CN108739864A - 植物内生菌杀虫剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
植物内生菌杀虫剂制备方法，包括步骤：从卫矛科植株上提取植物内生菌；纯化培养提取的植物内生菌以备测试；将培养的植物内生菌的代谢产物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出高致死率植物内生菌菌株；将选出的菌株进行发酵培养；过滤并浓缩发酵培养的发酵液得植物内生菌杀虫剂。本发明的植物内生菌杀虫剂制备方法所制备的杀虫剂，所筛选的植物内生菌本身即从具有驱虫效果的植物中提取，对害虫防治效果好，对人、畜、植物安全无毒，不污染环境，无残留；植物内生菌对病虫杀伤特异性强，同时不伤害天敌和有益生物，能保持生态自然平衡；生产原料和有效成分属于天然产物，可回归自然而减少对于自然的破坏，保证可持续发展。
Description
技术领域
本发明涉及微生物农药的制备，尤其涉及植物内生菌杀虫剂及其制备方法。
背景技术
目前我国杀虫剂产品结构不合理，在杀虫剂总产量中有机磷杀虫剂占70％，而高毒品种占有机磷杀虫剂的70％。我国杀虫剂中高毒品种多、产量大，已成为农药生产、使用的突出矛盾。化学农药残留在水、土、动物以及人类的身体内，扼杀自然界的活力，破坏生态环境，随着化学制剂的增多，对人类的危害愈益严重。生物体农药指用来防除病、虫、草等有害生物的活体生物，生物化学农药是指的从生物体中分离出的，具有一定化学结构的，对有害生物有控制作用的生物活性物质，该物质可能是生物体的代谢产物。
生物农药中的微生物农药是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂，是生物防治的物质基础和重要手段。植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。植物内生菌本身即从某种具有驱虫效果的植物中提取，对害虫防治效果好，从根源处解决虫害，在植物中不会影响植物生长，对人、畜、植物安全无毒，不污染环境，无残留。植物内生菌对病虫杀伤特异性强，同时不伤害天敌和有益生物，能保持生态自然平衡。生产原料和有效成分属于天然产物，可回归自然而减少对于自然的破坏，保证可持续发展。目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。内生菌在植物体内普遍存在，数量非常巨大，至今已研究几百种，其潜在数量更是难以估算。植物内生菌作为微生物中非常重要的群类，可产生丰富多样的具有生物活性的天然产物，而将其产物用于病虫草害的控制是目前微生物农药的重要途径，杀菌剂井冈霉素和多氧霉素，杀虫剂阿维菌素和多杀菌素等目前已广泛投入使用。但目前植物内生菌的利用主要在农业除菌去病方面，而在杀虫尤其是夏季杀蚊杀虫方面则少有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物内生菌杀虫剂及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
植物内生菌杀虫剂制备方法，包括步骤：
S1：从卫矛科植株上提取植物内生菌；
S2：纯化培养提取的植物内生菌以备测试；
S3：将培养的植物内生菌的代谢产物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出高致死率植物内生菌菌株；
S4：将选出的菌株进行发酵培养；
S5：过滤并浓缩发酵培养的发酵液得植物内生菌杀虫剂。
进一步的，所述步骤S1具体包括：
S11：植物材料的表面消毒：采集植物时保留根部土壤，用塑料布包裹根部，保持其鲜活状态；
S12：取所采集植株的根、茎、叶的健康组织用流水冲洗干净，用70％的酒精浸泡3min，再用2％次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水冲洗3次用以去除附着在材料表面的消毒剂；
S13：将最后一遍浸洗的无菌水取100gl涂布在LB培养基平板上，28℃培养72h小时后无微生物长出，表明表面消毒彻底；
S14：内生菌的分离：面消毒后的植株根、茎、叶分别用无菌剪刀纵切，然后放入灭菌研钵中研磨充分；
S15：将研磨后的植物组织液加入缓冲液在28℃、l50rpm条件下振荡1h，取不同稀释梯度的溶液分别涂布在LB培养基平板上，28℃恒温培养2-14天，待菌落生长完全后挑选接入LB琼脂斜面置于4℃条件下保存；
S16：菌落形态观察：有氮培养基上划线得到单菌落，观察单菌落形态与菌体形态并记录。
进一步的，所述缓冲液为10mlPBS缓冲液。
进一步的，所述步骤S3具体包括：将培养的植物内生菌的代谢产物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出高致死率植物内生菌菌株作为待测菌株；将待测菌株进行多代培养，将多代培养后的植物内生菌代谢物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出遗传稳定性良好的菌株；将选出的遗传稳定性良好的菌株继续培养，并将其代谢产物稀释后喷洒小鼠，将对小鼠无毒的菌株作为目标菌株。
进一步的，所述步骤S5具体包括：过滤并浓缩发酵培养的发酵液，将浓缩后的发酵液配制成粉剂、可湿性粉剂、胶悬剂、喷射剂或气雾剂。
由上述制备方法所制得的植物内生菌杀虫剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的植物内生菌杀虫剂制备方法，所筛选的植物内生菌本身即从某种具有驱虫效果的植物中提取，对害虫防治效果好，从根源处解决虫害，在植物中不会影响植物生长，对人、畜、植物安全无毒，不污染环境，无残留；植物内生菌对病虫杀伤特异性强，同时不伤害天敌和有益生物，能保持生态自然平衡；生产原料和有效成分属于天然产物，可回归自然而减少对于自然的破坏，保证可持续发展；由于多种因素和成分发挥作用，微生物本身拥有的基因变异，害虫难以产生抗药性。
具体实施方式：
实施例1物内生菌的提取
植物材料的表面消毒:采集植物时保留根部土壤，用塑料布包裹根部，保持其鲜活状态。取所采集植株的根、茎、叶的健康组织用流水冲洗干净，用70％的酒精浸泡3min，再用2％次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水冲洗3次用以去除附着在材料表面的消毒剂。将最后一遍浸洗的无菌水取100gl涂布在LB培养基平板上，28℃培养72h小时后无微生物长出，表明表面消毒彻底。
实施例2内生菌的分离
面消毒后的植株根、茎、叶分别用无菌剪刀纵切，然后放入灭菌研钵中研磨充分。为了保证内生细菌充分分离，植物组织研磨后倒入装有10mlPBS缓冲液的锥形瓶中，在28℃、l50rpm条件下振荡1h，取100g不同稀释梯度依次为103、104、105和106的汁液涂布在LB培养基平板上，28℃恒温培养2-14天。待菌落生长完全后挑选接入LB琼脂斜面置于4℃条件下保存。有氮培养基上划线得到单菌落，观察单菌落边缘形状、大小、***情况、表面形态、菌落颜色、透明度和色素产生情况等。菌株培养15h后，进行革兰氏染色，过程为：①取菌种培养物常规涂片、干燥、固定；②滴加结晶紫染色1-2rain，水洗：③用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约lmin，水洗；④用滤纸吸去残水，用滴管加95％乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗：⑤用番红复染约2min，水洗；⑥干燥后，用油镜观察革兰氏染色的阴阳性和菌体的形态，用镜台微尺测菌体的长和宽。
从卫矛科植物中共分离到155株内生真菌。从苦皮藤植物中分离得到的内生真菌数量最多，为95株，而从其它3种植物中分离到的内生真菌较少，分别为25株、18株和12株。另外，植物内生真菌在植物不同部位中数量也存在差异。苦皮藤、冬青卫矛和扶芳藤3种卫矛科植物的内生菌在根中分布较多，其次是茎，最后是果实及其它部位。
实施例3测试与筛选
测定从4种卫矛科植物中分离得到155的株内生菌发酵滤液的杀虫活性,以和蚊子同为双翅目的果蝇为试虫对155株内生菌的杀虫活性进行初步筛选，结果表明，通过其中的8种内生菌代谢产物稀释液，果蝇24h后死亡率在90％以上，结果如表1所示。通过5株内生菌代谢产物稀释液，果蝇24h死亡率在70％以上。将内生菌的代谢产物稀释后喷洒小鼠，小鼠未产生明显影响。用4种不同的显色剂对初筛得到的内生菌发酵液及菌丝体提取液进行显色反应，以明确内生菌是否产生生物碱类化合物。结果表明，有杀虫活性的内生菌的胞内代谢物粗提物成阳性反应，初步断定其中含有生物碱类化合物。
表1内生菌发酵滤液杀虫活性测定结果
| 供试样品 | 死亡率(％) | 供试样品 | 死亡率(％) |
| 1 | 30 | 8 | 10 |
| 2 | 60 | 9 | 47 |
| 3 | 20 | 10 | 65 |
| 4 | 55 | 11 | 5 |
| 5 | 10 | 12 | 16 |
| 6 | 30 | 13 | 13 |
| 7 | 69 | 14 | 24 |
对致死率最高的4株内生菌进行遗传稳定性测定，结果表明：产杀虫活性物质的4株内生真菌在传代到第5代时，其中两个菌种的发酵产物均对淡色库蚊幼虫不表现杀虫活性,表明这两株菌可能在离体培养中失去了产生活性产物的能力，而其他内生菌遗传稳定性测定结果表明,菌株在传代5代后其产生抑菌活性物质的能力没有明显降低，表明此种方法可筛选出低毒高效且遗传稳定性好的植物内生菌。
实施例4植物内生菌杀虫剂的制备
将筛选出的目标菌株进行发酵培养，过滤并浓缩发酵培养的发酵液，将浓缩后的发酵液配制成粉剂、可湿性粉剂、胶悬剂、喷射剂或气雾剂，实际使用时可根据情况选择合适的剂型。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域正常技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.植物内生菌杀虫剂制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1：从卫矛科植株上提取植物内生菌；
S2：纯化培养提取的植物内生菌以备测试；
S3：将培养的植物内生菌的代谢产物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出高致死率植物内生菌菌株；
S4：将选出的菌株进行发酵培养；
S5：过滤并浓缩发酵培养的发酵液得植物内生菌杀虫剂。
2.根据权利要求1所述的植物内生菌杀虫剂制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：
S11：植物材料的表面消毒：采集植物时保留根部土壤，用塑料布包裹根部，保持其鲜活状态；
S12：取所采集植株的根、茎、叶的健康组织用流水冲洗干净，用70％的酒精浸泡3min，再用2％次氯酸钠浸泡3min，最后用无菌水冲洗3次用以去除附着在材料表面的消毒剂；
S13：将最后一遍浸洗的无菌水取100gl涂布在LB培养基平板上，28℃培养72h小时后无微生物长出，表明表面消毒彻底；
S14：内生菌的分离：面消毒后的植株根、茎、叶分别用无菌剪刀纵切，然后放入灭菌研钵中研磨充分；
S15：将研磨后的植物组织液加入缓冲液在28℃、l50rpm条件下振荡1h，取不同稀释梯度的溶液分别涂布在LB培养基平板上，28℃恒温培养2-14天，待菌落生长完全后挑选接入LB琼脂斜面置于4℃条件下保存；
S16：菌落形态观察：有氮培养基上划线得到单菌落，观察单菌落形态与菌体形态并记录。
3.根据权利要求2所述的植物内生菌杀虫剂制备方法，其特征在于，所述缓冲液为10mlPBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的植物内生菌杀虫剂制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：将培养的植物内生菌的代谢产物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出高致死率植物内生菌菌株作为待测菌株；将待测菌株进行多代培养，将多代培养后的植物内生菌代谢物稀释后分别喷洒在果蝇和蚊子上，选出遗传稳定性良好的菌株；将选出的遗传稳定性良好的菌株继续培养，并将其代谢产物稀释后喷洒小鼠，将对小鼠无毒的菌株作为目标菌株。
5.根据权利要求1所述的植物内生菌杀虫剂制备方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括：过滤并浓缩发酵培养的发酵液，将浓缩后的发酵液配制成粉剂、可湿性粉剂、胶悬剂、喷射剂或气雾剂。
6.由以上任一权利要求所述的制备方法所制得的植物内生菌杀虫剂。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111011399A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-04-17 | 华侨大学 | 一种柑橘木虱植物源杀虫剂及其制备方法 |
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2018
- 2018-06-15 CN CN201810620553.5A patent/CN108739864A/zh active Pending
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