系列产品含量测定均要求检测橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚三种成分，色谱柱填料均为十八烷基硅烷键合硅胶，但流动相均不同，供试品制备比较复杂，又使用了有毒试剂三氯甲烷；并存在检测时间长，效率低等问题。对中药多成分同时测定的洗脱程序，采用固定色谱柱类型和规格，固定洗脱时间而调整流动相比例进行分析检测，最大的缺陷是方法在不同类型、不同规格的色谱柱上的通用性和重现性极差，甚至更换色谱柱后方法不能使用。也有文献报道采用高效液相色谱法对藿香正气系列产品中的3个、4个、5个，甚至7个成分进行检测，均属于探索性研究，方法通用性差、也没有有效解决方法实际应用过程中的简单、方便、快速、通用性好的问题。

藿香正气系列产品市场需求量和企业生产量都很大，如何建立简单、快速、通用性好的检测方法，是摆在研究人员面前的重要问题。本发明立足于生产实际问题，对藿香正气系列产品的含量测定进行研究，建立了供试品制备方法、3种指标性/有效成分(橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚)的含量测定方法。本发明方法与《中国药典》方法标胶，供试品制备方法简单，避免了有毒试剂三氯甲烷的使用；检测方法简单、快速、准确、稳定，对各种仪器和色谱柱通用性好，极大地提高了效率。该方法能应用于藿香正气口服液、藿香正气水、藿香正气软胶囊及藿香正气滴丸的含量测定。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种测定藿香正气口服液中有效成分的方法，解决供试品制备比较复杂和存在有毒试剂不安全的问题，以及现有检测方法存在检测时间长、流动相均不相同，操作复杂、效率低、通用性和重现性极差的问题。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种测定藿香正气口服液中有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)标准对照品溶液的制备：

取橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚标准对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1mL含橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚分别为0.05～0.30mg的混合溶液，0.2～0.5μm滤膜过滤，待测；

2)供试品溶液的制备：

取藿香正气口服液原液或将原液用60～100％的甲醇/乙醇稀释2-5倍；0.2～0.5μm滤膜过滤，待测；

3)采用高效液相色谱仪测定：

将步骤1)和2)制备的标准溶液和供试品溶液放入高效液相色谱仪中，采用两阶段梯度洗脱法测定，色谱条件如下：

色谱柱为C18色谱柱，柱温为25～40℃，流动相为甲醇-乙腈-水，流速为0.2～2mL/min，进样量为2～20μL(根据液相色谱仪和色谱柱规格确定实际进样量、流速)；梯度虚脱程序按照下表进行：

4)供试品中橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚三种含量计算：

首先用橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚标准对照品溶液所得到的HPLC色谱峰为对照，制备标准对照图谱，并建立浓度与积分面积的线性方程；然后用外标法以标准溶液色谱图为对照，计算供试品中橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚三种成分的含量。

其中，所述步骤3)中两阶段梯度洗脱法是：第一阶段检测待测样品中橙皮苷的含量，待橙皮苷色谱峰出峰结束后，调整流动相比例，进行第二阶段分析；第二阶段检测待测样品中厚朴酚及和厚朴酚两种成分含量，待厚朴酚及和厚朴酚的色谱峰出峰结束后，即完成一个样品分析；然后色谱柱平衡至第一阶段流动相后，可进行下一个样品分析。

所述流动相中水含有小于0.7％的甲酸或乙酸，或水中含有小于0.1％的磷酸。

所述步骤3)中所述的液相色谱仪是高效液相色谱仪(HPLC)、超高效液相色谱仪(UPLC)、中压液相色谱仪或低压液相色谱仪。

本发明还适用于用于藿香正气水中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚含量测定，即方法适用于藿香正气水有效成分的含量测定。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明简化了样品前处理方法，使用供试品原液或供试品原液用甲醇或乙醇稀释一定倍数后过滤，直接用于高效液相色谱分析，该方法制备的供试样品在120个小时内仍具有稳定性，不再采用三氯甲烷萃取，避免了有毒试剂的使用对人体和环境的危害，也大大节约了人力和时间成本；同时减少样品前处理步骤，降低了人为因素对分析结构造成的影响，因此能提高检测的准确度。

2、本发明通过对供试品的处理方法以及色谱条件的筛选，使得本发明方法具有良好的专属性、精确度、重现性和准确性，降低了仪器资源的占用率，大大节约了人力和时间成本，明显提高了检测效率。

3、本发明采用两阶段梯度洗脱程序对样品进行分析，第一阶段检测1种成分(橙皮苷)，第二阶段检测2种成分(和厚朴酚及厚朴酚)，即一次色谱分析完成多种成分含量的测定，并且该方法适用于不同类型和不同规格的色谱柱，选择快速色谱柱能提高供试品分析效率，又能达到理想的分析效果。因此本发明大大的缩短了测定分析时间，在HPLC上20min以内完成一个样品3种成分含量的测定，在UPLC上分析检测时间更短，被测的3种成分色谱峰具有良好的分离度、方法精确度、重复性的RSD均小于2.0％。洗脱过程中不固定每阶段洗脱时间。因此，本发明的方法适用于不同液相色谱仪、不同类型和不同规格的色谱柱上，表现出良好的通用性。可用于藿香正气口服液和藿香正气水产品的质量评价和控制；也可用于藿香正气软胶囊及藿香正气滴丸的质量分析和控制，由于藿香正气软胶囊和藿香正气滴丸不是液体，所以样品前处理方法不同，但样品分析方法是一样的。

4、本发明以数个具有指示性(或指标性)成分的色谱峰为参考，设置数个等度或梯度洗脱剂比例，组成完整的梯度洗脱程序，进行多成分含量同时测定或指纹图谱构建，每个阶段的洗脱时间根据仪器、流速、色谱柱类型和规格确定，因此，在不同仪器、不同类型和不同规格的色谱柱上良好的通用性。这为植物(包括中药材)和中药复方的多成分同时含量测定或构建指纹图谱构建奠定了理论基础。

附图说明

图1是***适应性试验中标准品溶液HPLC图；

图2是***适应性试验中供试品品溶液HPLC图；

图3是专属性试验中不含橙皮苷的阴性样品溶液HPLC图；

图4是专属性试验中不含和厚朴酚及厚朴酚的阴性样品溶液HPLC图；

图5是专属性试验中供试品溶液HPLC图；

图6-15分别是方法1-10分析供试品溶液的HPLC图；

图16-22分别是不同色谱柱A-G分析供试品溶液的HPLC图；

图23是20℃分析供试品溶液HPLC图；

图24是25℃分析供试品溶液HPLC图；

图25是30℃分析供试品溶液HPLC图；

图26是35℃分析供试品溶液HPLC图；

图27是40℃分析供试品溶液HPLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

仪器与试剂

高效液相色谱***：Agilent 1260高效液相色谱仪(配制真空脱气机和四元泵G1311C、柱温箱G1316A、自动进样器G1329B、二极管阵列检测器G4212B)。优普系列超纯水器：四川优普超纯科技有限公司。超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

对照品均购自中国食品药品检定研究所，(1)橙皮苷批号：110721-201316；(2)和厚朴酚批号：110730-201313；(3)厚朴酚批号：110729-200412。藿香正气口服液供试品批号为：16111406、16090943～16090946、16090949～16090951、16091025～16091027、16091030～16091033，由太极集团涪陵制药厂有限公司提供。藿香正气水是在药典购买的6个不同厂家产品作为供试样品。甲醇和乙腈均为色谱纯，水为二次去离子水，其余试剂均为分析纯。

实施例1

一种测定藿香正气口服液中有效成分的方法(同时测定橙皮苷/厚朴酚/和厚朴酚含量的方法)

标准对照品溶液的制备：精确称取橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚标准对照品，配制成表1所示的混合对照品溶液，0.45μm滤膜过滤，备用。

表1对照品溶液

供试品溶液的制备：准确量取藿香正气口服液原液5.0mL置入10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀后0.45μm滤膜过滤，备用。

(1)***适应性试验

取对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：(1)色谱柱：沃特世Xbridge C18,3.5μm，4.6×100mm；(2)柱温：35℃；(3)进样量：5μL；(4)流速：1.00mL/min；(5)流动相：乙腈-甲醇-0.4％甲酸水溶液，梯度洗脱程序如表2所示；(6)检测波长：橙皮苷检测波长为283nm，和厚朴酚及厚朴酚的检测波长为294nm。

表2梯度洗脱程序

结果如图1和图2所示，3种待测成分均能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度大于5.0，以橙皮苷色谱峰计算理论塔板数超过8000，以和厚朴酚及厚朴酚色谱峰计算理论塔板数均超过70000，且峰型好。

理论板数按橙皮苷色谱峰计算应不低于5000，理论板数按厚朴酚或和厚朴酚色谱峰计算应不低于20000。

(2)线性关系考察

精确称定橙皮苷(批号：110721-201316，以95.3％计)、和厚朴酚(批号：110730-201313，以99.1％计)及厚朴酚(批号：110729-200412，以99.0％计)对照品各10mg，准确配制成1.00、0.60、0.40、0.30、0.20、0.10、0.06、0.04、0.03、0.02、0.01mg/mL溶液。按照***适用性试验项下的色谱条件进行测定，以积分面积(Y)对浓度及积分面积(Y)对进样量建立回归方程(表3)。

表3线性回归方程

从表3可以看出，在该方法下检测最低样品浓度时的信噪比大于10，橙皮苷、和厚朴酚和厚朴酚的浓度在0.010～1.00mg/mL范围内线性良好。《中国药典》规定藿香正气口服液中橙皮苷含量不得低于0.1mg/mL，和厚朴酚和厚朴酚总剂量不得少于0.3mg/mL，因此该线性范围满足藿香正气口服液的含量测定要求。

(3)专属性试验

取本品供试品、不含橙皮苷的阴性样品及不含和厚朴酚及厚朴酚的阴性样品，按拟定样品处理方法处理，制备成供试品溶液、阴性样品溶液。按照***适用性试验项下的色谱条件，对阴性对照品和阳性供试样品进行HPLC检测。

结果如图3-5所示，不含橙皮苷的阴性样品及不含和厚朴酚及厚朴酚的阴性样品在主峰处无干扰，方法专属性良好。

(4)精密度试验

取标准对照品溶液和3份供试样品溶液，按照***适用性试验项下的色谱条件，连续进样，根据测定结果分别计算不同人员、不同日期和不同仪器测定结果的精密度。

3个不同人员对供试品中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚含量进行测定，RSD分别为0.68％、1.07％和0.99％，表明不同人员应用该方法测定结果精密度良好；连续3天对供试品中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚含量测定，RSD值分别为0.79％、1.14％和0.99％，表明日间精密度良好；3台不同仪器对供试品中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚含量进行测定，RSD值分别为0.75％、0.52％和0.85％，表明不同仪器测定结果精密度良好。

(5)重复性试验

按照供试品的制备方法，取样品(批号：16111406)制备7份供试品溶液，按照***适用性试验项下的色谱条件，根据标准对照品计算各成分的量。

结果供试品中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的RSD分别为0.62％、0.95％和0.75％，表明方法重复性良好。

(5)稳定性试验

按照供试品的制备方法，取样品(批号：16111406)制备3份供试品溶液，按照***适用性试验项下的色谱条件进行分析。其中试品溶液室温下密闭保存，存放120h。

橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚保留时间的RSD分别为1.60％、0.76％和1.10％，色谱峰面积的RSD分别为0.34％、0.50％和0.21％，表明制备的供试品溶液在120h内稳定性良好。

(7)回收率试验

分别精确称定橙皮苷(批号：110721-201316，以95.3％计)12.0mg、和厚朴酚(批号：110730-201313，以99.1％计)11.0mg、厚朴酚(批号：110729-200412，以99.0％计)10.0mg，用甲醇溶解后分别配制成橙皮苷0.24mg/mL、和厚朴酚0.22mg/mL及厚朴酚0.20mg/mL的标准溶液。取10mL容量瓶，分别依次精确向供试品溶液中加入3个待测成分(橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚)量的约0.5、1.0和1.5倍量标准物质，再用甲醇定容至刻度，按照***适用性试验项下的色谱条件进行分析。

结果橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的平均回收率分别为99.55％、99.19％和99.41％，RSD分别为0.56％、0.74％和1.00％。

实施例2

参数优化

(1)供试品制备方法

将供试品原液用甲醇或甲醇稀释1倍、2倍、2.5倍、5倍和不稀释，得到5种供试品，按照***适用性试验项下的色谱条件进行分析，结果橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量均无明显差异，说明溶剂和稀释倍数不会对检测结果造成影响。分别用水、20％、40％、60％、80％和100％的甲醇和乙醇将供试品稀释两倍，按照***适用性试验项下的色谱条件进行分析，结果当甲醇和乙醇的浓度低于60％时，与供试品原液及100％甲醇或乙醇稀释测定结果对比，测定橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量均偏小。因此，用80％以上的甲醇或乙醇稀释供试品为宜。

(2)流动相考察

分别考察了甲醇-水、乙腈-水，以及甲醇-乙腈-水不同流动相***，结果甲醇-水和乙腈-水对供试品中3种待测成分的分离情况不如甲醇-乙腈-水，因此选用甲醇-乙腈-水***；考察甲酸、乙酸和磷酸对待测成分色谱峰的影响，结果这三种酸适当的含量对橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚均有理想的分离效果。其中水溶液pH值小于2.7时，分离效果好。但pH值过低会影响色谱柱寿命。因此本方法优选0.3～0.6％的甲酸溶液或0.02～0.10％的磷酸溶液。

(3)梯度条件的选择

以甲醇-乙腈-0.4％甲酸水溶液为流动相，设置不同的梯度洗脱程序建立方法1～10，具体见表4～13所示。其它色谱条件：(1)色谱柱：沃特世Xbridge C₁₈,3.5μm，4.6×100mm；(2)柱温：35℃；(3)进样量：5μL；(4)流速：1.00mL/min；(5)检测波长：橙皮苷检测波长为283nm，和厚朴酚及厚朴酚的检测波长为294nm。

表4方法1

表5方法2

表6方法3

表7方法4

表8方法5

表9方法6

表10方法7

表11方法8

表12方法9

表13方法10

其中应用每个梯度洗脱程序方法进行HPLC分析时，都由两个等度流动相组合形成两个分析阶段，第一阶段为供试样品中橙皮苷的检测，待橙皮苷色谱峰出峰结束后，流动相调整后进行第二阶段分析；第二阶段为供试样品中和厚朴酚及厚朴酚的检测，待和厚朴酚及厚朴酚色谱峰出峰结束后，完成分析；然后用第一阶段流动相比例平衡色谱柱后，可进行下一个样品分析。每个梯度洗脱程序方法均能对藿香正气口服液中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚进行含量测定。根据仪器、流速、柱温、色谱柱规格等确定每个阶段具体的洗脱时间。根据方法1～10是根据梯度条件的选择项下的色谱条件，分析供试样品色谱图后，优化后确定的洗脱时间。

比较不同方法测定的3个待测成分的色谱峰，并记录每个个色谱峰图谱(图6～15)相关参数见表14。

表14不同方法对三种待测成分检测的色谱性能参数

根据色谱图6～15和表14中3种待测成分的色谱峰对称性、分离度和理论塔板数分析数据，判断不同梯度洗脱程序对这3种成分的分离性能。结果表明，各种方法对三种待测成分均能进行分析检测。但在甲醇-水和乙腈-水***中，待测成分色谱峰与相邻峰的分离度较差，且杂质峰干扰较为明显；而在甲醇-乙腈-水***中三种待测成分均有良好的分离效果。

根据上述分析结果，确定甲醇-乙腈-0.4％甲酸水溶液体系中，甲醇、乙腈和水在梯度洗脱程序中的各溶剂比例见表15所示。其中优选方法1改进的通用梯度洗脱程序如表16所示。

表15梯度洗脱程序和检测波长

表16优选梯度洗脱程序和检测波长

(4)不同色谱柱比较

选择不同厂家、不同型号、不同规格的7根色谱柱A～F：(A)Agilent Eclipsepluse c18色谱柱(3.5μm，4.6mm×100mm)；(B)Waters symmetry C18色谱柱(3.5μm，4.6mm×75mm)；(C)Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)；(D)Agilent EclipseXDB C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；(E)YMC-Pack ODS-A色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；F)Shim-Pack VP-ODS色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；(G)Waters XBridge C18色谱柱(3.5μm，4.6mm×100mm)。其它色谱条件：柱温为35℃，进样量为5μL或10μL(根据色谱柱规格确定)，流速为1.00mL/min；梯度洗脱程序如表16所示的方法。将供试样品溶液用HPLC分析，得到色谱图(图16～22)，进一步得到橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚色谱测定性能参数如表17所示。

表17色谱柱A～F检测三种待测成分的色谱数据

从表17中可以看出，在相同色谱条件下，用以上7根不同色谱柱对供试品中3个待测成分进行HPLC检测分析，均显示出良好的分离效果，峰形堆成对称、基线平稳，说明该方法对不同色谱柱均有良好的适用性，且其中待测成分橙皮苷和厚朴酚色谱峰的理论塔板数均优于《中国药典(2015年)》所规定的数值2000和5000。色谱柱填料粒径越小，色谱柱柱效越高；较小粒径填料和较短的色谱柱，分析速度越快。色谱柱填料粒径为3.5μm，柱长≤100mm，是属于快速色谱柱。选择快速色谱柱能提高待测样品分析效率，又能达到理想的分析效果。因此在兼顾分析效率和效果的前提下，优选填料粒径较小、柱长较短的快速色谱柱。根据试验结果，快速色谱柱虽然填料粒径小，但柱长短，色谱柱压力并不高，适用于目前常用的高效液相色谱仪。

(5)柱温的选择

按照***适用性试验项下的色谱条件，选择优选梯度洗脱程序(如表16所示)，在柱温分别为20℃、25℃、30℃、35℃和40℃下，对同一供试品溶液进行HPLC分析，得到的色谱图(图23～27)，进一步得到橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚色谱测定性能参数如表18所示。

表18不同柱温条件下检测三种待测成分的色谱数据

由表18可以看出，在考察温度范围内，随着柱温的升高，色谱峰保留时间提前，当温度升到35℃以上时，色谱峰保留时间提前不明显；随着柱温的升高，色谱柱柱压明显下降；色谱峰与相邻峰的分离度随温度升高略有升高后又呈下降趋势，色谱峰的对称性和理论塔板数没有发生明显的降低。综上分析，优选选择柱温为30～35℃。

实施例3

对21个不同批次的样品(由太极集团涪陵制药厂有限公司提供，批号见表21)，采用本发明方法和《中国药典(2015年)》方法分别测定藿香正气口服液中的橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚含量分别进行测定。根据分析得到的数据判定两种方法的是否存在显著性差异。按照以下步骤进行分析。

标准品溶液配制：精确称定橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚标准对照品，用甲醇稀释后，配制2份不同浓度的混合对照品溶液，如表19所示：

表19对照品溶液

1、采用本发明方法分析(标记为方法A)

1)供试品溶液制备：精确量取供试品原液5mL转移至10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，待测。

2)用高效液相色谱仪测定标准对照品溶液和供试样品溶液：将标准对照品溶液和供试样品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图。

高效液相色谱分析过程中的色谱条件为：(1)色谱柱：沃特世Xbridge C18,3.5μm，4.6×100mm；(2)柱温：35℃；(3)进样量：5μL；(4)流速：1.00mL/min；(5)流动相：乙腈-甲醇-0.4％甲酸水溶液，梯度洗脱程序如表20所示。

表20梯度洗脱程序

3)根据色谱图，以外标法计算供试样品溶液中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量，并根据稀释倍数换算供试品中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量。

2、采用《中国药典(2015年)》方法分析(标记为方法B)

1)供试品溶液制备：测定陈皮中橙皮苷含量时，精确量取供试品原液10mL转移至25mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得；测定厚朴中和厚朴酚与厚朴酚含量时，精确量取供试品原液5mL，加盐酸2滴，用10mL三氯甲烷萃取3次，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得；

2)用高效液相色谱仪测定标准对照品溶液和供试品溶液：将标准对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图。

高效液相色谱分析过程中的色谱条件为：(1)色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；(2)柱温：35℃；(3)流速：1.00mL/min；(4)流动相及检测波长：橙皮苷检测的流动相为甲醇-0.4％醋酸溶液，检测波长为283nm；和厚朴酚及厚朴酚检测的流动相为甲醇-异丙醇-水(36:21:36)，检测波长为294nm；(5)进样量：橙皮苷检测时进样量，分别精确吸取对照品与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪；和厚朴酚及厚朴酚检测时进样量，分别精确吸取对照品与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪。

3)根据色谱图，以外标法计算供试品溶液中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量，并根据稀释倍数换算供试品中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量。

根据以上所述的方法A和方法B，对21个批次(16090939～16090952和16091025～16091033)的藿香正气口服液产品中的橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚进行了含量测定，结果如表21所示。方法A所得数据是由本实验室完成，方法B所得数据是由太极集团涪陵制药厂质检中心提供。对供试样品中橙皮苷含量测定时，方法A和方法B的供试样品溶液制备，是将供试品原液分别用甲醇稀释2倍和2.5倍，理论上，供试样品稀释倍数不会对检测结果造成影响，所以这两种方法所得结果应该无明显差异。

表21方法A和方法B对21批次藿香正气口服液中3种成分的HPLC含量测定结果

由表21可以看出，测定结果表明在21个批次样品中，两种方法测定橙皮苷含量，其中17个批次的相对偏差小于2.0％，其余4个批次的相对偏差小于3.0％，表明两种方法所得的检测结果差异小，均能满足检测要求(藿香正气口服液中含陈皮以橙皮苷计，不得少于0.10mg/mL)。上述两种方法测定结果的差异主要来源于人员操作差异造成的人为误差，也有可能是仪器、方法存在的***误差。

在对样品中和厚朴酚与厚朴酚含量测定时，这两种方法测得结果差异明显。方法A比方法B测得和厚朴酚与厚朴酚总含量高出3.67％～17.45％，平均高出9.04％。因为供试样品制备方法的不同会对检测结果产生明显影响，用方法B检测本品中和厚朴酚与厚朴酚含量时，样品用三氯甲烷萃取，可能是三氯甲烷萃取不完全造成的；而方法A是直接将待测品用甲醇稀释后检测，结果应更准确。两种方法均能满足检测要求(藿香正气口服液中含厚朴以厚朴酚与和厚朴酚的总量计，不得少于0.30mg/mL)。

实施例4

采用实施例3中方法A对藿香正气水进行质量分析，检测其中橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚的含量。供试品制备方法为：精确量取5mL不同厂家生产的藿香正气水原液，转移至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，0.2μm滤膜过滤，待测。检测方法和步骤如实施例3中方法A所述，检测结果如表22所示。

表226个不同厂家藿香正气水中3个成分含量的HPLC测定结果

根据《中国药典》规定藿香正气水中橙皮苷含量不得低于0.18mg/mL，和厚朴酚和厚朴酚总量计不得少于0.58mg/mL。该方法检测6个不同厂家藿香正气水指标性成分含量均符合《中国药典》规定的质量要求。

综上，本发明方法可用于藿香正气口服液和藿香正气水产品的质量评价和控制。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种测定藿香正气口服液中有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)标准对照品溶液的制备：

取橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚标准对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1mL含橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚分别为0.05～0.30mg的混合溶液；0.2～0.5μm滤膜过滤，待测；

2)供试品溶液的制备：

取藿香正气口服液原液或将原液用60～100％的甲醇/乙醇稀释2-5倍；0.2～0.5μm滤膜过滤，待测；

3)采用高效液相色谱仪测定：

将步骤1)和2)制备的标准溶液和供试品溶液放入高效液相色谱仪中，采用两阶段梯度洗脱法测定，色谱条件如下：

色谱柱为C18色谱柱，柱温为25～40℃，流动相为甲醇-乙腈-水，流速为0.2～2mL/min，进样量为2～20μL(根据液相色谱仪和色谱柱规格确定实际进样量、流速)；梯度虚脱程序按照下表进行：

4)供试品中橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚三种含量计算：

首先用橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚标准对照品溶液所得到的HPLC色谱峰为对照，制备标准对照图谱，并建立浓度与积分面积的线性方程；然后用外标法以标准溶液色谱图为对照，计算供试品中橙皮苷、厚朴酚及和厚朴酚三种成分的含量；

其中，步骤3)中所述的两阶段梯度洗脱法是：第一阶段检测待测样品中橙皮苷的含量，待橙皮苷色谱峰出峰结束后，调整流动相比例，进行第二阶段分析；第二阶段检测待测样品中厚朴酚及和厚朴酚两种成分含量，待厚朴酚及和厚朴酚的色谱峰出峰结束后，即完成一个样品分析；然后色谱柱平衡至第一阶段流动相后，可进行下一个样品分析。

2.根据权利要求1所述测定藿香正气口服液中有效成分的方法，其特征在于，所述流动相中水含有小于0.7％的甲酸或乙酸，或水中含有小于0.1％的磷酸。

3.根据权利要求1所述测定藿香正气口服液中有效成分的方法，其特征在于，所述步骤3)中的液相色谱仪是高效液相色谱仪(HPLC)、超高效液相色谱仪(UPLC)、中压液相色谱仪或低压液相色谱仪。

4.根据权利要求1～3任一所述测定藿香正气口服液中有效成分的方法，其特征在于，适用于用于藿香正气水中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚含量测定，即方法适用于藿香正气水有效成分的含量测定。