CN114410790B - 一种用于检测ctDNA的生物传感检测***及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测ctDNA的生物传感检测***及其检测方法，包括有：球形核酸报告子、RCA产物和CRISPR/Cas12a体系；其中：球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子；RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物；CRISPR/Cas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物。本发明SNA在生理环境中具有优异的抵抗核酸酶切割的能力。因此，用SNA报告子代替ssDNA报告子可以提高CRISPR/Cas12a体系的稳定性；并利用滚环扩增(RCA)具有操作简单、反应温度温和、扩增效率高等优点，将RCA与CRISPR/Cas12a体系结合在一起，在可以显著提高体系的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测ctDNA的生物传感检测***及其检测方法。
背景技术
循环肿瘤DNA(ctDNA)是原发肿瘤组织、循环肿瘤细胞和其他微转移灶通过凋亡、坏死、直接分泌的方式释放进入外周血循环***，与癌症具有高度相关性。循环肿瘤DNA检测是一种无创的液体活检技术。与传统的侵入性的组织活检技术相比，液体活检更能揭示肿瘤在空间和时间上的异质性；提供更全面的疾病描述；并且可以实时检测药物疗效和耐药性。并且循环肿瘤DNA的半衰期很短，一般只有15分钟到两个小时，因此比传统的蛋白质类生物标志物更能准确的反应肿瘤的当前状况。有研究表明，ctDNA的水平能实时反应全身肿瘤负荷变化，患者体内的ctDNA在经过有效治疗后会急剧降低。因此，循环肿瘤DNA可用于癌症的早期诊断、个体化治疗以及术后监测。
尽管ctDNA具有很大的应用潜力，但由于其在血液中的浓度很低，且需要在大量野生型序列存在的条件下检测少量突变型序列，因此并没有广泛应用到临床实际样本的检测中。当前，ctDNA的检测方法主要是DNA深度测序和数字聚合酶链式反应。虽然这两种方法对ctDNA的检测具有较好的灵敏度和选择性，但都有其不可避免的缺点，如技术复杂，成本高，耗时长，需要专业的人员分析海量的数据且通量有限、容易产生假阳性信号等。因此现在急需开发出一种灵敏度高，选择性好，操作简单，成本低廉且快速的ctDNA的检测方法。
成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(CRISPR/Cas)***是存在于细菌和古生菌中的自适应免疫防御体系，被广泛应用于基因编辑领域。其中CRISPR/Cas12a(Cpf1)是II类V型CRISPR/Cas***，该体系是由crRNA引导的，与靶核酸进行特异性识别和切割(顺式切割)，从而触发其对底物单链DNA的非特异性切割活性(反式切割)，实现每秒上千次的翻转。CRISPR/Cas体系具有操作简单，反应温度温和，良好的识别特异性以及高效的信号放大能力等优点，因此广泛应用于生物传感领域。
然而，CRISPR/Cas12a体系也存在两个显著的缺点。一方面是稳定性较差，因为Cas12a的反式切割底物一般是ssDNA，但ssDNA在血清等复杂生理环境中的稳定性较差，容易被核酸酶所降解，产生假阳性信号。另一方面是单纯的CRISPR/Cas12a体系的灵敏度较低，不能用于临床低丰度样本的检测。因而如何研究一种利用CRISPR/Cas12a体系实现检测ctDNA具有重大的研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测ctDNA的生物传感检测***及其检测方法，该检测***中球形核酸技术、CRISPR/Cas12a体系和RCA技术结合在一起，可以提高ctDNA检测的稳定性和灵敏度，避免产生假阳性的产生。
本发明这种检测ctDNA的生物传感检测***，包括有：球形核酸报告子、RCA产物和CRISPR/Cas12a体系；
其中：球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子；RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物；CRISPR/Cas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物；
5’磷酸化线性挂锁探针序列如序列1所示，具体为：AAATCACTGAGTTTATCATGTATTATAATTTCGTATGTAAGCTACCTGAGATCTTCTGTACAATTGATCCTCTCTCTA；crRNA的序列如序列2所示，具体为：UAAUUUCUA CUAAGUGUAGAUGUAUGUAAGCUACCUGAG。
本发明这种检测ctDNA的生物传感检测***的检测方法，包括以下步骤：
S1：金纳米粒子的制备：在干净的圆底烧瓶中加入氯金酸溶液，放入油浴锅中，溶液沸腾设定时间后加入柠檬酸钠溶液，提高转速，溶液颜色变成酒红色后，再继续煮沸，然后待其自然冷却到室温后，得到含金纳米金纳米粒子的分散液，低温避光保存；
S2：球形核酸报告子的制备：用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链，将处理后的巯基DNA链与步骤1)金纳米粒子分散液按照设定的比例混合，再加入吐温20和Citrate-HCl，37℃放置过夜；然后向溶液中加入NaCl，放置过夜；最后用无酶水洗3次，洗掉多余的ssDNA，得到球形核酸报告子；
S3：滚环扩增RCA反应：将5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CA E542KM和T4连接酶混合在1×T4连接酶反应缓冲液中，进行第一次孵育，然后通过热处理灭活T4连接酶，最终获得环状DNA模板；扩增反应中，向上述反应液中加入dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液，进行第二次孵育，同样通过热处理灭火phi29酶，最终得到RCA产物；
S4：RCA-CRISPR/Cas12a切割反应：将LbCas12a蛋白和crRNA在1×NEB缓冲液中孵育，形成稳定的LbCas12a/crRNA二元复合物；然后，将LbCas12a/crRNA二元复合物与RCA产物进行混合反应，再然后将SNA报告子加入到上述混合液中，继续反应，反应完毕后，检测反应液的荧光。
所述步骤S1中，氯金酸溶液的质量浓度为0.005～0.015wt％，柠檬酸钠溶液的浓度为2～4wt％，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液溶液的体积比为95～105:1；油浴温度为120～140℃，转速为700～900rpm；设定时间为5～15min；提高转速至1100～1300rpm；继续煮沸时间为20～40min，最终获得金纳米粒子的平均尺寸为10～15nm。
所述步骤S2中，FAM荧光基团修饰的巯基DNA链的核苷酸序列如序列3所示，具体为:FAM-TTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1；处理后巯基DNA链与金纳米粒子的摩尔比490～510:1；加入吐温20至其浓度为0.01％；Citrate-HCl的浓度为0.5M，pH＝7；分多次NaCl的浓度为3M，加入NaCl至反应体系中NaCl终浓度为1M。
所述步骤S3中，5’磷酸化线性挂锁探针的浓度为90～110nM，T4连接酶的浓度为1000U/μL，5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CA E542KM和T4连接酶的体积比为(1～3):(1～3):(0.2～0.4)；第一次孵育温度为18～22℃,第一次孵育时间为18～22min；dNTP浓度为2.0～3.0mM；BSA浓度为18～22mg/mL，phi29酶浓度为8～12U/μL，5’磷酸化线性挂锁探针、dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液的体积比为(1～3):(7～9):(0.7～0.9):(0.3～0.5):(3～5)；第二次孵育温度为28～32℃，第一次孵育时间为28～32min。
所述步骤S3中，ctDNA-PIK3CAE542KM的序列为如序列4所示，具体为：CTCAGTGATTTTAGAGAGAGGAT；获得RCA产物的序列是一个循环序列，具体为：5'-CTCAGTGATTTTAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGC TTACATACGAAATTA TAATTGTACAATAACTCAGTGATTT TAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGCT TACATACGAAATTATAATTGTACAATAA……
所述步骤S4中，LbCas12a蛋白和crRNA的比例为1nM:10nM；LbCas12a/crRNA二元复合物与RCA产物、SNA报告子的体积比为1:5:5；孵育温度为37℃，孵育时间为20～40min；混合反应时间为50～70min；继续反应时间为50～70min。
本发明的有益效果：1)本发明SNA在生理环境中具有优异的抵抗核酸酶切割的能力。因此，用SNA报告子代替ssDNA报告子可以提高CRISPR/Cas12a体系的稳定性；并利用滚环扩增(RCA)具有操作简单、反应温度温和、扩增效率高等优点，将RCA与CRISPR/Cas12a体系结合在一起，在可以显著提高体系的灵敏度。2)本发明中的检测ctDNA的生物传感检测***可以实现复杂血清环境中ctDNA的高灵敏、特异性检测，在缓冲液中的检测限可低至10aM。
附图说明
图1本发明检测方法的工艺流程图；
图2实施例1中不同浓度的ctDNA所对应荧光强度图；
图3实施例2中生物传感检测***对ctDNA选择性研究的结果图；
图4实施例3中生物传感检测***检测复杂环境中ctDNA的结果图；
图5实施例4中两种不同报告子生物传感检测***对检测ctDNA的稳定性结果图。
具体实施方式
实施例1-生物传感器灵敏度分析
本发明的检测方法流程原理图，如图1所示，具体步骤如下：
本实施例提供一种基于ctDNA高灵敏、特异性检测的生物传感器的具体实施方式，具体为以下步骤：
S1、制备13nm金纳米粒子：圆底烧瓶先用王水浸泡，再用超纯水彻底清洗干净。在干净的圆底烧瓶中加入100mL 0.01wt％的氯金酸溶液，然后将圆底烧瓶放入油浴锅中，将油浴温度设置为130℃，转速设置为800rpm。待溶液沸腾后再继续煮沸10min，以去除溶液中的溶解氧。将转速提高到1200rpm，然后向溶液中快速加入1mL 3wt％的柠檬酸钠，溶液由浅黄色，快速变为黑灰色，再转变为***，最后变为酒红色，颜色不变后再继续煮沸30min。之后待溶液自然冷却到室温后，放到4℃避光保存，测得金纳米粒子的平均尺寸为13nm。
S2、制备球形核酸报告子：：在37℃下，用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链1.5h，之后通过3次超滤去除多余的TCEP(10000rpm，4℃，15min)。将处理后的巯基DNA链与金纳米粒子按摩尔比500：1的比例混合，再加入0.01％吐温20和10uL Citrate-HCl(0.5M PH＝7.5)，37℃放置过夜。第二天，每隔1h加入3M NaCl到上述溶液中，使NaCl的终浓度为1M，同样在37℃下放置过夜。最后用无酶水洗3次(16200rpm，4℃，20min)，洗掉未反应的ssDNA，得到球形核酸报告子SNA。
S3、滚环扩增反应：将2μL 100nM 5’磷酸化线性挂锁探针、分别加入2μL不同浓度的PIK3CAE542KM(0pM-10pM)和0.3μLT4连接酶(1000U/μL)混合在1×T4连接酶反应缓冲液中，在20℃下孵育20分钟，然后在65℃下热处理5分钟以灭活T4连接酶，最终获得环状DNA模板。扩增反应中，在上述反应液中加入8μL dNTP(2.5mM)、0.8μLBSA(20mg/mL)、0.4μLphi29酶(10U/μL)和4μLphi29缓冲液，30℃孵育30min，65℃加热10分钟，最终得到长ssDNA产物即RCA产物。
S4、RCA-CRISPR/Cas12a切割反应：1nM LbCas12a蛋白和10nM crRNA在1×NEB缓冲液2.1中37℃孵育30分钟，形成稳定的二元复合物。然后，将2uL LbCas12a/crRNA复合物与10uLRCA产物混合并在37℃下孵育60分钟，进行顺式切割。接下来，将10uL SNA报告子加入到上述混合液中，37℃下反应60分钟后，进行荧光检测，其结果如图2所示，从图中可以看出ctDNAPIK3CA E542KM的浓度越高荧光强度越高，最低可检测到10aM的ctDNA；说明本发明中的生物传感检测***对ctDNA有很高的灵敏度。
表1：方法中涉及的序列及序列信息
实施例2
本实施例的步骤与实施例1的区别仅在于滚环扩增反应阶段。在本实施例中，将2μL 100nM 5’磷酸化线性挂锁探针、分别将2μL不同种类的ctDNA(PIK3CAE542KM、mismatch-PIK3CAE542KM、KRAS G12DM)和0.3μLT4连接酶(1000U/μL)混合在1×T4连接酶反应缓冲液中，在20℃下孵育20分钟，然后在65℃下热处理5分钟以灭活T4连接酶，最终获得环状DNA模板。扩增反应中，在上述反应液中加入8μL dNTP(2.5mM)、0.8μLBSA(20mg/mL)、0.4μLphi29酶(10U/μL)和4uLphi29缓冲液，30℃孵育30min，65℃加热10分钟，最终得到长ssDNA产物即RCA产物。
所述生物传感检测***选择性分析结果如图3所示，RCA-CRISPR/Cas12a体系仅对靶标(PIK3CA E542KM)有明显的荧光响应，而对于碱基错配的PIK3CAE542KM以及其他不相关ctDNA(KRAS G12DM)的荧光响应很低，说明该体系具有较好的选择性。
实施例3
本实施例的步骤与实施例1的区别仅在于滚环扩增反应阶段。在实施例3中，将2μL100nM 5’磷酸化线性挂锁探针、2uL 10pM PIK3CAE542KM、0.3μLT4连接酶(1000U/μL)、2μL10×T4连接酶反应缓冲液和13.7μL无酶水(或者13.7μL 10％人血清)，在20℃下孵育20分钟，然后在65℃下热处理5分钟以灭活T4连接酶，最终获得环状DNA模板。扩增反应中，在上述反应液中加入8μL dNTP(2.5mM)、0.8μLBSA(20mg/mL)、0.4μLphi29酶(10U/μL)、4μLphi29缓冲液和6.8μL无酶水(6.8μL 10％人血清)，30℃孵育30min，65℃加热10分钟，最终得到长ssDNA产物即RCA产物。
本发明的生物传感器检测***在缓冲液和复杂血清环境中的检测性能对比分析结果如图4所示，RCA-CRISPR/Cas12a体系在缓冲液和复杂血清环境中的荧光响应趋势基本相同，说明该体系有望用于临床血清样本中ctDNA的高灵敏和特异性检测。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，没有S1和S2步骤；步骤S4中SNA报告子采用ssDNA报告子进行替代，两者的对比效果如图5所示，由图可知：在100％FBS中ssDNA报告子基本被完全降解，荧光强度显著升高；而SNA报告子基本没有被降解，荧光强度保持不变。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种用于检测ctDNA的生物传感检测***及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 5’磷酸化线性挂锁探针(人工序列)
<400> 1
aaatcactga gtttatcatg tattataatt tcgtatgtaa gctacctgag atcttctgta 60
caattgatcc tctctcta 78
<210> 2
<211> 39
<212> RNA
<213> crRNA(人工序列)
<400> 2
uaauuucuac uaaguguaga uguauguaag cuaccugag 39
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> FAM荧光基团修饰的巯基DNA链(人工序列)
<400> 3
tttttttttt ttttt 15
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> ctDNA-PIK3CA E542KM(人工序列)
<400> 4
ctcagtgatt ttagagagag gat 23
Claims (5)
1.一种检测ctDNA的生物传感检测***，其特征在于，包括有：球形核酸报告子、RCA 产物和CRISPR/Cas12a体系；
其中：球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子；RCA 产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物；CRISPR/Cas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物；
LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物与RCA产物、球形核酸报告子的体积比为1:5:5；
5’磷酸化线性挂锁探针序列如序列1所示，具体为：AAATCACTGAGTTTATCATGTATTATAATTTCGTATGTAAGCTACCTGAGATCTTCTGTACAATTGATCCTCTCTCTA；crRNA的序列如序列2所示，具体为：UAAUUUCUA CUAAGUGUAGAUGUAUGUAAGCUACCUGAG；
所述RCA产物的制备包括：将5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CA E542KM和T4 连接酶混合在 1×T4 连接酶反应缓冲液中，进行第一次孵育，然后通过热处理灭活T4连接酶，最终获得环状DNA模板；扩增反应中，向上述反应液中加入dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液，进行第二次孵育，同样通过热处理灭活phi29酶，最终得到RCA产物；
所述金纳米粒子的制备方法包括：在干净的圆底烧瓶中加入氯金酸溶液，放入油浴锅中，溶液沸腾设定时间后加入柠檬酸钠溶液，提高转速，溶液颜色变成酒红色后，再继续煮沸，然后待其自然冷却到室温后，得到含金纳米粒子的分散液，低温避光保存；
所述球形核酸报告子的制备包括：用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链，将处理后的巯基DNA链与所述金纳米粒子分散液按照设定的比例混合，再加入吐温20和Citrate-HCl，37℃放置过夜；然后向溶液中加入NaCl，放置过夜；最后用无酶水洗3次，洗掉多余的ssDNA，得到球形核酸报告子；
所述处理后巯基DNA链与金纳米粒子的摩尔比490~510:1；
所述稳定二元复合物的制备包括：将LbCas12a蛋白和crRNA在1×NEB缓冲液中孵育，得到稳定的LbCas12a/crRNA 二元复合物；
所述LbCas12a蛋白和crRNA的比例为1nM:10nM。
2.根据权利要求1所述的生物传感检测***，其特征在于，所述氯金酸溶液的质量浓度为0.005~0.015wt%，柠檬酸钠溶液的浓度为2~4wt%，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液溶液的体积比为95~105:1；油浴温度为120~140℃，转速为700~900rpm；设定时间为5~15min；提高转速至1100~1300rpm；继续煮沸时间为20~40min，最终获得金纳米粒子的平均尺寸为10~15nm。
3.根据权利要求1所述的生物传感检测***，其特征在于，所述FAM荧光基团修饰的巯基DNA链的核苷酸序列如序列3所示，具体为:FAM-TTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1；加入吐温20至其浓度为0.01%；Citrate-HCl的浓度为0.5M，pH=7；分多次NaCl的浓度为3M，加入NaCl至反应体系中NaCl终浓度为1M。
4.根据权利要求1所述的生物传感检测***，其特征在于，所述5’磷酸化线性挂锁探针的浓度为90~110nM，T4 连接酶的浓度为1000U/μL，5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CA E542KM和T4 连接酶的体积比为(1~3):(1~3):(0.2~0.4)；第一次孵育温度为18~22℃,第一次孵育时间为18~22min； dNTP浓度为2.0~3.0mM； BSA浓度为18~22mg/mL，phi29酶浓度为8~12U/μL，5’磷酸化线性挂锁探针、dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液的体积比为(1~3):(7~9):(0.7~0.9):(0.3~0.5):(3~5)；第二次孵育温度为28~32℃，第二次孵育时间为28~32min。
5.根据权利要求1所述的生物传感检测***，其特征在于，所述ctDNA-PIK3CA E542KM的序列为如序列4所示，具体为：CTCAGTGATTTTAGAGAGAGGAT；获得RCA产物的序列是一个循环序列，具体为：5'-CTCAGTGATTT TAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGCTTACATACGAAATTATAATTGTACAATAA
CTCAGTGATTT TAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGCTTACATACGAAATTATAATTGTACAATAA……。
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