CN111676143A - 一种交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用,采用交链格孢(Alternaria alternata)发酵液对瓜列当种子萌发的测定具有良好的抑制作用,通过测定交链格孢(Alternaria alternata)发酵液和交链格孢(Alternaria alternata)粗提物抑制瓜列当种子萌发效果以及交链格孢(Alternaria alternata)发酵液接种瓜列当植株试验,交链格孢(Alternaria alternata)发酵液原液和浓度为10μg/mL粗提物对瓜列当种子萌发抑制率达100%;交链格孢(Alternaria alternata)发酵液25倍稀释液对瓜列当种子的抑制率为91.34%,50倍稀释液抑制率为87.68%;交链格孢(Alternaria alternata)发酵液接种瓜列当植株2~3天后伤口变褐,5~7天后整株萎蔫死亡。体现出交链格孢(Alternaria alternata)在防治瓜列当方面的应用具有显著突出的技术效果和应用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域,具体涉及一种交链格孢(Alternariaalternata)菌在瓜列当生防中的应用。
背景技术
瓜列当(Orobanche aegyptiaca)为列当科(Orobanchaceae)列当属一年生草本植物。由于缺少叶片、叶绿素和功能性根,列当完全寄生在寄主植物根系上,靠从寄主汲取水分、养分及各类生长激素来维持自身生长,因此会对寄主造成严重危害。列当杂草已经严重危害许多地区的农业生产。全球每年由列当杂草造成的经济损失达数十亿美元。近年来列当在河北、内蒙古、新疆等地大面积爆发,严重影响了农作物的产量和品种,使农民遭受巨大经济损失。其中新疆是瓜列当发生最严重的地区,瓜列当主要寄生于瓜类和茄科的番茄、马铃薯、茄子和烟草等作物上。据报道,在我国新疆,受瓜列当危害严重的甜瓜面积为5000~5500hm2,加工番茄为7000hm2。瓜列当对寄主的寄生率一般为30%~40%,危害严重的农田其寄生率高达100%,已经严重影响作物的生长及果实的产量和品质。瓜列当的发生可使甜瓜和西瓜减产20%~70%,加工番茄减产30%~80%。
列当生育期非常短,完成一个生育期仅需30天左右,且每株列当能产生5~10万粒种子,多者可达45万粒,其种子数量繁多、细小易传播,落进田间就很难清除。列当种子在土壤中生存,保持发芽能力5~10年,条件适宜时能存活30年以上。列当种子萌发和寄生均在地下完成,不易察觉,等发现列当寄生作物时,寄主已严重受害。目前列当防除方法有栽培防治、物理防治、化学防治、生物防治、抗性寄主等。轮作、施肥、深耕、调整播期和土壤暴晒等措施在一定程度上也能够减轻列当危害,但费工费时,效果不佳。除了耐化学除草剂的转基因作物,现有化学除草剂不能区分作物和列当。土壤熏蒸是最有效的但成本较高,并且由于对环境具有风险而被禁止。上述防除方法都无法有效消除列当。因此,目前列当的有效防治仍然是一个世界性难题。
生物防治是利用了生物物种间的相互关系,以一种生物抑制另一种生物的防治方法。它的优点是对污染压力较小,节约资源,对列当寄主作物安全性高、危害小,对人、畜等生物安全。近年来,利用微生物防除列当杂草的研究日益增多,已被报道的具有防除列当潜能的微生物包括镰刀菌(Fusarium spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、丛枝菌根真菌和假单胞菌(Pseudomonas spp.)等多种微生物已被报道具有防除列当杂草的能力,现有技术未见交链格孢(Alternaria alternata)菌在瓜列当生防中的应用报道。与从其他区域引进的微生物相比,应用来源本地的生防菌资源更易适宜当地生态环境,有利于微生物的定殖与持续发挥防除列当的作用。
发明内容
针对现有的菌株在防治列当还存在防治范围有限,发酵水平低,防治效果受环境影响较大等技术问题,且未见有文献和报道记载交链格孢(Alternaria alternata)在防治瓜列当方面的应用。本发明旨在于提供一种交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用,采用交链格孢(Alternaria alternata)发酵液对瓜列当种子萌发的测定具有良好的抑制作用,通过对交链格孢(Alternaria alternata)发酵液和交链格孢(Alternaria alternata)粗提物对瓜列当种子活性测定以及交链格孢(Alternariaalternata)发酵液接种瓜列当植株试验,交链格孢(Alternaria alternata)发酵液原液和浓度为10μg/mL粗提物对瓜列当种子萌发抑制率达100%;交链格孢(Alternariaalternata)发酵液25倍稀释液对瓜列当种子的抑制率为91.34%,50倍稀释液抑制率为87.68%;交链格孢(Alternaria alternata)发酵液接种瓜列当植株2~3天后伤口变褐,5~7天后整株萎蔫死亡。体现出交链格孢(Alternaria alternata)在防治瓜列当方面的应用具有显著突出的技术效果。
本发明提供一种交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用。
进一步,本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用的交链格孢(Alternaria alternata)培养方法,具体技术方案如下:
(1)采用外购或者自筛选交链格孢(Alternaria alternata),在自然发病瓜列当植株病健交界处剪切0.3cm左右的小块,加入70%酒精中浸泡1min,随即浸入3%次氯酸钠溶液中消毒3min,用无菌水连续漂洗4次,使用无菌镊子将瓜列当植株小块取出在灭菌滤纸上吸水后放置在PDA培养基平板上于28℃培养箱培养2~3天;从菌落边缘挑取菌丝接种于新的分离平板中进行纯化,连续纯化4次。
(2)将纯化保存的交链格孢(Alternaria alternata)转接于PDA平板中,28℃活化48h,将活化后的供试菌株菌饼移至液体培养基中,28℃,135r·min-1振荡培养24h后即为种子液;取5mL种子液接种于PDA液体培养基中,28℃,135r·min-1,振荡培养120h备用;用无菌水浸湿一张whatman滤纸(GA/A),置于培养皿中,然后将20粒瓜列当种子置于滤纸上,每个培养皿中加入2mLGR24和2mL发酵液,空白对照中加入2mL GR24(GR24为独脚金内酯的人工合成类似物)和2mL无菌水,PDCK(PDCK为液体培养基作为对照)处理中加入2mLGR24和2mLPDA液体培养基,3次重复;25℃黑暗条件下培养7d,体式显微镜下观察瓜列当种子萌发情况并记录萌发数量,计算校正抑制率,筛选校正抑制率达100%的菌株。
同时,本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)半固体种子液制备:将纯化保存的交链格孢(Alternaria alternata)转接于PDA平板上生长5d后,取菌饼加在半固体培养基中28℃,135r·min-1振荡培养24h后,即为半固体种子液。
本发明中,优先采用交链格孢(Alternaria alternata)菌饼加在半固体培养基中28℃,135r·min-1振荡培养24h后,即为半固体种子液,半固体培养基采用蛋白胨10g、麦芽糖40g、酵母提取粉10g、琼脂4g和蒸馏水1000mL。
本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)发酵液制备:用移液枪取种子液5mL转入大米培养基的中,28℃,培养15d,即得交链格孢(Alternaria alternata)发酵液。
本发明中,优先采用交链格孢(Alternaria alternata)种子液转入大米培养基中,大米培养基采用大米80g、酵母粉1.2g及蒸馏水120mL,封口、浸泡过夜后在121℃灭菌30min。
本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)粗提物的制备:将大米和固体发酵液进行机械粉碎,每瓶加入240mL乙酸乙酯浸泡、超声提取2次,旋转蒸发得到交链格孢(Alternaria alternata)粗提物浸膏。
进一步,本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)发酵液在防治瓜列当上的应用。
本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)粗提物在防治瓜列当上的应用。
本发明提供交链格孢(Alternaria alternata)发酵液不同接种方式瓜在防治瓜列当上的应用。
本发明中,采用的交链格孢(Alternaria alternata)为农业部允许使用的无害安全菌株,全部购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),普通技术人员可以通过公众渠道获得,该菌种交链格孢(Alternaria alternata)的培养采用公知的培养基和培养方法,采用的PDA固体、液体培养基和PCA培养基不限制本发明的实施。
通过以上技术方案分离得到的一株交链格孢(Alternaria alternata),将其应用于瓜列当防治方面,具有以下有益效果:
本发明提供的交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用。采用交链格孢(Alternaria alternata)发酵液对瓜列当种子萌发的测定具有良好的抑制作用,通过测定交链格孢(Alternaria alternata)发酵液和交链格孢(Alternaria alternata)粗提物抑制瓜列当种子萌发效果以及交链格孢(Alternaria alternata)发酵液接种瓜列当植株试验,交链格孢(Alternaria alternata)发酵液原液和浓度为10μg/mL粗提物对瓜列当种子萌发抑制率达100%;交链格孢(Alternaria alternata)发酵液25倍稀释液对瓜列当种子的抑制率为91.34%,50倍稀释液抑制率为87.68%;交链格孢(Alternariaalternata)发酵液接种瓜列当植株2~3天后伤口变褐,5~7天后整株萎蔫死亡。体现出交链格孢(Alternaria alternata)在防治瓜列当方面的应用具有显著突出的技术效果。
附图说明
图1为交链格孢(Alternaria alternata)发酵液对瓜列当种子萌芽抑制效果图,图中,A:对照;B:25倍发酵液;C:50倍发酵液。
图2为交链格孢(Alternaria alternata)粗提物对瓜列当种子萌芽抑制效果图,图中,A:对照;B:粗提物。
图3为交链格孢(Alternaria alternata)发酵液不同接种方式对瓜列当发病的影响图,图中,A:针刺接种;B:喷雾接种;C:涂抹接种;D:空白对照。
具体实施方式
下面举实施例介绍本发明,但是本发明并不限于下述的实施例。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的,但不限制本发明的实施,其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
本发明中材料有:交链格孢(Alternaria alternata)可通过公共渠道购买,工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
本发明中所述交链格孢(Alternaria alternata)培养优先采用培养基按下述配方制备:
PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖17g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。
PCA培养基:酵母粉2.5g,蛋白胨5g,葡萄糖1g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH7.0。
实施例1:交链格孢(Alternaria alternata)发酵液在防治瓜列当上的应用
本实施例所述交链格孢(Alternaria alternata)发酵液在防治瓜列当上的应用,具体步骤如下:将外购或者自筛选的交链格孢(Alternaria alternata)菌株在PDA平板上生长5d后,取菌饼加在半固体培养基(配方:蛋白胨10g、麦芽糖40g、酵母提取粉10g、琼脂4g和蒸馏水1000mL)中,28℃,135r·min-1,振荡培养24h,此为半固体种子液。用移液器取5mL半固体种子液加在大米培养基(配方:大米80g、酵母粉1.2g及蒸馏水120mL,封口、浸泡过夜后在121℃灭菌30min)中,28℃静置培养15d。
将交链格孢(Alternaria alternata)发酵液分别稀释至25倍和50倍,测试其不同浓度发酵液对瓜列当种子萌发抑制效果,由表1数据可知,交链格孢(Alternariaalternata)发酵液原液对瓜列当种子萌发的抑制率为100%;当交链格孢(Alternariaalternata)发酵液稀释25倍时,测得其对瓜列当种子萌发的校正抑制率为91.34%;当交链格孢(Alternaria alternata)发酵液稀释50倍时,测得其对瓜列当种子萌发的校正抑制率为87.68%,可见交链格孢(Alternaria alternata)发酵液不同倍数稀释液均对瓜列当种子萌发有较好抑制作用。同时通过显微镜观察可以观察交链格孢(Alternaria alternata)发酵液对瓜列当种子的萌发效果见附图1,由附图1可知,交链格孢(Alternariaalternata)发酵液处理后的瓜列当种子没有萌发,而对照组的瓜列当种子芽管生长良好。
表1:交链格孢(Alternaria alternata)发酵液对瓜列当种子萌芽效果
注:PDCK是液体培养基作为对照,CK是无菌水对照。
实施例2:交链格孢(Alternaria alternata)粗提物在防治瓜列当上的应用
菌株发酵:将外购或者自筛选的交链格孢(Alternaria alternata)菌株在PDA平板上生长5d后,取菌饼加在半固体培养基(配方:蛋白胨10g、麦芽糖40g、酵母提取粉10g、琼脂4g和蒸馏水1000mL)中,28℃,135r·min-1,振荡培养24h,此为半固体种子液。用移液器取5mL半固体种子液加在大米培养基(配方:大米80g、酵母粉1.2g及蒸馏水120mL,封口、浸泡过夜后在121℃灭菌30min)中,28℃静置培养15d。
菌株粗提物:将大米和菌体进行机械粉碎,每瓶加入240mL乙酸乙酯浸泡、超声、提取2次,旋转蒸发得到粗提物浸膏。
菌株粗提物抑制瓜列当种子萌发作用测定:于24孔板中每孔加入20粒消毒干燥的瓜列当种子、0.5mL独脚金内酯(GR24)和0.5mL无菌水,处理组加入10μg的粗提物浸膏,对照组加入无菌水,每处理3次重复。25℃,遮光培养5d后,体式显微镜下观察瓜列当种子萌芽数量并记录。
表2:交链格孢(Alternaria alternata)粗提液对瓜列当种子萌芽效果
供试菌株 | 发芽率(%) | 抑制率(%) |
10μg/mL粗提液 | 0 | 100 |
CK | 90 | --- |
注:CK是无菌水对照。
由表2结果可知,当交链格孢(Alternaria alternata)粗提液浓度为10μg/mL时,其对瓜列当种子萌发抑制率为100%。由附图2可知,显微镜下明显看到交链格孢(Alternaria alternata)粗提物处理后的瓜列当种子没有萌发,而对照组的瓜列当种子芽管生长良好。
实施例3:交链格孢(Alternaria alternata)发酵液不同接种方式在防治瓜列当上的应用
本实施例所述交链格孢(Alternaria alternata)发酵液不同接种方式在防治瓜列当上的应用,具体步骤如下:采取针刺、涂抹、喷雾三种方式在瓜列当植株上进行接种,针刺法:用接种针沾取孢子液,分别针刺列当植株的基部、中部和顶端三个部位;涂抹法:用涂布器沾取孢子液,分别涂抹列当植株的三个部位;接种后用湿润的脱脂棉覆盖,用喷有无菌水的密封袋罩住保湿24h后摘下密封袋和脱脂棉。喷洒法:喷洒孢子液在刚出土的列当上,用密封袋覆盖列当保湿24h后摘下;空白对照为无菌水,均为3次重复。2d后开始调查列当发病情况,7d后结束,调查结果如附图3所示。由附图3可知,三种方法均可使瓜列当植株致病,2~3天后伤口变褐,5~7天后整株萎蔫死亡,对照植株生长良好。
上述实施例表明,本发明在加工番茄田自然发病瓜列当茎部分离筛选出一株交链格孢(Alternaria alternata),其发酵液、粗提物稀均对瓜列当种子的萌发具有显著抑制作用,并对瓜列当植株具有强致病性。通过交链格孢(Alternaria alternata)发酵液和粗提物对瓜列当种子萌发进行测定,交链格孢(Alternaria alternata)发酵液原液和浓度为10μg/mL粗提液对瓜列当种子的萌发抑制率在100%,交链格孢(Alternaria alternata)发酵液稀释25倍时,其对瓜列当种子萌发的抑制率为91.34%,交链格孢(Alternariaalternata)发酵液稀释50倍时,其对瓜列当种子萌发的抑制率为87.68%,利用该菌株高效抑制瓜列当种子萌发进行农药抑菌剂配制,对于微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用。
2.一种交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中的应用的交链格孢(Alternaria alternata)培养方法,其特征在于,具体技术方案如下:
(1)采用外购或者自筛选交链格孢(Alternaria alternata),在自然发病瓜列当植株病健交界处剪切0.3cm左右的小块,加入70%酒精中浸泡1min,随即浸入3%次氯酸钠溶液中消毒3min,用无菌水连续漂洗4次,使用无菌镊子将瓜列当植株小块取出在灭菌滤纸上吸水后放置在PDA培养基平板上于28℃培养箱培养2~3天;从菌落边缘挑取菌丝接种于新的分离平板中进行纯化,连续纯化4次;
(2)将纯化保存的交链格孢(Alternaria alternata)转接于PDA平板中,28℃活化48h,将活化后的供试菌株菌饼移至液体培养基中,28℃,135r·min-1振荡培养24h后即为种子液;取5mL种子液接种于PDA液体培养基中,28℃,135r·min-1,振荡培养120h备用;用无菌水浸湿一张whatman滤纸(GA/A),置于培养皿中,然后将20粒瓜列当种子置于滤纸上,每个培养皿中加入2mLGR24和2mL发酵液,空白对照中加入2mL GR24和2mL无菌水,PDCK处理中加入2mLGR24和2mL PDA液体培养基,3次重复;25℃黑暗条件下培养7d,体式显微镜下观察瓜列当种子萌发情况并记录萌发数量,计算校正抑制率,筛选校正抑制率达100%的菌株。
3.如权利要求1或2任一项所述的交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中应用的固体种子液制备,其特征在于,将纯化保存的交链格孢(Alternaria alternata)转接于PDA平板上生长5d后,取菌饼加在半固体培养基中28℃,135r·min-1振荡培养24h后,即为半固体种子液。
4.如权利要求3所述的交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中应用的半固体种子液制备,其特征在于,采用交链格孢(Alternaria alternata)菌饼加在半固体培养基中28℃,135r·min-1振荡培养24h后,即为半固体种子液,半固体培养基采用蛋白胨10g、麦芽糖40g、酵母提取粉10g、琼脂4g和蒸馏水1000mL。
5.如权利要求1或2任一项所述的交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中应用的发酵液制备,其特征在于,用移液枪取种子液5mL转入大米培养基的中,28℃,培养15d,即得交链格孢(Alternaria alternata)发酵液。
6.如权利要求5所述的交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中应用的发酵液制备,其特征在于,采用交链格孢(Alternaria alternata)种子液转入大米培养基中,大米培养基采用大米80g、酵母粉1.2g及蒸馏水120mL,封口、浸泡过夜后在121℃灭菌30min。
7.如权利要求1或2任一项所述的交链格孢(Alternaria alternata)在瓜列当生防中应用的粗提物的制备,其特征在于,将大米和固体发酵液进行机械粉碎,每瓶加入240mL乙酸乙酯浸泡、超声提取2次,旋转蒸发得到交链格孢(Alternaria alternata)粗提物浸膏。
8.如权利要求5所述交链格孢(Alternaria alternata)发酵液在防治瓜列当上的应用。
9.如权利要求7所述交链格孢(Alternaria alternata)粗提物在防治瓜列当上的应用。
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