CN114451425B - 连翘提取物在防治猕猴桃溃疡病上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了连翘提取物在防治由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种导致的猕猴桃溃疡病上的用途，所述连翘提取物为连翘的乙醇提取物或连翘的乙醇提取物的正丁醇再提萃取物。本发明提供的连翘提取物对猕猴桃溃疡病原菌有抑制活性作用，且由于连翘原料来源广泛，对人体无毒，对作物无害，作为植物源抑杀致病菌剂有易降解的特点，因此有望开发为一种无公害的植物源抑杀致病菌制剂。

Description

连翘提取物在防治猕猴桃溃疡病上的用途

技术领域

本发明属于植物农药领域，具体涉及一种连翘提取物在防治猕猴桃溃疡病上的用途。

背景技术

植物病害是影响农业生产的一个重要因素，不同的病原菌能够导致多种作物产生疾病，这对农业经济造成了很大的损失。猕猴桃溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性细菌性病害，被列为全国森林植物检疫对象。此病来势凶猛，流行年份致使全园濒于毁灭，造成重大经济损失，该病的发生危害，不仅减低产量，而且导致果皮变厚，果味变酸，果实变小，果形不一，品质下降，商品价值降低。在早期农药便开始商业化，但那时的农药都是化学农药，农药的快速发展对农产品的产量和质量带来了丰厚的效益。但是随着化学农药的不断的推广使用，它所造成的危害也是不容忽视的。大量使用化学农药会对环境造成严重的污染，会对非靶标的生物造成伤害，农药的残留物也会对人类的健康产生危害。随着人们的生活品质的提高，对食品安全也更加重视。因此为了能够使农业得到可持续健康发展，开发出对环境和人类健康没有危害的新农药成为了农药研究的重点任务，生物农药成为了现代农业发展的研究热点，而在生物农药中植物源农药是一个重要的领域。因为植物源农药具有以下特点：地球植物资源丰富，而且种类繁多；与化学农药不同的是，植物源的生物农药的针对性比较强，不会对非靶标的生物造成伤害；植物源提取物成分多样化，各活性成分间还会有协同作用，不同活性成分对病害的作用靶位不同，所以相对于化学农药而言，采用植物源生物农药时，病原菌不容易对农药产生抗药性；又因植物源农药自身是来源于自然的天然产物，所以能够自然的消解于自然，不会产生对环境具有破坏性的物质，因此开发出高效的生物农药对于保护生态环境，人畜健康都有重要的意义。

自2008年来，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)就一直在威胁全球的猕猴桃产业，摧毁着欧洲、南美洲以及新西兰的果园。由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)引起的“猕猴桃溃疡病”在意大利首次被报道发现，随后的四年里，它已经导致了上千万美金的经济损失。该病害爆发快,对全球的猕猴桃产区都造成了严重的损失。目前，生产上主要应用化学药剂对猕猴桃溃疡病进行防治，研究发现Psa已对部分农药产生抗性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种防治由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种导致的猕猴桃溃疡病的植物源抗菌新药物来源。

本发明的技术方案为：连翘提取物在防治由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种导致的猕猴桃溃疡病上的用途，所述连翘提取物为以下的任一种：

a、连翘的乙醇提取物，

b、连翘的乙醇提取物的正丁醇再提物。

本发明中的连翘原料为连翘的果实或者全株均可。

进一步地，所述乙醇提取物采用的萃取溶剂为体积分数不低于75％的乙醇。进一步地为90-98％的乙醇，优选为95％的乙醇。

进一步地，所述连翘的乙醇提取物的正丁醇再提物通过以下方法制得：

(1)将干燥粉碎的连翘用95％乙醇浸提12-24小时，然后在45-50℃超声提取4-6h，使连翘中的活性成分充分浸出，收集浸提液；

(2)将收集到的浸提液浓缩，得到连翘的乙醇提取物，并回收作为溶剂的乙醇；

(3)将浓缩得到的浸膏状连翘的乙醇提取物再用正丁醇萃取分离得到连翘的乙醇提取物的正丁醇萃取物，将正丁醇萃取物浓缩，得到乙醇提取物的正丁醇再提物。

进一步地，所述正丁醇萃取物浓缩采用35℃真空浓缩。

本发明揭示的抑杀猕猴桃溃疡病的连翘提取物可用于制备抑杀猕猴桃溃疡病原菌的制剂。其中连翘的乙醇提取物或连翘的乙醇提取物的正丁醇再提物浸膏可用于N,N-二甲基甲酰胺溶解后直接用于制备抑杀猕猴桃溃疡病原菌的制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明揭示的抑杀猕猴桃溃疡病原菌的连翘活性成分，可制备成水剂、可溶性粉剂、可湿性粉剂、浓悬剂和粒剂等剂型的猕猴桃溃疡病原菌抑杀制剂。各种剂型的制备方法为本领域的常规方法，各剂型制备过程中所用助剂为农药领域中的常用助剂。各剂型在使用时所配置的溶液，其中连翘提取物的浓度应在0.1mg/mL-1000mg/mL的范围内。

2、本发明提供的连翘提取物对猕猴桃溃疡病原菌有抑制活性作用，且由于连翘原料来源广泛，对人体无毒，对作物无害，作为植物源抑杀致病菌剂有易降解的特点，因此有望开发为一种无公害的植物源抑杀致病菌制剂。

附图说明

图1.连翘不同萃取物的抗PSA活性；1为正丁醇萃取物，2为乙醇提取物，3为乙酸乙酯萃取物，4为石油醚萃取物

图2连翘醇提物与其它植物提取物的抗PSA活性比较；

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1连翘乙醇总提取物及石油醚萃取再提物，乙酸乙酯萃取再提物，正丁醇萃取再提物的制备

1、将干燥连翘碎后过40目筛，得到连翘粉末。

2、取相当于原料质量约7倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇(不低于75％，一般为90-98％)在室温(温度一般在18-24℃范围)下浸提约20h(一般控制范围为12-24h)。

3、在约50℃下超声波6h(一般控制范围为4-8h)。用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。

4、将残渣再用相当于原料质量约6倍(一般控制范围为5-10倍)体积的95％的乙醇进一步超声提取6h(一般控制范围为4-8h)，使连翘中的活性成分充分提出，用布氏漏斗负压过滤，去掉残渣，得滤液。

5、合并滤液，滤液用旋转蒸发仪在约50℃(一般控制范围为45-55℃)水浴下浓缩，得到乙醇提取物，4℃保存。

6、取连翘提提物浸膏20g，加入10倍体积正丁醇萃取，滤纸过滤得滤液，向剩余固体中再次加入适当体积的正丁醇重复萃取，滤纸过滤得滤液。直到萃取液到无色为止，然后将所得到的滤液用旋转蒸发仪在35℃下进行真空浓缩得到连翘醇提物的正丁醇再提物。

7、取20g连翘醇提物浸膏，加入10倍体积的乙酸乙酯进行萃取，滤纸过滤得滤液，向剩余固体中再次加入适当体积的乙酸乙酯重复萃取，滤纸过滤得滤液。直到萃取液到无色为止，然后将所有得到的滤液用旋转蒸发仪在35℃下真空浓缩获得连翘醇提物的乙酸乙酯再提物。

8、取20g连翘醇提物浸膏，加入10倍体积的石油醚进行萃取，滤纸过滤得滤液，向剩余固体中再次加入适当体积的石油醚重复萃取，滤纸过滤得滤液。直到萃取液到无色为止，然后将所有得到的滤液用旋转蒸发仪在35℃下真空浓缩获得连翘醇提物的石油醚再提物。

实施例2生物活性的测定

在离体条件下，以滤纸片法比较各提物对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的抑菌活性。首先，选择普通化学定性滤纸，用打孔器将其制备成直径6mm的圆形滤纸片，放入离心管中，高压蒸汽灭菌后，干燥备用。将Psa菌株转移至LB固体平板上进行活化，活化2-3次后，用无菌接种环将单菌落接种至LB液体培养基中，25℃、120rpm/min振荡培养24h，吸取菌液并用LB液体培养基稀释至浓度为1×10⁷CFU/mL。在无菌条件下，吸取100μL稀释菌悬液均匀涂布至LB固体平板上，静置2-3分钟，用无菌镊子夹取已灭菌处理的滤纸片贴于LB平板表面，每个平板均匀放置3片，呈正三角形排列。取少量实施例1制备的连翘四种浸膏，用N,N-二甲基甲酰胺配制成浓度为100mg/mL溶液作为实验备用样品。

分别吸取各药液5μL(含药量为0.5mg)滴加至滤纸片上，并做好标记，以滴加5μL二甲基亚砜的处理为空白对照，滴加5μL 50mg/mL硫酸链霉素的处理为阳性对照，每个处理重复三次。将加药后的平板于室温下静置1h，之后放于25℃恒温培养箱中培养24h。取出后观察滤纸片周围有无明显的抑菌圈，测量抑菌圈直径。结果以平均值和标准差(mean±SD)表示。判断标准见表1

表1判断标准

表2.连翘萃取物对Psa的抑菌活性

注：抑菌圈直径采用“均值±标准差”表示；小写字母表示显著性p<0.05。

结果如图1和表2所示，由表可知，连翘正丁醇再提物对Psa的抑杀效果最好，在100mg/mL浓度下，抑菌圈直径为16.53±0.12mm，其MIC为0.125mg/mL，抑菌活性超过连翘乙醇提取物(MIC为0.5mg/mL)。其次，抑制作用较强的为连翘乙酸乙酯再提物，抑菌圈直径为14.47±0.21mm，稍低于乙醇提取物的效果，且与正丁醇再提物具有显著性差异(p＜0.05)。而连翘石油醚再提物的抑菌作用较差，抑菌圈直径为12.67±0.17mm，其抑菌活性与正丁醇再提物存在显著差异(p＜0.05)。由此可见，连翘正丁醇再提物对Psa的抑菌效果最佳。这表明连翘中抑菌活性物质的极性较大，且主要集中于正丁醇再提物中。

实施例3最小抑菌浓度MIC测定

参考Yang等[International Journal of Antimicrobial Agents,2006,27(4):325-330]的方法做部分修改，测定乙醇提取物和正丁醇再提物的最小抑菌浓度MIC。连翘提取物与再提物的浓度设置为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0mg/mL，另设对应体积的加药培养基(不加Psa)作为空白对照，DMSO作为阴性对照。28℃培养24h，使用酶标仪测定OD600nm。实验组与对照组吸光度无明显差异的浓度定义为最低抑菌浓度。吸取100μL上述培养液涂布，28℃培养48h，观察菌落形成情况。将不长菌落的平板所对应的浓度定义为最小抑菌浓度(Lovato et al.,Frontiers in microbiology,2019(10):2362)。结果显示，乙醇提取物的MIC为0.5mg/mL，正丁醇再提物的MIC为0.125mg/mL。

实施例4

通过连翘、甘草、黄岑夏枯草等4种药用植物的乙醇粗提物对Psa抑菌活性，采用二倍稀释法进一步测定这4种植物乙醇提取物对Psa的最小抑菌浓度。发现连翘乙醇提取物对于Psa的最小抑菌浓度为0.5mg/mL，甘草和黄岑的最小抑菌浓度为6.25mg/mL，2.4mg/mL，而夏枯草的最小抑菌浓度为12.5mg/mL。夏枯草对Psa的最小抑菌浓度是甘草和黄岑的2倍，是连翘的4倍，说明连翘对Psa的抑制作用强于甘草、黄岑和夏枯草。

实施例5田间试验

田间实验效果表明，涂抹过连翘杀菌制剂的猕猴桃树长势较好，原来未发芽的枝条开始长出新叶，病斑开始减少，未见感染菌液；使用输液处理过的猕猴桃长势优于刮除病斑涂药处理的猕猴桃树。而效果最差的则是未刮除病斑涂药处理的猕猴桃树。在田间实验的过程中，由于输液处理更容易被植物所吸收，可以很快直达病变组织，在治疗过程中药液的流失量较少，故治疗效果最明显。对于刮除病斑涂药处理的猕猴桃树，由于所涂抹的药物可以直接作用于植物表皮下的菌斑感染处，也较容易被植物所吸收，故效果也较好。而对于未刮除病斑直接涂药处理的猕猴桃树，由于植物表皮的阻隔，药物吸收较慢，且在雨天很容易被雨水冲刷造成药物流失，所以效果明显较差。

通过田间试验，初步确认了在猕猴桃树冬季休眠期基施生物有机肥、树体输液含连翘提取物的复合杀菌剂的防治效果较好。

Claims (6)

1.连翘提取物在防治由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种导致的猕猴桃溃疡病上的用途，所述连翘提取物为连翘的乙醇提取物或连翘的乙醇提取物的正丁醇再提物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乙醇提取物采用的提取溶剂为体积分数不低于75%的乙醇。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述乙醇提取物采用的萃取溶剂为体积分数90-98%的乙醇。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述乙醇提取物采用的萃取溶剂为体积分数为95%的乙醇。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述连翘的乙醇提取物的正丁醇再提物通过以下方法制得：

（1）将干燥粉碎的连翘用95%乙醇浸提12-24小时，然后在45-50℃超声提取4-6h，使连翘中的活性成分充分浸出，收集浸提液；

（2）将收集到的浸提液浓缩，得到连翘的乙醇提取物，并回收作为溶剂的乙醇；

（3）将浓缩得到的浸膏状连翘的乙醇提取物再用正丁醇萃取分离得到连翘的乙醇提取物的正丁醇萃取物，将正丁醇萃取物浓缩，得到乙醇提取物的正丁醇再提物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述正丁醇萃取物浓缩采用35℃真空浓缩。

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