CN104998071A - 一种果上叶复方制剂及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果上叶复方制剂,按重量份数计,由以下原料药制成:倒提壶220~420份、白及60~260份、葎草100~300份和果上叶50~190份。本发明的果上叶复方制剂,具有祛风除湿,散寒止痛,补阴敛汗,收敛止血,消肿生肌,清热解毒等功效,能够治疗肺痨咳嗽、肺热咳嗽、疮疡肿毒等多种疾病,为结核病的治疗提供了中药新品种,为该病患者提供新的治疗药物;本制剂处方中的葎草、果上叶等药材为贵州省少数民族用药,药材资源丰富,也是贵州省民间长期所用的抗痨民族药;本制剂的检测方法专属性强,精密度高,重现性好,回收率高,测量结果准确,可有效控制药品质量,从而确保产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。
Description
技术领域
本发明涉及一种果上叶复方制剂及其制备方法和检测方法,属于中药技术领域。
背景技术
肺痨又称肺结核,是由结核菌引起的一种慢性肺部传染病,是肺病中的常见病。是一种由于正气虚弱,感染痨双侧虫,侵蚀肺脏所致的,以咳嗽、咯血、潮热、盗汗及身体逐渐消瘦等症为主要临床表现、具有传染性的慢性消耗性疾病。可以分为原发性和继发性两大类,前者为人体第一次感染结核菌引起的病变,称之为原发感染,多见于幼儿和少年,而后者则在原发感染的基础上,残留在病灶内,***内的结核菌长期潜伏,当机体抵抗能力下降时,结核菌又可活跃、繁殖而致病,我们称之为内源性复发,又称之为继发性肺结核。这是成人肺结核发病的主要形式,但外界再次感染结核菌也可引起发病。
目前,推行使用的治疗方案主要有两种:初治方案(2H3R3Z3E3/4H3R3)和复治方案(2S3H3R3Z3E3/6H3R3E3),分别用异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇,复治方案加用链霉素强化治疗2个月,然后用异烟肼、利福平,复治方案加用乙胺丁醇再分别治疗4或6个月,两个方案均采用隔日顿服方式给药,使患者体内一次达到一个血药高峰浓度,杀死结核菌。一般病情轻浅,早期接受治疗者,均可康复;如迁延日久,全身虚弱症状明显,如极度消瘦,短气,咯血,面色青晦,脉小数疾等,则多属难治。
少数民族使用的、以本民族传统医药理论和实践为指导的药物,称为民族药。各少数民族地区有着独特的自然条件和生活习俗,长期实践形成了对某些疾病独特的治疗经验。其中贵州省少数民族用药葎草、果上叶、白及等药材具有清热解毒,利水消肿的功效,用于肺痨咳嗽等。选用适当的民族药,采取现代优选的提取工艺与制备工艺,制得药品,将为结核病的治疗提供一个确有疗效的中药新品种,为该病患者提供新的治疗药物。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种果上叶复方制剂及其制备方法和检测方法。本发明提供的复方制剂采用贵州省少数民族用药,药材资源丰富,提取制备工艺合理,有效成分含量稳定,从而保证了疗效的稳定,本发明提供的检测方法,测量结果准确,可有效控制药品质量。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种果上叶复方制剂,按重量份数计,由以下原料药制成:倒提壶220~420份、白及60~260份、葎草100~300份和果上叶50~190份。
前述果上叶复方制剂按重量份数计,优选由以下原料药制成:倒提壶320份、白及160份、葎草200份和果上叶120份。
前述制剂是以可溶性淀粉为辅料制成的胶囊剂。
本发明果上叶复方制剂的制备方法:按重量比例称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶加6~10倍量65%~85%乙醇,提取1~3次,每次提取1~2h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及加6~10倍量的水,提取1~3次,每次提取1~2h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,减压浓缩,浓缩液真空干燥,得浸膏提取物,粉碎过筛,得到药粉,再加入辅料制成各种药物制剂。
优选的制备方法为:按重量比例称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果 上叶分别加10倍量、8倍量85%乙醇,回流提取2次,每次提取2h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加9倍量、8倍量、8倍量的水,煎煮提取3次,每次提取2h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,再加入辅料制成各种药物制剂。
进一步地,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,以85%的乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃逐渐升温中干燥,颗粒装入胶囊,即得胶囊剂。
果上叶复方制剂(胶囊剂)的检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目;鉴别是对白及、葎草、倒提壶、果上叶的薄层色谱鉴别;含量测定是用高效液相色谱法测定制剂中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量;白及的鉴别方法是以白及对照药材为对照,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2.5∶1为展开剂的薄层色谱法,葎草的鉴别方法是以木犀草苷对照品为对照,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水=7∶3∶1∶1.2为展开剂的薄层色谱法,倒提壶的鉴别方法是以β-谷甾醇对照品为对照,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂的薄层色谱法,果上叶的鉴别方法是以果上叶对照药材为对照,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂的薄层色谱法;制剂中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量测定方法是以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品为对照,以甲醇-水=47∶53为流动相的高效液相色谱法。
具体的鉴别方法包括以下项目中的一项或几项:
(1)取本制剂内容物2g,加70%甲醇20mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL溶解,用***振摇提取两次,每次20mL,合并***液,浓缩至1mL作为供试品溶液;另取白及对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液2μL,对照药材溶液5μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2.5∶1为展开剂,展开,取出,晾干,105℃加热数分钟,放置30min~60min,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(2)取本制剂内容物1g,加20mL水回流提取1h,过滤,滤液加盐酸调酸性,用乙酸乙酯萃取三次,每次20mL,滤液挥干,加甲醇2mL稀释作供试品溶液;另取木犀草苷对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯一丙酮一甲酸一水=7∶3∶1∶1.2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇溶液,供试品色谱图中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(3)取本制剂内容物2g,加三氯甲烷20mL,超声处理15min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为供试品溶液;另取β-谷甾醇对照品适量,加三氯甲烷制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1.5μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(4)取本制剂内容物0.5g,加三氯甲烷20mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液;取果上叶对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液4μL, 对照药材溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上显相同颜色的斑点。
具体的含量测定方法为:照中国药典2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定:
色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水=47∶53为流动相;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为221nm;理论板数按1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰计算应不低于5000;
对照品溶液的制备取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯100μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本制剂内容物0.2g,精密称定,加20mL甲醇回流提取1小时,放冷过滤,挥干,加甲醇定容至10mL,过滤,即得;
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,测定,即得。
前述检测方法包括:
性状:本制剂为胶囊剂,内容物为棕褐色粉末,气微,味微苦;
鉴别:(1)取本制剂内容物2g,加70%甲醇20mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL溶解,用***振摇提取两次,每次20mL,合并***液,浓缩至1mL作为供试品溶液;另取白及对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液2μL,对照药材溶液5μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2.5∶1为展开剂,展开,取出,晾干,105℃加热数分钟,放置30min-60min,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(2)取本制剂内容物1g,加20mL水回流提取1h,过滤,滤液加盐酸调酸性,用乙酸乙酯萃取三次,每次20mL,滤液挥干,加甲醇2mL稀释作供试品溶液;另取木犀草苷对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水=7∶3∶1∶1.2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇溶液,供试品色谱图中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(3)取本制剂内容物2g,加三氯甲烷20mL,超声处理15min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为供试品溶液;另取β-谷甾醇对照品适量,加三氯甲烷制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1.5μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(4)取本制剂内容物0.5g,加三氯甲烷20mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液;取果上叶对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液4μL,对照药材溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在 与对照药材色谱相对应的位置上显相同颜色的斑点;
检查:应符合《中国药典》2010年版一部附录I C胶囊剂项下有关的各项规定;
含量测定:照中国药典2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定:
色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水=47∶53为流动相;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为221nm,理论板数按1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰计算应不低于5000;
对照品溶液的制备取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯100μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本制剂内容物0.2g,精密称定,加20mL甲醇回流提取1小时,放冷过滤,挥干,加甲醇定容至10mL,过滤,即得;
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,测定,即得。
本发明制剂是由葎草、果上叶、倒提壶和白及药材组成的复方制剂,能够治疗肺痨咳嗽、肺热咳嗽、疮疡肿毒等多种疾病。
葎草为桑科植物葎草Humulus scandens(Lour)Merrr.的干燥全草,为贵州省少数民族用药;具有清热解毒,利水消肿的功效,用于肺痨咳嗽,潮热,小便不利等。葎草化学成分比较复杂,但主要有效成分为黄酮类化合物,此外还含有挥发油类、萜类、生物碱类、氨基酸及微量元素等;黄酮类化合物具有抗结核作用,对肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、白喉杆菌等均有抑制作用。
倒提壶为毛茛科翠雀花属云南翠雀花的块根,为贵州省少数民族用药,主要有效成分为二萜类生物碱,具有祛风除湿、散寒止痛、通络散瘀、镇痛、消炎、杀虫之功效。主要用于风湿关节痛、胃寒疼痛、跌打损伤、小儿肺炎、癫痫等症。
白及为兰科植物白及Bletilla striata(Thunb)Reichb.f.的干燥块茎;具有收敛止血,消肿生肌的功效,用于咯血,吐血,疮疡肿毒,皮肤皲裂等。化学成分主要有白及胶、联苄类、菲类、联菲类、联苄葡萄糖苷类、甾体、三萜类等化合物。药理研究其乙醇浸液对枯草杆菌和人性结核杆菌均具有抑制作用,临床研究白及中药复方主要用于肺结核、原发性肺癌、咯血、支气管炎等症。
果上叶为兰科植物云南石仙桃Pholidota yunnanensis Rolfe的干燥根状茎和假鳞茎,其主要化学成分为三萜类化合物;具有养阴清肺,化痰止咳、行气止痛的功效,用于肺结核咳嗽、咯血、***等。
方中葎草为君药,倒提壶为臣药,白及和果上叶为佐药,四药合用,协同增效,共奏祛风除湿、清热解毒、利水消肿、养阴清肺、化痰止咳、行气止痛之功效,对肺痨咳嗽、肺热咳嗽、疮疡肿毒等疾病有良好的治疗效果。
根据方中各药味的化学性质和理化特性,将葎草、果上叶和倒提壶三味药醇提,醇提后的药渣与白及一起水提,使有效成分充分溶出,这样既能保留醇提有效成分,又能使各味药的水提成分不被损失;并制成人体易于吸收,起效迅速,携带方便的胶囊等剂型。
本发明所述的白及购自贵阳市药材市场,葎草自采于贵阳花溪,果上叶自采于贵州六枝。经鉴定白及符合《中国药典》2010年版“白及”项下各项规定;葎草符合《贵州省中药材、民族药材》2003年版“葎草”项下各项规定;果上叶符合《贵州省中药材、民族药材》2003 年版“果上叶”项下各项规定;倒提壶符合《贵州省中药材、民族药材》2003年版“倒提壶”项下各项规定。淀粉:系自禾本科植物玉蜀黍Zea mays L.的颖果或大戟科植物木薯Manihot utilissima Pohl.的块根中制得的多糖类颗粒。所用辅料淀粉符合《中国药典》2010年版二部“淀粉”项下的规定。
为了确保本发明的效果,申请人在确定药物组方之后还对其制备工艺、药效以及制剂的检测方法进行了相应的试验研究,具体如下:
一、制备工艺研究
(一)工艺线路的确定
根据方中各药味的化学性质和理化特性,确定葎草、果上叶和倒提壶适用于醇提,白及适用于水提。将本发明的工艺路线确定如下:
(1)葎草、果上叶和倒提壶醇提,药渣备用;
(2)药渣与白及加水提取。
(二)提取工艺的优选
1、仪器与试药:
仪器超高效液相色谱仪:Waters Acquity UPLC H-Class***,包括四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、PDA检测器和Empower3数据处理工作站;AE240电子天平(上海梅特勒有限公司),AB204-S分析天平(上海);BUCHI旋转蒸发仪R-200(瑞士步琪公司);HS10260D型超声波清洗器(天津奥泰);HH-4数显恒温水浴锅(上海浦东物理光学仪器厂);真空干燥箱DZF-0(上海贺德实验设备有限公司);100克多功能粉粹机LX-02(上海江信科技有限公司)
试药1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品(Mi litarine)(上海同田生物技术股份有限公司,批号∶13040221);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号∶0080-97050);甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);水(纯净水);其他试剂均为分析纯。
2、醇提工艺优选
2.1药材吸醇率的考察
按处方比例量称取葎草、果上叶和倒提壶药材三份,加6倍量的乙醇浸泡,每隔20min观察一次浸泡情况,每次称量药材的湿重,直至两次湿重误差不大为止,按下式求得湿重结果,结果见表1。
表1药材吸醇率考察表
结论:首次加醇提取时,应补足药材170.5%的吸醇量,为方便生产计算,首次加醇提取时,以全部醇提药材多加二倍量乙醇。
2.2提取工艺条件的考察
2.2.1提取溶媒及提取方法的优选
醇提药材以芦丁为指标性成分,通过预实验表明,用乙醇提取效果好于甲醇,见表2;回流提取效果好于超声提取,见表3。
表3不同提取方法提取芦丁含量比较
2.2.2醇提正交试验设计
根据初筛试验结果,确定用乙醇为提取溶剂,采用回流提取方法,选择提取工艺中对提取率有影响的四项因素,即乙醇浓度A,乙醇剂量B,提取次数C,提取时间D。每个因素选择3个水平,采用四因素三水平正交试验表L9(34)设计试验方案,见表4。
表4醇提L9(34)正交试验因素及水平表
2.2.3实验过程
(1)样品溶液的制备
按处方比例量称取葎草、果上叶和倒提壶醇提药材,按表6正交表设计的试验方案进行提取,所得的醇提液滤过,混匀,取续滤液,过0.2μm滤膜,备用。
(2)对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品0.54mg,加甲醇定容于10mL容量瓶中,制成0.054mg/mL的对照品溶液。
(3)出膏率的测定
精密吸取上述醇提液50mL置干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,然后转移到105℃烘干箱中干燥3h,迅速移至干燥器中冷却30min,称重,计算出膏率。
W50mL:50mL样品溶液的浸膏重量
v总:样品总体积
W药材:药材重量
(4)指标成分的选定
以芦丁含量、出膏率为考察指标,优选最佳醇提工艺。
2.2.4芦丁的含量测定
(1)色谱条件
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm);流动相:甲醇-水(27∶73);流速:0.3mL·min-1;检测波长:255nm;柱温:35℃;运行时间7分钟,进样量2.5μL。如图 1和图2所示。
(2)标准曲线
分别精密吸取对照品溶液0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL,注入超高效液相色谱仪,测定峰面积。以芦丁的进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为y=5.7×106x-55290,r2=0.9998,结果表明,芦丁含量在0.027μg~0.162μg范围内成线性关系。如表5和图3所示。
表5芦丁的线性关系
(3)正交试验设计及结果
按处方称取醇提药材以L9(34)正交试验条件分别提取,滤过,得供试品溶液。以芦丁含量、干膏率为指标,采用综合评价(综合评价=芦丁含量/最大芦丁含量×70+干膏率/最大干膏率×30)为指标,得最佳提取工艺。见表6和表7。
表6醇提正交试验结果(n=3)
表7 SPSS软件方差分析结果
a为:R2=0.868(调整R2=0.828)
由表6和表7可知,乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间对实验结果均具有显著性差异,85%乙醇浓度较75%乙醇和65%乙醇提取含量高,8倍量乙醇比6倍量和10倍量提取含量高,提取2次比提取1次和3次含量高,提取2h比提取1h和1.5h含量高,而各因素影响提取工艺中的先后主次顺序为乙醇用量>提取次数>提取时间>乙醇浓度。故本发明最佳醇提取工艺条件为A3B2C2D3,即醇提取最佳工艺为8倍量85%乙醇提取2次每次2h。
(4)工艺验证试验
按处方比例量称取葎草、果上叶和倒提壶三种醇提药材,按最佳提取方案A3B2C2D3进行验证试验,以前法测定芦丁含量和出膏率。见表8。
表8醇提工艺验证结果
由表8可知,进行3批次的验证试验,8倍量85%乙醇提取2次每次2h提取率及芦丁的含量无明显的差异,证明该工艺稳定、合理、可行。
3、水提工艺优选
3.1药材吸水率的考察
称取白及药材3份,按处方比例量与醇提后的药渣混合,加6倍量的水浸泡,每隔20min观察一次浸泡情况,每次称量药材的湿重,直至两次湿重误差不大为止,按下式求得湿重结果,见表9。
表9药材吸水率考察表
结论:首次加水煎煮时,应补足药材89.41%的吸水量,为便于生产计算,首次加水提取时,以全部水提药材多加一倍量水。
3.2水提正交实验设计
根据查阅相关文献及白及的主要有效化学成份,结合本实验情况,将白及与醇提后的药渣合并后一起水提,对影响提取效果的主要因素加水量、提取次数、提取时间进行考察,每个因素选取3个水平,采用正交表L9(34)进行试验,因素水平见表10。
表10水提药材正交试验因素及水平表
3.3实验过程
(1)样品溶液的制备
按处方比例量将白及与醇提药渣混合,按表12正交表设计的实验方案进行,过滤,混匀,吸取25mL混合液,水浴蒸干,用甲醇定容到25mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。
(2)对照品溶液的制备
精密称取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品0.396mg,加甲醇定容于10mL容量瓶中,制成浓度为0.0396mg/mL的对照品溶液。
(3)出膏率的测定
精密吸取上述水提液50mL置干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,然后转移到105℃烘干箱中干燥3h,迅速移至干燥器中冷却30min,称重,计算出膏率。
W50mL:50mL样品溶液的浸膏重量
v总:样品总体积
W药材:药材重量
(4)指标成分的选定
以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量和出膏率为考察指标,优选最佳水提工艺。
3.41,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量测定
(1)色谱条件
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm),波长:221nm,柱温35℃,甲醇∶水=40%∶60%,0.35mL/min,运行时间6min。如图4和图5所示。
(2)标准曲线
分别精密吸取对照品溶液0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL,注入超高效液相色谱仪,测定峰面积。以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为y=5.7×106x-19191,r2=0.9996,结果表明,1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量在0.01584μg~0.1188μg范围内成线性关系。如表11和图6所示。
表11 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的线性关系
(3)正交试验设计及结果
醇提后的药渣与白及按处方比例量混合,以L9(34)正交试验条件分别提取,滤过,得供试品溶液,吸取25mL混合液,水浴蒸干,用甲醇定容到25mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量、出膏率为指标,采用综合评价(综合评价=1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量/最大1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量×70+出膏率/最大出膏率×30)为指标,得最佳水提取工艺。见表12和表13。
表12水提正交试验结果(n=3)
表13 SPSS软件方差分析结果
a为:R2=0.868(调整后R2=0.828)
由表12和表13可知,加水量、提取次数、提取时间对实验结果均具有显著性差异,8倍量水比6倍量水和10倍量水提取含量高,提取2h比提取1h和1.5h含量高,提取3次比提取1次和2次含量高;而各因素影响提取工艺中的先后主次顺序为提取次数>提取时间>加水量。故本发明最佳水提取工艺条件为A2B3C3,即水提取最佳工艺为8倍量水提取3次每次2h。
(4)工艺验证试验
按最佳提取方案A2B3C3对水提药材进行验证试验,以前述色谱方法来测定1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量和出膏率。见表14。
表14水提工艺验证结果
由表14可知,进行3批次的验证试验,8倍量水提取3次每次2h提取率及1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量无明显的差异,证明该工艺稳定、合理、可行。
4、浓缩及干燥方式考察
浓缩是中药制剂原料成型前处理的重要单元操作,中药提取液有的清,有的黏,有的具 有热稳定,有的极易不稳定,所以在生产中要根据中药提取液的性质选择适宜的浓缩方法。常用的浓缩蒸发方法有常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发和多效蒸发。本实验采用工业生产中最常见的真空浓缩,在此工艺条件下,浓缩时间短,无论是醇提药液还是水提药液都能快速有效的浓缩。
称取葎草、果上叶和倒提壶三味药材加入8倍量85%乙醇提取2次每次2h,药渣与白及按处方比例混合进行水提,加入8倍量水提取3次每次2h,醇提液与水提液减压浓缩到一定密度,混合,比较常压干燥与减压干燥两种干燥方式的效果,通过考察芦丁、1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量、浸膏的松脆度、时间等因素,确定最佳干燥方式。结果见表15。
表15不同干燥方式的影响
结论:综合考虑干膏的化学成分、性状、有效成分含量、时间等因素,选择真空干燥为最佳干燥方式。
5、成型工艺研究
5.1辅料的选择
复方果上叶药物的干膏粉暴露在空气中很快就会吸潮,所以要选择合适的辅料作为抗吸潮剂和赋形剂,由于淀粉在空气中很稳定,与大多数药物不起作用,同时亦可作为吸收剂和崩解剂,具有吸湿性弱、来源广、价廉的优点,所以本实验选用可溶性淀粉作为辅料。
5.2赋形剂与药粉的比例
浸膏粉与可溶性淀粉按3∶4、4∶3、2∶1、1∶1四个不同重量比例制粒,观察制粒效果、外观及吸湿性,结果见表16。
表16可溶性淀粉与药粉的比例考察表
结论:由上表可知,浸膏粉与淀粉比例为4∶3时,样品不吸潮,效果较好,因此浸膏粉与淀粉的重量比例4∶3为最佳比例。
5.3润湿剂的考察
本制剂因干膏量较大,为了更好地保证制剂的稳定性及成型率,本实验选择乙醇做为润湿剂,对不同浓度的乙醇进行制粒考察,见表17。
表17润湿剂考察结果
结果表明,85%乙醇作润湿剂易于制粒,颗粒均匀,成型效果好,因此选用85%乙醇做为 润湿剂。
5.4堆密度的测定
称取2g药粉,装入10mL量筒中,以一定高度落下数次(尽量保持条件一致),使松紧适宜,以重量及容量计算堆密度,堆密度=重量(g)/容积(mL)。结果见表18。
表18 三批样品堆密度测定结果
5.5休止角测定
将漏斗圈定于水平放置的绘图纸上,漏斗下口距绘图纸的距离为H,把颗粒倒入漏斗直至漏斗的出口与园罐尖端接触,量取圆锥体底部直径(2R)及圆锥高(H),根据tanθ=H/R计算出θ。结果见表19。
表19 三批样品休止角测定结果
结果表明颗粒的平均休止角为32.37度,说明颗粒的流动性较好。
5.6临界相对湿度优选
将称量瓶干燥至恒重后放入约2mm的药粉,平铺于恒重的瓶底,精密称定后置所列的7种不同浓度的硫酸溶液干燥器中(称量瓶盖打开),于25℃的恒温培养箱中,保持96h后称重,计算吸湿率,结果见表20。计算公式:
吸湿率(%)=(吸湿至恒重药粉重﹣干燥至恒重的药粉重)/干燥至恒重的药粉重×100%
表20不同相对湿度中粉末的吸湿度
以相对湿度为横坐标,吸湿度为纵坐标,绘制吸湿曲线,沿吸湿曲线直线两端做该曲线切线,两曲线交点横坐标即为临界相对湿度(CRH),临界相对湿度为62%,因此在粉碎、制粒、包装及贮存的环境应控制相对湿度小于62%,并采用防潮好的包装。如图7所示。
5.7复方果上叶胶囊制备工艺流程图,如图8所示。
6、中试生产研究
根据正交试验优化确定的最佳工艺条件,按1000粒制剂处方量投料,试制三批小试产品,批号分别为20131208、20131228、20140228。并按质量标准及胶囊剂项下的要求进行检测,结果见表21和表22。
表21 1000粒制剂处方量的原料投入量
表22 三批中试产品检测数据
中试生产研究结果表明,采用优化的提取、成型工艺,其成型率可达98%以上,三批成品的成型率基本稳定,同时检测了成品的多项指标,白及药材中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的转移率是55%,结果表明该工艺简单可行稳定。
二、制剂检测方法的研究与论证
1、性状本制剂为胶囊剂,内容物为棕褐色粉末,气微,味微苦。
2、鉴别
2.1白及薄层色谱鉴别
依据薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录VI B药典标准及查阅相关文献进行试验。
供试品溶液的制备:取本发明复方果上叶胶囊内容物2g,加入70%甲醇20mL,超声处理30min后,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL使之溶解,然后用***振摇提取两次,每次20mL,合并***液,挥干至1mL作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备:取白及对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备:按复方果上叶胶囊制剂处方,依据制剂制备工艺制备无白及的阴性胶囊样品,取复方果上叶阴性胶囊2g,按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
样品点样量的选择:样品点样量的大小直接影响色谱图的清晰程度。该鉴别实验供试品溶液点样量首先选为3μL,结果供试品溶液色谱图有斑点,但比较模糊,看到的图谱似乎有干扰;点样量降为1.5μL时,斑点相对清晰一些,但看起来比较小,仍然不够理想;经过分析后将样品点样量调为2μL,结果色谱图样品斑点比1.5μL时清晰,阴性位置无干扰。因此样品点样量最终选择为2μL。
薄层板:硅胶G板(青岛海洋化工厂)
展开剂:环己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶2.5∶1)
点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各2μL,对照药材溶液5μL
显色剂:10%硫酸乙醇溶液
显色条件:喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热数分钟,放置30min-60min,置紫外光灯365nm下检视
结论:在该色谱条件下,Rf值在规定范围内,展距合适。在供试品色谱图中,在与对照药材色谱相对应的位置上显示相同颜色的斑点,经多次试验,方法灵敏,重复性及专属性好,方便可行,阴性无干扰,故列入本发明检测项目。如图9所示。
2.2葎草薄层色谱鉴别
葎草主要含有黄酮类化合物,也是其主要药效成分。实验分别以芦丁、木犀草苷为葎草药材的指标性成分进行了薄层色谱鉴别研究。
供试品溶液的制备:取复方果上叶胶囊内容物1g,放入圆底烧瓶中,加水20mL,加热回流提取1h,滤过,滤液加盐酸至酸性,用乙酸乙酯萃取3次,每次20mL,合并乙酸乙酯萃取液,蒸干,加入2mL甲醇稀释作为供试品溶液。
对照品的选择:首先选择以芦丁为对照品,对照品溶液的制备:精密称取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1ml含2mg的对照品溶液;展开剂:醋酸乙酯:甲酸:水(8∶1∶1);显色剂:三氯化铝试液;显色:365nm显色;点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各5μL,对照品3μL;薄层板:G板(青岛海洋化工厂);结果:该色谱条件下,在供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上无斑点出现。而以木犀草苷为对照品的实验结果是与对照品相对应的位置上有相同颜色斑点出现。因此葎草薄层鉴别选择以木犀草苷对照品作为对照。
对照品溶液的制备:取木犀草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含2mg的对照品溶液。
阴性对照溶液的制备:按复方果上叶胶囊制剂处方,依照制剂制备工艺制成无葎草的阴性胶囊样品,取复方果上叶胶囊阴性样品1g,按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
点样量的选择:首先取供试品溶液和阴性对照溶液各2μL,木犀草苷对照品1μL,结果供试品色谱图中,在与木犀草苷相对应的位置上有相同的斑点出现,但是样品斑点偏大,且对照品斑点不明显。后将供试品点样量改为1μL,对照品为2μL,展开***与其它色谱条件均不变。结果供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上有相同颜色的斑点。因此点样量最终确定为供试品与阴性对照溶液各1μL,木犀草苷对照品2μL。
薄层板:硅胶G板(青岛海洋化工厂)
展开剂:乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7∶3∶1∶1.2)
显色剂:5%三氯化铝醇溶液
点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各1μL,对照品2μL
结论:在供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上有相同颜色斑点,经多次试验,方法灵敏,重复性及专属性好,方便可行,阴性无干扰,故列入本发明检测项目。如图10所示。
2.3倒提壶薄层色谱鉴别
倒提壶主要含有二萜类生物碱化合物,同时也是其主要药效成分。实验以β-谷甾醇为倒提壶药材的指标性成分进行薄层色谱鉴别研究,结果供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上有相同颜色斑点,且阴性无干扰。
供试品溶液的制备:取复方果上叶胶囊内容物2g,加三氯甲烷20mL,超声处理15min,过滤,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使之溶解作为供试品溶液。
对照品溶液的制备:精密称取β-谷甾醇对照品适量,加三氯甲烷制成1mL含2mg的溶 液。
阴性对照溶液的制备:按复方果上叶胶囊制剂处方,依照制剂制备工艺制备无倒提壶的阴性样品,取复方果上叶阴性胶囊2g,按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
展开剂比例及点样量的选择:取供试品溶液,展开剂∶环己烷-***-乙酸乙酯(40∶11∶5);点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各2μL,对照品1μL;显色剂:10%硫酸乙醇溶液;显色条件:喷以10%硫酸乙醇液,在105℃加热至斑点清晰;结果:在供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上有相同颜色斑点,阴性无干扰,但样品Rf值偏小,其斑点偏大且有干扰,对照品斑点偏小。将展开剂的比例调为环己烷-***-乙酸乙酯(40∶11∶15),点样量改为供试品溶液与阴性对照溶液各1.5μL,对照品2μL,其它薄层色谱条件均不变,结果:在供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上有相同颜色斑点,Rf值为0.4,且阴性无干扰。因此,展开剂比例最终确定为环己烷-***-乙酸乙酯(40∶11∶15);点样量最终确定为供试品与阴性对照溶液各1.5μL,对照品2μL。
薄层板:硅胶G板(青岛海洋化工厂)
展开剂:环己烷-***-乙酸乙酯(40∶11∶15)
点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各1.5μL,对照品2μL
显色剂:10%硫酸乙醇液
显色条件:喷以10%硫酸乙醇液,在105℃加热至斑点清晰
结论:在供试品色谱图中,在与对照品相对应的位置上有相同颜色斑点,经多次试验,方法灵敏,重复性及专属性好,方便可行,阴性无干扰,故列入本发明检测项目。如图11所示。
2.4果上叶薄层色谱鉴别
果上叶主要含有三萜类化合物,同时也是其主要药效成分。实验分别以齐墩果酸对照品、果上叶对照药材为指标性成分进行了果上叶薄层色谱鉴别研究。
供试品溶液制备:取复方果上叶胶囊内容物约0.5g,加三氯甲烷20mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液。
对照品的选择:首先选择齐墩果酸对照品,对照品溶液的制备:取齐墩果酸对照品适量,加甲醇适量制成1mg/1ml的溶液;展开剂:三氯甲烷-甲醇-甲酸(40∶1∶1);点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各4μL,对照品溶液3μL;显色剂:10%硫酸乙醇溶液;显色条件:喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰;结果:供试品色谱中,在与齐墩果酸对照品相对应的位置上无斑点。而以果上叶对照药材为指标性成分的实验结果是与对照药材相对应的位置上有相同颜色斑点出现。因此果上叶薄层鉴别选择以果上叶对照药材作为对照。
对照药材溶液的制备:取果上叶对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。
阴性对照溶液的制备:按复方果上叶胶囊制剂处方,依照制剂制备工艺制备无果上叶的阴性样品,取复方果上叶阴性胶囊2g,按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
展开剂:三氯甲烷-甲醇-甲酸(40∶1∶1)
点样量:供试品溶液与阴性对照溶液各4μL,对照药材溶液2μL
显色剂:10%硫酸乙醇溶液
显色条件:喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰
结论:供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上显相同颜色的斑点,经多次试验,方法灵敏,重复性及专属性好,方便可行,阴性无干扰,故列入本发明检测项目。如图 12所示。
4、高效液相色谱法测定制剂中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量
4.1仪器与试药
仪器 Agilengt 1100型高效液相色谱仪(G1315B型DAD检测器,G1311A型泵,G1311A自动进样器);AE240电子天平(上海梅特勒有限公司),AB204-S分析天平(上海);BUCHI旋转蒸发仪R-200(瑞士步琪公司);HS10260D型超声波清洗器(天津奥泰);HH-4数显恒温水浴锅(上海浦东物理光学仪器厂);
试药 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品(上海同田生物技术股份有限公司,批号:13040221);甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);水(纯净水);其他试剂均为分析纯。
4.2供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的优选
精密称取复方果上叶胶囊内容物约0.2g,加入10mL75%乙醇,回流提取30min,放冷,过滤,用甲醇定容于10mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。见表23。
表23复方果上叶胶囊提取溶剂的比较(n=3)
结论:由表23可知,甲醇提取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量高于75%乙醇提取,因此采用甲醇提取。
(2)提取方法的优选
①超声提取法
精密称取复方果上叶胶囊内容物约0.2g,加入10mL甲醇,超声30min,放冷,过滤,用甲醇定容于10mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。
②回流提取法
精密称取复方果上叶胶囊内容物约0.2g,加入10mL甲醇,回流提取30min,放冷,过滤,用甲醇定容于10mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。见表24。
表24复方果上叶胶囊提取方法的比较(n=3)
结论:由表24可知,回流提取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量高于超声提取,因此,本实验采用回流提取方法提取。
(3)提取溶剂用量的优选
精密称取复方果上叶胶囊内容物约0.2g,分别加入10mL、15mL、20mL、25mL甲醇,回流提取30min,放冷,过滤,用甲醇定容于10mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。见表25。
表25复方果上叶胶囊提取溶剂用量的比较(n=3)
结论:由表25可知,20mL与25mL甲醇提取的1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量最高,二者含量没有明显差异,因此本实验选用20mL甲醇提取。
(4)提取时间的优选
精密称取复方果上叶胶囊内容物约0.2g,分别加入20mL甲醇,分别回流提取30min,60min,90min放冷,过滤,用甲醇定容于10mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。见表26。
表26复方果上叶胶囊提取时间的比较(n=3)
结论:由表26可知,提取时间60min的含量高于30min和90min的提取含量,所以本实验采用60min的提取时间。
综上所述,供试品溶液的制备方法为:精密称取复方果上叶胶囊内容物约0.2g,加入20mL甲醇,回流提取60min,放冷,过滤,用甲醇定容于10mL容量瓶中,0.2μm滤膜过滤,备用。
4.3色谱条件优选
(1)色谱柱优选
分别用DIKMA柱、PntulipsTMBP柱、Agilent柱进行分析,比较分离结果,三种色谱柱相比较,峰形有一定差异,且保留时间差异较大,PntulipsTMBP柱的峰形较好,PntulipsTMBP柱分离效果比Agilent柱与DIKMA柱好,故确定PntulipsTMBP柱作为分析柱。如图13、图14和图15所示。
(2)流动相优选
通过实验比较了甲醇-水;乙腈-水;甲醇-0.1%醋酸;甲醇-0.1%磷酸作为流动相,结果显示采用甲醇-水作为流动相,峰分离度高,峰形好。如图16、图17、图18和图19所示。
(3)色谱柱温优选
实验比较了25℃、30℃、35℃的柱温对1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的影响,实验结果表明柱温的改变也改变了1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的保留时间,而在30℃柱温条件下,1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰分离度最好,理论塔板数高。如图20、图21和图22所示。
(4)检测波长优选
取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品溶液,于210~400nm波长范围扫描,测定1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的紫外吸收光谱。对照品溶液在221nm左右波长处有最大吸收峰,峰形变平缓,便于定量测定,故选择221nm作为检测波长,如图23所示。
4.4***适应性试验
精密吸取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品溶液、复方果上叶胶囊供试品溶液、复方果上叶胶囊阴性对照溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,记录图谱,结果:复方果上叶胶囊阴性对照溶液在1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯处无吸收峰,表明在该条件下复方果上叶胶囊中其他成分对1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的测定无干扰。如图24、图25和图26所示。
4.5线性关系
精密称取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量,加甲醇溶解制成质量浓度为0.141mg/mL的对照品溶液,按拟定的色谱条件注入HPLC测定。1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯进样量分别为1μL、3μL、5μL、7μL、9μL。以峰面积对进样质量进行线性回归,得各被测成分的回归方程、相关系数及线性范围。结果表明:回归方程:y=1335.4x+20.245,r2=0.9998;1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯质量浓度在0.141~1.269μg呈良好线性关系。如图27所示。
4.6精密度试验
取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品溶液,连续进样6次,测定峰面积。计算6次峰面积的RSD为0.21%。说明本方法精密度良好。见表27。
表27 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯精密度结果
4.7稳定性试验
照复方果上叶胶囊供试品溶液制备方法制备制剂供试品溶液1份,以上述色谱条件,在0h、1h、2h、4h、8h、12h分别进样5μL,测定1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯成分峰面积。结果表明供试品溶液12h内稳定,其RSD为0.94%,符合质量标准技术要求(RSD在3%以内),稳定性良好。见表28。
表28 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯稳定性结果
4.8重复性试验
照供试品溶液制备方法分别制备制剂供试品溶液6份,以上述色谱条件,每次5μL,分别测定1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯成分峰面积,计算指标含量,RSD为2.15%,符合质量标准技术要求(RSD均在3%以内),重复性良好。结果见表29。
表29 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯重复性结果
4.9加样回收率试验
采用加样回收率法,取复方果上叶胶囊样品9份,每份约0.1g,精密称定,按上述样品溶液制备方法对样品进行处理,加入适量1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品溶液,制成低、中、高3种不同浓度供试品溶液。按上述色谱条件进行测定,结果如表30。
表30 1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯加样回收结果
4.10含量测定
分别取3个批次的复方果上叶胶囊,按供试品溶液制备方法及拟定的色谱条件,测定1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯成分的含量,测定结果见表31。
表31样品含量测定结果
上述3批样品测得1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯平均含量为8.0857mg/g。从大批量规模生产考虑,以本制剂每克1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的平均含量的80%计算其含量限度,即1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯8.0857×0.35×0.8=2.2mg/粒,因此规定本制剂每粒(0.35g)含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯,不得少于2.2mg。
本发明的有益之处在于:本发明的果上叶复方制剂,具有祛风除湿,散寒止痛,补阴敛汗,收敛止血,消肿生肌,清热解毒,利水消肿,养阴清肺,化痰止咳,行气止痛的功效;用于风湿关节痛,胃寒疼痛,盗汗,跌扑损伤,咯血,吐血,疮疡肿毒,潮热,小便不利,慢性气管炎,***等病症,能够治疗肺痨咳嗽、肺热咳嗽、疮疡肿毒等多种疾病,为结核病的治疗提供了中药新品种,为该病患者提供新的治疗药物;本制剂处方中的葎草、果上叶等药材为贵州省少数民族用药,药材资源丰富,也是贵州省民间长期所用的抗痨民族药;通过对本制剂的提取、制备工艺研究,优选出了较为合理的提取工艺条件及制备工艺条件;本制剂的检测方法专属性强,精密度高,重现性好,回收率高,测量结果准确,可有效控制药品质量,从而确保产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。
附图说明
图1是芦丁对照品UPLC图;
图2是醇提样品UPLC图;
图3是芦丁的标准曲线图;
图4是1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品UPLC图;
图5是水提样品UPLC图;
图6是1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的标准曲线图;
图7是复方果上叶胶囊中间体吸湿曲线图;
图8是复方果上叶胶囊制备工艺流程图;
图9是白及薄层色谱鉴别图;
图10是葎草薄层色谱鉴别图;
图11是倒提壶薄层色谱鉴别图;
图12是果上叶薄层色谱鉴别图;
图13是Agilent柱HPLC色谱图;
图14是DIKMA柱HPLC色谱图;
图15是PntulipsTMBP柱HPLC色谱图;
图16是甲醇-水为流动HPLC相色谱图;
图17是甲醇-0.1%醋酸为流动相HPLC色谱图;
图18是甲醇-0.1%磷酸为流动相HPLC色谱图;
图19是乙腈-水为流动相HPLC色谱图;
图20是25℃柱温HPLC色谱图;
图21是30℃柱温HPLC色谱图;
图22是35℃柱温HPLC色谱图;
图23是1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品的紫外吸收光谱图;
图24是1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品HPLC色谱图;
图25是复方果上叶胶囊供试品溶液HPLC色谱图;
图26是复方果上叶胶囊阴性对照溶液HPLC色谱图;
图27是1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯HPLC标准曲线图。
图中附图标记的含义:图9中:1为白及对照药材,2、3、4分别为复方果上叶胶囊供试品(20131208、20131228、20140228),5为缺白及阴性对照;图10中:1为木犀草苷对照品,2、3、4分别为复方果上叶胶囊供试品(20131208、20131228、20140228),5为缺葎草阴性对照;图11中:1为β-谷甾醇对照品,2、3、4分别为复方果上叶胶囊供试品(20131208、20131228、20140228),5为缺倒提壶阴性对照;图12中:1为果上叶对照药材,2为缺果上叶阴性对照,3、4、5分别为复方果上叶胶囊三批供试品(20131208、20131228、20140228)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶220g、白及60g、葎草300g和果上叶190g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶加10倍量75%乙醇,回流提取1次,提取时间1h,提取液过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加7倍量、6倍量的水,煎煮提取2次,每次提取时间1.5h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,以85%的乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃逐渐升温中干燥,颗粒装入胶囊,即得胶囊剂。本制剂口服,一次4粒,一日3次。
实施例2
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶320g、白及160g、葎草200g和果上叶120g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶分别加10倍量、8倍量85%乙醇,回流提取2次,每次提取时间2h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加9倍量、8倍量、8倍量的水,煎煮提取3次,每次提取时间2h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,用85%乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃逐渐升温中干燥,颗粒装入胶囊,即得胶囊剂。本制剂口服,一次4粒,一日3次。
实施例3
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶420g、白及260g、葎草100g和果上 叶50g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶分别加8倍量、6倍量、6倍量65%乙醇,提取3次,每次提取时间1.5h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及加10倍量的水,提取1次,提取时间1h,提取液过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,减压浓缩,浓缩液真空干燥,得浸膏提取物,粉碎过筛,得到药粉,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,以85%的乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃中干燥,颗粒装入胶囊,即得胶囊剂。本制剂口服,一次4粒,一日3次。
实施例4
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶300g、白及200g、葎草240g和果上叶180g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶分别加9倍量、7倍量70%乙醇,回流提取2次,每次提取时间1h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加8倍量、7倍量、7倍量的水,煎煮提取3次,每次提取时间2h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,以85%的乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃中干燥,颗粒装入胶囊,即得胶囊剂。本制剂口服,一次4粒,一日3次。
实施例5
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶370g、白及170g、葎草150g和果上叶80g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶分别加9倍量、7倍量、7倍量75%乙醇,回流提取3次,每次提取时间1h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加8倍量、7倍量的水,煎煮提取2次,每次提取时间1.5h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,压制成片,即得片剂。
实施例6
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶280g、白及240g、葎草250g和果上叶130g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶分别加8倍量、6倍量65%乙醇,回流提取2次,每次提取时间2h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加10倍量、9倍量、9倍量的水,煎煮提取3次,每次提取时间1h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,以85%的乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃中干燥,即得颗粒剂。
实施例7
一种果上叶复方制剂,由以下原料药制成:倒提壶360g、白及130g、葎草280g和果上叶190g。按量称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶加9倍量80%乙醇,回流提取1次,提取时间2h,提取液过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及加9倍量的水,煎煮提取1次,提取时间1.5h,提取液过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,将药粉加水搅匀成糊状,再加入聚乙二醇4000作基质,加热熔融成液体,倒入滴丸机中滴制成丸,即得滴丸剂。
用本发明实施例1~7中所得药物对102例肺结核病人进行治疗取得显著治疗效果,之后还对治疗过的病人进行观察及随访,统计治愈和有显效的患者,治愈率约为94%以上,以下是部分典型病例资料:
l、患者类型:综合病例102例,包括原发型肺结核12例,浸润型55例,慢性纤维空洞型25例,10例为其他类型,其中浸润型最多。
2、诊断依据:根据病史,临床症状,体征,化验及X线检查确诊。疑难患者尚需借助B超、CT作进一步检查。
3、既往治疗史:本组102例,诊治病人基本都在大医院确诊及治疗过,曾经正规化疗者35例,不规则化疗者66例。
4、治疗方法:以胶囊剂和丸剂为主,对一些病人疗程一般为6~9月,少数患者可延长至12个月。
5、疗效判定标准∶按照1981年***制定的《疾病治疗效果评定标准》而定:
A痊愈:临床症状消失,痰结核菌持续阴性达1年以上,肺部X线表现属非活动性病灶,随访观察1年以上,仍无活动性。
B好转:具备下述一项者:病变较前吸收好转,空洞缩小闭合,痰结核菌减少或转阴。
C无效:痰菌及X线检查,治疗前后均无改变者。
6、治疗结果:综合病例102例,治愈96例,占94.1%,好转6例,占5.9%,疗程最短3个月,最长12个月,随访观察1~2年。现就一些治愈病例陈述如下:
病例1:邓某,男,40岁,患“空洞型肺结核”,2004年前曾在六枝特区某医院正规治疗半年左右,始终未能治愈,后又间断服药,病情逐渐加重,肝功能受损。故转请求中药治疗,于是给他服用本发明胶囊剂,2月后还患咳嗽、气促、痰中带血、胸痛、盗汗症状显著,低热消除,饮食较前好转,效不更方,患者继续服该药,经过3个月所有症状均消失。多次拍片证明肺结核均痊愈,肝功能已恢复正常,随访两年胸片、痰培养未见异常。
病例2:苏某,男,25岁,农民,患“纤维空洞型肺结核”,2004年前曾在医院正规治疗过几个用,后又自服民间草药,病情始终未能治愈,经常咳嗽、咯血、胸痛、盗汗,精神和食欲很差,全身无力,经人介绍,服用本发明胶囊剂3个月后,患者除时有咳嗽,上述症状基本消失、经过拍片检查空洞修复,已出现钙化,药已见效,6个月后,患者咳嗽消失,颜色红润、赭神和饮食很佳,随访1年,患者胸片、痰培养一直正常。
病例3,朱某,男,32岁,已婚,患“空洞型肺结核”,2005年前曾在六枝特区某医院诊疗,一年左右未能治愈,其间断服药,病情逐渐加重,故转求中药治疗,给他服用本发明胶囊剂,半月后患者咳嗽、气促、痰中带血、胸痛、盗汗症状显减,低热消除,经过半年所有症状均消失,多次拍片肺结核均痊愈,肝功能已恢复正常,随访举年未见异常。
病例4,叶某,男,50岁,农民,患“浸润型肺结核”,2002年曾在普定县某医院治疗一年左右,未能治愈,后又间断服药,病情逐渐加重,经人介绍,给他诊疗后,服用本发明胶囊剂,1个月后患者咳嗽、气促、痰中带血、胸痛、盗汗症状显减,低热消除,饮食较前好转,经过调整药量,患者继续服该药,经过几个月所有症状均消失。多次拍片肺结核均痊愈,经过1年随访未见胸片、痰培养异常。
实施例8
果上叶复方胶囊剂的检测方法:
性状:本制剂为胶囊剂,内容物为棕褐色粉末,气微,味微苦;
鉴别,包括以下项目中的至少一项:
(1)取本制剂内容物2g,加70%甲醇20mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL溶解,用***振摇提取两次,每次20mL,合并***液,浓缩至1mL作为供试品溶液;另取白及对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取上述供试品溶液2μL,对照药材溶液5μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2.5∶1为展开剂,展开,取出,晾干,105℃加热数分钟,放置30min-60min,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(2)取本制剂内容物1g,加20mL水回流提取1h,过滤,滤液加盐酸调酸性,用乙酸乙酯萃取三次,每次20mL,滤液挥干,加甲醇2mL稀释作供试品溶液;另取木犀草苷对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水=7∶3∶1∶1.2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇溶液,供试品色谱图中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(3)取本制剂内容物2g,加三氯甲烷20mL,超声处理15min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为供试品溶液;另取β-谷甾醇对照品适量,加三氯甲烷制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1.5μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(4)取本制剂内容物0.5g,加三氯甲烷20mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液;取果上叶对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液4μL,对照药材溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上显相同颜色的斑点;
检查:应符合《中国药典》2010年版一部附录I C胶囊剂项下有关的各项规定;
含量测定:照中国药典2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定:
色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水=47∶53为流动相;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为221nm,理论板数按1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰计算应不低于5000;
对照品溶液的制备取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯100μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备取本制剂内容物0.2g,精密称定,加20mL甲醇回流提取1小时,放冷过滤,挥干,加甲醇定容至10mL,过滤,即得;
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,测定,即得;
本制剂每粒含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯不得少于2.2mg。
Claims (10)
1.一种果上叶复方制剂,其特征在于:按重量份数计,由以下原料药制成:倒提壶220~420份、白及60~260份、葎草100~300份和果上叶50~190份。
2.根据权利要求1所述的果上叶复方制剂,其特征在于:按重量份数计,由以下原料药制成:倒提壶320份、白及160份、葎草200份和果上叶120份。
3.根据权利要求1或2所述的果上叶复方制剂,其特征在于:所述制剂是以可溶性淀粉为辅料制成的胶囊剂。
4.如权利要求1或2所述的果上叶复方制剂的制备方法,其特征在于:按重量比例称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶加6~10倍量65%~85%乙醇,提取1~3次,每次提取1~2h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及加6~10倍量的水,提取1~3次,每次提取1~2h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,减压浓缩,浓缩液真空干燥,得浸膏提取物,粉碎过筛,得到药粉,再加入辅料制成各种药物制剂。
5.根据权利要求4所述的果上叶复方制剂的制备方法,其特征在于:按重量比例称取倒提壶、白及、葎草和果上叶,倒提壶、葎草和果上叶分别加10倍量、8倍量85%乙醇,回流提取2次,每次提取2h,合并提取液,过滤,得醇提液,备用;醇提药渣和白及分别加9倍量、8倍量、8倍量的水,煎煮提取3次,每次提取2h,合并提取液,过滤,得水提液;将醇提液和水提液混合,75℃减压浓缩至密度为1.25的浓缩液,浓缩液70℃真空干燥72h,得浸膏提取物,粉碎过4号筛,得到药粉,再加入辅料制成各种药物制剂。
6.根据权利要求4或5所述的果上叶复方制剂的制备方法,其特征在于:按药粉与辅料4∶3的重量比例加入辅料可溶性淀粉,混匀,以85%的乙醇作润湿剂制粒,颗粒在60℃~80℃逐渐升温中干燥,颗粒装入胶囊,即得胶囊剂。
7.权利要求3所述果上叶复方制剂的检测方法,其特征在于:所述检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目;鉴别是对白及、葎草、倒提壶、果上叶的薄层色谱鉴别;含量测定是用高效液相色谱法测定制剂中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量;白及的鉴别方法是以白及对照药材为对照,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2.5∶1为展开剂的薄层色谱法,葎草的鉴别方法是以木犀草苷对照品为对照,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水=7∶3∶1∶1.2为展开剂的薄层色谱法,倒提壶的鉴别方法是以β-谷甾醇对照品为对照,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂的薄层色谱法,果上叶的鉴别方法是以果上叶对照药材为对照,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂的薄层色谱法;制剂中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量测定方法是以1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品为对照,以甲醇-水=47∶53为流动相的高效液相色谱法。
8.根据权利要求7所述的果上叶复方制剂的检测方法,其特征在于:具体的鉴别方法包括以下项目中的一项或几项:
(1)取本制剂内容物2g,加70%甲醇20mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL溶解,用***振摇提取两次,每次20mL,合并***液,浓缩至1mL作为供试品溶液;另取白及对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液2μL,对照药材溶液5μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2.5∶1为展开剂,展开,取出,晾干,105℃加热数分钟,放置30min~60min,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(2)取本制剂内容物1g,加20mL水回流提取1h,过滤,滤液加盐酸调酸性,用乙酸乙酯萃取三次,每次20mL,滤液挥干,加甲醇2mL稀释作供试品溶液;另取木犀草苷对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯一丙酮一甲酸一水=7∶3∶1∶1.2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇溶液,供试品色谱图中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(3)取本制剂内容物2g,加三氯甲烷20mL,超声处理15min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为供试品溶液;另取β-谷甾醇对照品适量,加三氯甲烷制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1.5μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(4)取本制剂内容物0.5g,加三氯甲烷20mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液;取果上叶对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液4μL,对照药材溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上显相同颜色的斑点。
9.根据权利要求7所述的果上叶复方制剂的检测方法,其特征在于:具体的含量测定方法为:
照中国药典2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定:
色谱条件与***适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水=47∶53为流动相;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为221nm;理论板数按1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰计算应不低于5000;
对照品溶液的制备 取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯100μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取本制剂内容物0.2g,精密称定,加20mL甲醇回流提取1小时,放冷过滤,挥干,加甲醇定容至10mL,过滤,即得;
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,测定,即得。
10.根据权利要求7、8或9所述的果上叶复方制剂的检测方法,其特征在于:所述检测方法包括:
性状:本制剂为胶囊剂,内容物为棕褐色粉末,气微,味微苦;
鉴别:(1)取本制剂内容物2g,加70%甲醇20mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水10mL溶解,用***振摇提取两次,每次20mL,合并***液,浓缩至1mL作为供试品溶液;另取白及对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液2μL,对照药材溶液5μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲醇=6∶2∶5∶1为展开剂,展开,取出,晾干,105℃加热数分钟,放置30min-60min,置紫外光灯365nm下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(2)取本制剂内容物1g,加20mL水回流提取1h,过滤,滤液加盐酸调酸性,用乙酸乙酯萃取三次,每次20mL,滤液挥干,加甲醇2mL稀释作供试品溶液;另取木犀草苷对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水=7∶3∶1∶1∶1.2为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%三氯化铝乙醇溶液,供试品色谱图中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(3)取本制剂内容物2g,加三氯甲烷20mL,超声处理15min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为供试品溶液;另取β-谷甾醇对照品适量,加三氯甲烷制成每1mL含2mg的对照品溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液1.5μL,对照品溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-***-乙酸乙酯=40∶11∶15为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相对应的位置上,显相同颜色的斑点;
(4)取本制剂内容物0.5g,加三氯甲烷20mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解作为供试品溶液;取果上叶对照药材2g,按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液;照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验,吸取供试品溶液4μL,对照药材溶液2μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-甲酸=40∶1∶1为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,110℃加热至斑点清晰,供试品色谱中,在与对照药材色谱相对应的位置上显相同颜色的斑点;
检查:应符合《中国药典》2010年版一部附录I C胶囊剂项下有关的各项规定;
含量测定:照中国药典2010年版一部附录Ⅵ D高效液相色谱法测定:
色谱条件与***适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水=47∶53为流动相;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为221nm,理论板数按1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰计算应不低于5000;
对照品溶液的制备 取1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯100μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备 取本制剂内容物0.2g,精密称定,加20mL甲醇回流提取1小时,放冷过滤,挥干,加甲醇定容至10mL,过滤,即得;
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL,注入高效液相色谱仪,测定,即得。
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