CN111394430A - 一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***及其应用，所述***包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，且经剪切和聚合置换反应得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与激活链序列片段互补。本发明可用于特定序列DNA和UDG活性检测，具有成本低、响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便的优点，抗干扰能力强，同时具有较高的灵敏度和特异性，也将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测*** 及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***及其应用。

背景技术

DNA是活细胞中最重要的生物分子之一，参与了多种遗传信息的调节。DNA传感器是一类检测特定序列DNA的生物传感器，被广泛应用于具有实际意义特定序列DNA的检测，在医学诊断、遗传疾病、突变检测、食品控制、法医和环境监测等方面具有重要意义。一般而言，与特定疾病相关的特定序列DNA通常具有超痕量、易降解和检测环境复杂等特征。然而，当前检测特定序列DNA的检测技术通常依赖于聚合酶链式反应(PCR)，其存在一些缺点，如耗时、操作过程复杂、检测限不足、需要专门的仪器设备等。因此，开发一种能简单、超灵敏、精确检测特定序列DNA的检测方法具有重要意义。例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合症(ADIS)的相关病毒，可导致人类免疫***崩溃，并最终通过破坏和吞噬人类T4淋巴细胞从而导致细胞死亡。到目前为止，还没有有效的艾滋病毒治疗方法。幸运的是，已经找到了治愈ADIS的抗逆转录病毒疗法，对HIV感染的早期诊断和治疗可以有效保护宿主的免疫功能并延长生存期。因此，HIV基因的早期和精确检测对于感染个体的早期诊断和临床治疗极为重要。

保持基因组完整性是所有生物完成其基因转录的前提。令人遗憾的是，基因组的稳定性和准确性会受到某些内在或外在因素的干扰，例如一些毒性化学物质，紫外线辐射和物理辐射等会导致基因组的变异并诱导各种疾病的产生。在生物体中，胞嘧啶的脱氨作用可能导致双螺旋DNA中U：G碱基对的形成，最终导致G：C碱基对突变为A：T碱基对。因此，修复此类DNA损伤对维持生物体基因组完整性具有重要意义。近年来，对DNA修复的几种特定途径进行了深入研究，如错配修复(MMR)，核苷酸切除修复(NER)和碱基切除修复(BER)。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)是碱基切除修复酶中的一种重要酶。从细菌到人类的大多数生物中都存在碱基切除修复酶，该酶可以特征性地识别尿嘧啶并催化脱氧核糖和尿嘧啶之间N-糖苷键切开，从而产生一个嘌呤/嘧啶(AP)位点来启动碱基切除修复(BER)保持基因组完整性。但是，UDG的异常活性可能会阻碍包含尿嘧啶的DNA碱基切除修复过程的正常进行，从而导致各种病变，如化疗耐药性、淋巴瘤、癌症、神经退行性疾病、布鲁姆综合征和人类免疫缺陷。考虑到其重要的生物学作用，UDG已成为诊断各种疾病的有希望的治疗靶标和潜在的生物标志物。传统的检测方法，如凝胶电泳、质谱、电化学、化学发光、比色法和放射性同位素标记已被用于UDG的活性检测。但是这些方法存在耗时、灵敏度低、操作复杂等缺点。因此，建立一个能够准确、高度灵敏、有效地检测UDG活性的检测方法对临床诊断和生物医学研究均具有重要意义。

CRISPR/Cas***是RNA指导的自适应性免疫机制，用于特异性识别和裂解外源核酸。自它被发现以来，由于其在基因编辑中的重要作用而备受期待。此外，CRISPR/Cas***可用于分析领域。Doudna发现CRISPR/Cas12a在特异性识别靶标核酸被激活后具有不加选择的切割活性(反式切割)，这揭示了CRISPR/Cas在分析中的巨大潜力。通过将Cas12assDNase激活与重组聚合酶等温扩增相结合，他们创建了一种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)的方法，该方法可实现DNA的aM级检测。随后，Zhang发现CRISPR/Cas13可以结合靶单链RNA并激活其不加选择的反式切割活性(反式切割)。他们基于Cas13的SHERLOCK(特定的高灵敏度酶报告基因解锁)平台可以检测到患者样品中的寨卡病毒(ZIKV)和登革热病毒(DENV)，其浓度低至每微升1个拷贝。所有这些发现证明，CRISPR/Cas***在分析具有巨大的潜力。但是，将CRISPR/Cas***与某些核酸扩增技术(例如滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)，环介导的等温扩增(LAMP)和发夹链反应(HCR))结合起来进行检测目标物质尚未研究。而且，利用CRISPR/Cas***检测其他生物分子的方法仍需要扩展。

发明内容

针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***及其应用，解决现有特异DNA或UDG活性检测存在灵敏度低、效率低和操作复杂等问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***，包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，所述双链DNA经剪切和聚合置换得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与所述激活链序列片段互补；所述crRNA引导LbaCas12a与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，从而切割报告单链DNA分子，产生荧光。

进一步，所述检测***还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、缓冲液、稀释剂、镁离子、锰离子或辅助因子。

本发明还提供了一种上述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***在特定序列DNA的检测、UDG活性抑制剂的筛选或UDG活性生物样品的检测方面的应用。具体包括以下步骤：

(1)在DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI存在下，引发增强型链置换扩增产生激活链序列片段；

(2)将步骤(1)得到的激活链序列片段与crRNA识别区域互补配对激活CRISPR/Cas12a体系反式切割活性；

(3)步骤(2)中被激活的CRISPR/Cas12a体系切割加入到体系中的报告单链DNA分子，检测所述体系中的荧光强度即可。

本发明还提供了一种上述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***在HIV-1检测的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括以下步骤：

S1：针对LbaCas12a序列和激活链序列片段，设计识别区域特异性的crRNA序列，所述crRNA序列如SEQ ID NO：1所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

S2：合成模板-1，所述模板-1序列如SEQ ID NO：2所示，所述模板-1能与待检测的HIV-1序列互补，合成双链DNA；

S3：将步骤S2合成的模板-1、不同浓度的HIV-1、dNTPs、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于37℃下进行链置换扩增反应，反应结束，然后高温使酶失活，得到扩增产物；

S4：取步骤S3得到的扩增产物，加入一定浓度的报告单链DNA分子、LbaCas12a和步骤S1所述的crRNA分子，以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于在37℃下进行剪切反应，反应一段时间后终止反应，读取荧光检测信号；

S5：根据不同浓度HIV-1的标准溶液做HIV-1浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中HIV-1的浓度。

本发明还提供了一种上述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***在UDG活性检测的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括以下步骤：

1)针对LbaCas12a序列和激活链序列片段，设计识别区域特异性的crRNA序列，所述crRNA序列如SEQ ID NO：1所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

2)合成模板-2序列和UDG引物，所述模板-2序列如SEQ ID NO：3所示，所述UDG引物序列如SEQ ID NO：4所示；所述UDG引物在其3’端修饰有尿嘧啶，待检测物UDG酶能够识别并将UDG引物链中的尿嘧啶处理成为AP位点，所述AP位点又能够被核酸内切酶IV剪切，得到预处理后的UDG引物；所述的模板-2能与预处理后的UDG引物碱基互补合成双链DNA；

3)将步骤2)合成的模板-2和UDG引物以及不同浓度的UDG酶和核酸内切酶IV混合，并置于37℃下恒温反应40～80min；

4)将步骤3)得到的反应溶液加入dNTPs、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于37℃下链置换扩增反应，反应结束，然后高温使酶失活，得到扩增产物；

5)取步骤4)得到的扩增产物，加入报告单链DNA分子、LbaCas12a和步骤(1)所述的crRNA分子中，以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于在37℃下剪切反应，反应一段时间后终止反应，读取荧光检测信号；

6)根据不同浓度UDG酶的标准溶液做UDG酶的活性-荧光强度的标准曲线，计算回归方程；再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中UDG酶的活性。

作为优选的，所述链置换扩增反应时间为60～100min，所述剪切反应时间为15～35min。

作为优选的，所述DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI在反应体系中的浓度各自独立选自0.15～0.35U/μL。

作为优选的，所述报告单链DNA分子的两端分别带有HEX和BHQ1基团的7碱基单链DNA分子，序列如HEX-NNNNNNN-BHQ1所示。

作为优选的，所述荧光检测是在波长496nm处激发荧光，在波长556nm处检测荧光强度。

本发明检测原理为：在crRNA的引导下，LbaCas12a蛋白与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，同时在体系中加入单链荧光报告分子(常用的单链报告分子是一段寡核苷酸序列，一端带有一个发光基团，一端带有一个淬灭基团，正常情况下由于淬灭作用，完整的单链报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的荧光信号可以被检测到)，借用CRISPR-Cas12a酶反式切割活性，可以实现待检序列信息向荧光信号的转化。并且通过E-SDA与CRISPR-Cas12a的偶联，能够实现增强链置换扩增(E-SDA)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的多级放大，因此具有良好的灵敏度。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明针对的特定序列核酸检测***将CRIPSR/Cas12a核酸识别调控***和增强链置换扩增(E-SDA)相结合，并开发出新的多步生物扩增技术。与传统的SDA相比，E-SDA的扩增效率大大提高，因为其中间产物能够诱导另一个SDA的启动。E-SDA中生成的激活链序列片段可以充当激活剂，以解锁CRISPR/Cas12a的反式切割活性，从而不加区分的切割***中添加的单链报告DNA分子。在此基础上，依据UDG能够识别并处理DNA引物链中尿嘧啶产生AP位点的特性，设计能够检测UDG活性的DNA引物链，再通过检测荧光强度实现对特定序列DNA或UDG活性的快速检测。该发明体系为特定序列DNA和UDG活性检测提供了新思路和新选择，也将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。

2、本发明提供的检测***在最佳实验条件下，所提出的的检测方法可以检测到低至87.3aM的HIV-1或低至3.1×10^-5U/mL的UDG活性，可超灵敏地检测序列特异性DNA或UDG活性。可以在2.5小时内实现对特定序列DNA的aM灵敏度，或者在3.5小时内实现超低UDG活性检测。本发明解决了现有技术对DNA或UDG活性检测存在灵敏度低、效率低和操作复杂等问题。

3、本发明的检测***具有本底低、响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便的优点，抗干扰能力强，同时具有较高的灵敏度和特异性，克服了传统核酸检测对仪器的依赖，结果读取简单。

4、本发明首次利用CRISPR/Cas12a***的反式切割检测非核酸物质UDG，可以用于UDG活性检测或UDG抑制剂的筛选，用来检测除核酸外的其它生物分子，扩大了CRISPR/Cas12a***的检测和应用范围，并提供了可行性的理论基础。

附图说明

图1为本发明检测***针对特定序列HIV-1检测原理图。

图2为本发明检测***的条件优化图；A为CRISPR/Cas12a的剪切时间，B为E-SDA的扩增孵育时间，C为Klenow片段(3’-5’exo-)的浓度，D为Nt.BbvCI的浓度；其中每组实验中左侧的为实验组，右侧的为对照组。

图3为本发明检测***对HIV-1分析图；图A为不同浓度HIV-1的荧光光谱图；图B为不同浓度HIV-1在556nm处对应的荧光值，其插图为当HIV-1浓度在100aM至5pM时对应的取对数拟合曲线。

图4为本发明检测***对HIV-1的特异性检测；图A为在靶标物HIV-1及不同类似物在浓度为20pM的荧光光谱；图B为靶标物HIV-1及不同类似物的荧光响应图。

图5为本发明检测***针对UDG活性检测的原理图。

图6为本发明检测***对UDG分析图；图A为不同浓度UDG的荧光光谱图；图B为不同浓度UDG在556nm处对应的荧光值，其插图为当UDG在5.0×10^-5至0.1U/mL时对应的取对数拟合曲线。

图7为本发明检测***对UDG的特异性检测；图A为在目标物UDG及其不同类似物在0.1U/mL的荧光光谱；图B为目标物UDG及其不同类似物的荧光响应图。

图8为本发明检测***对UDG抑制剂的检测；图A为在0.1U/mLUDG中加入不同浓度UGI的荧光光谱；图B为UGI对0.1U/mLUDG活性的抑制作用。

图9为本发明检测***对不同溶液的荧光强度，从左到右依次为HeLa细胞裂解液、HeLa细胞裂解液+0.30U/mLUDI和裂解缓冲液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

以下实施例所有核酸序列由上海生物有限公司合成，并采用高效液相色谱进行纯化。所有核酸序列的详细信息见表1。HiScribe T7 Quick高保真RNA合成试剂盒购自NEB公司。MiRcute miRNA分离纯化试剂盒从北京天根公司购买。Klenow酶，Nt.BbvCI酶，dNTPs，LbCas12a以及尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI从NEB公司订购。尿嘧啶糖基转移酶(UGD)，核酸内切酶IV，HaLe细胞裂解液购买自上海生物有限公司。正常人血清从赛默飞科技有限公司购买。

表1

用LS-55分光光度计(P.E.USA)对***的荧光强度进行测量，在测量过程中，激发波长设置为495nm，最佳发射波长为556nm，激发和发射缝隙分别设置为12nm和8nm。通过Azure Biosystems C150(美国)进行照胶。

一、一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***

所述检测***包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补或被UDG及核酸内切酶IV处理过的UDG引物碱基互补，在DNA聚合酶及脱氧核糖核苷三磷酸存在条件下，合成与模板链互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，所述双链DNA在核酸内切酶处理下，于特定位点剪切，在再聚合酶作用下聚合置换出能够与crRNA识别区域互补配对的激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与所述激活链序列片段互补；所述crRNA引导LbaCas12a与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，从而切割报告单链DNA分子，产生荧光。

二、一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的HIV-1的检测方法

如图1所示，基于CRISPR/Cas12a***结合增强链置换扩增(E-SDA)的针对特定序列DNA(例如HIV-1)检测的方法。在聚合酶和dNTPs存在下，特定序列DNA(HIV-1)作为引物用于诱导DNA聚合合成双链。在合成模板-1中设计了两个核酸内切酶Nt.BbvCI的识别位点，当加入核酸内切酶Nt.BbvCI后，在其识别位点处进行剪切。随后的链置换合成在切口处延伸3'末端，并置换出下游DNA链(d*和c*)。随后，聚合和剪切的循环反应将连续产生d*和c*。d*(激活链序列片段)与crRNA的识别区域互补，而c*也可以与模板-1结合，从而启动另一个链置换扩增。因此，产生了大量能够来解锁CRISPR/Cas12a***的反式切割的d*。当其加入到CRISPR/Cas12a体系后，CRISPR/Cas12a的反式切割被激活，不加区别地切割添加到体系中的单链报告DNA分子并最终产生荧光信号。

试验优化

实施例1

1)设置实验组和对照组，实验组和对照组分别包括6个样品。实验组中的每个样品：将2μL 10×NEB buffer 2.0(500mMNaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，10mM DTT，pH7.9@25℃)，2μL 10×CutSmart(500mM KAc，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)₂、1000μg/mLBSA，pH7.9@25℃)，1μL 1μM模板-1和相同浓度的HIV-1加入到12.5μLddH₂O中。将混合物在95℃加热5分钟，然后以0.1℃/S的速率冷却至25℃并保持20分钟；对照组中的样品未添加HIV-1，其它同实验组。

2)向步骤1)反应产物中继续添加0.5μL 10mM dNTPs，0.5μL 10U Klenow片段(3'-5'exo-)和0.5μL 10UNt.BbvCI。通过ddH₂O将最终体积调整为20μL。将实验组和对照组的反应混合物分别在37℃下孵育40min、60min、80min、100min、120min和140min，然后在95℃下加热5分钟以使酶失活，得到扩增产物。

3)将步骤2)的扩增产物中加入2μL 1μM LbCas12a，2μL 1μM CrRNA，10μL 10×NEB缓冲液2.1(500mMNaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂、1000μg/mLBSA，pH7.9@25℃)将2μL10μM单链报告分子添加到混合物中，并用ddH₂O将最终体积调整为100μL。在37℃下孵育25分钟后，通过在95℃下加热5分钟来终止混合物的反应。通过LS-55分光光度荧光计(P.E.USA)在495nm处激发***并在发射波长为556nm来记录反应混合物的荧光光谱。在测量过程中，用于激发和发射的狭缝分别设置为12nm和8nm，实验结果如图2B所示。

从图中可以看出，荧光信号的净差值ΔF(ΔF＝F-F0，F和F0分别代表实验组和对照组的荧光强度)，随着E-SDA孵育时间的增加，荧光信号ΔF强度也随之增加，但是当E-SDA孵育时间达到80min时，其值反而降低了。因此，E-SDA的最佳孵育时间为80min。

实施例2

CRISPR/Cas12a的剪切时间分别为10min、20min、30min、40min、50min和60min，其它实验步骤同实施例1，实验结果如图2A所示。

如图可以看出，随着CRISPR/Cas12a反应的剪切时间从5min上升到25min时，荧光信号的净差值ΔF(ΔF＝F-F0，F和F0分别代表实验组样品和对照样品的荧光强度)也随之增加，而当CRISPR/Cas 12a的剪切时间继续增加时，ΔF值变化不大。因此，选择25min作为CRISPR/Cas12a的最佳剪切时间。

实施例3

DNA聚合酶Klenow片段(3'-5'exo-)的浓度分别为0.05U/μL、0.1U/μL、0.15U/μL、0.2U/μL、0.25U/μL和0.3U/μL，其它实验步骤同实施例1，结果如图2C所示。

从图中可以看出，随着Klenow片段(3'-5'exo-)浓度升高，荧光信号ΔF的净差随之增加，当Klenow片段(3’-5’exo-)浓度达到0.25U/μL时，ΔF达到最大值，再提高Klenow片段(3'-5'exo-)的浓度，ΔF值变化不大。

实施例4

核酸内切酶Nt.BbvCI的浓度分别为0.05U/μL、0.10U/μL、0.15U/μL、0.2U/μL、0.25U/μL和0.30U/μL，其它实验步骤同实施例1，结果如图2D所示。

从图中可以看出，随着内切核酸酶Nt.BbvCI浓度升高，荧光信号ΔF的净差随之增加，当内切核酸酶Nt.BbvCI浓度达到0.25U/μL时，ΔF达到最大值，再提高Klenow片段(3'-5'exo-)的浓度，ΔF值变化不大。

实施例5灵敏度试验

1)将2μL 10×NEB buffer 2.0(500mM NaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，10mMDTT，pH 7.9@25℃)，2μL 10×CutSmart(500mM KAc，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)₂、1000μg/mLBSA，pH7.9@25℃)，1μL 1μM模板-1和不同浓度的HIV-1(100aM、1fM、10fM、500fM、5pM、50pM、5nM和50nM)加入到12.5μL ddH₂O中。将混合物在95℃加热5分钟，然后以0.1℃/S的速率冷却至25℃并保持20分钟。

2)向步骤1)反应产物中继续添加0.5μL 10mM dNTP，0.5μL 10U Klenow片段(3'-5'exo-)和0.5μL 10UNt.BbvCI。通过ddH₂O将最终体积调整为20μL。将反应混合物在37℃下孵育80分钟，然后在95℃下加热5分钟以使酶失活，得到扩增产物。

3)将步骤2)的扩增产物中加入2μL 1μM LbCas12a，2μL 1μM CrRNA，10μL 10×NEB缓冲液2.1(500mM NaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂、1000μg/mL BSA，pH7.9@25℃)将2μL 10μM单链报告分子添加到混合物中，并用ddH₂O将最终体积调整为100μL。在37℃下孵育25分钟后，通过在95℃下加热5分钟来终止混合物的反应。通过LS-55分光光度荧光计(P.E.USA)在495nm处激发***并在发射波长为556nm来记录反应混合物的荧光光谱。在测量过程中，用于激发和发射的狭缝分别设置为12nm和8nm，结果如图3A和3B所示。

从荧光光谱图中可以看出，随着HIV-1浓度的增加，***的荧光强度增加。556nm处的荧光强度随着HIV-1含量的增加而逐渐增加，这主要是因为存在的HIV-1越多，产生的d*(激活链序列片段)越多。从对应的拟合模拟曲线的数据分析表明，所构建的生物传感平台在100aM至5pM之间具有良好的线性拟合(R²＝0.99884)，拟合方程为Y₁＝56.04015lgX₁-94.65011。基于S/N＝3规则(信噪比)，检测极限计算为87.3aM。与许多其他已报道的传感器相比(表2)，该方法的检测限最低，并且这种多步扩增策略可在2.5小时内实现对序列特异性DNA的aM灵敏度。在这种生物传感平台中，与常规SDA相比，E-SDA具有较高的扩增效率，在存在靶标的情况下可以产生大量d*(激活链序列片段)。此外，产生的d*可以作为激活剂来解锁CRISPR/Cas12a***的反式切割活性，该***本身具有显著的信号放大能力。因此，多步扩增赋予了拟议的生物传感平台超灵敏检测目标的潜力。

表2将本发明与其他先前报道的方法(序列特异性DNA)进行比较

实施例6特异性实验

为了验证检测方法在检测特定序列DNA时具有出色的抗干扰能力，通过加入与触发序列不同的非特异性核酸序列，验证DNA检测***的特异性，所述非特异性核酸序列包括DEEV-1、Zikavirus和HIV-2分别如SEQ ID NO:6～8所示的核酸序列，不含有核酸序列的作为空白对照组。结果如图4A和4B所示。

从图中可以看出，实验组的荧光强度显着高于干扰组的荧光强度，而干扰组的荧光强度与空白组相当，可以忽略不计。这是由于其他干扰DNA不能与模板完全互补，因此无法触发E-SDA，因此***的荧光强度几乎消失了。表明本发明的DNA生物传感平台的检测***在检测序列特异性DNA(HIV-1)时具有良好的特异性。

实施例7实际应用

在优化的实验条件下，对掺有不同浓度的HIV-1(1fM，10fM和500fM)的正常人血清进行了加标实验，以研究所提出的生物传感平台可用于真实样品中HIV-1的检测。具体步骤同实施例5，结果如表3所示。

表3用生物传感器平台检测正常人血清中的HIV-1(n＝3)

从结果可以看出，本发明的检测***获得了令人满意的HIV-1检测回收率，其检测范围从91.25％到114.75％。用本方法测得的所有RSD均低于6.44％。表明本发明检测***为检测真实样品中的序列特异性DNA提供了可靠的平台。

二、一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的UDG活性检测

作用机理：如图5所示，首先，设计了在3'尾部附近具有尿嘧啶损伤的UDG引物，该引物前部分可以与模板-2杂交形成双链。在UDG的作用下，可以识别并去除UDG引物中脱氧核糖和尿嘧啶之间的N-糖苷键，以生成AP位点。同时，产生的AP位点可以被核酸内切酶IV剪切，导致UDG引物与模板-2完全互补。因此，由UDG和核酸内切酶IV处理的UDG引物可以充当引物，以诱导增强的链置换扩增的启动(E-SDA)，生成激活链序列片段以解锁CRISPR/Cas12a***的反式切割。激活的CRISPR/Cas12a***不加区分地切割添加到***中的单链报告分子，并最终产生荧光信号。

实施例8灵敏度实验

1)将1μL 1μM模板-2、1μL 1μM UDG引物，5μLddH₂O，1μL 10×UDG缓冲液(200MmTris-HCl，10mM EDTA，100mMNaCl，pH8.2@25℃)，1μL 10×核酸内切酶IV缓冲液(500MmTris-acetate，500mM KCl，10mM EDTA，0.5％(v/v)Triton X-100，pH 7.5)加入到200μL离心管中。混匀后将混合物在95℃下加热5分钟，然后以0.1℃/S的速率冷却至25℃并保持20分钟。

2)将步骤1)的反应体系中加入不同浓度的UDG(0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.01、0.1和1U/mL)和0.5μL 10U核酸内切酶IV，并在37℃下孵育1h，充分修复UDG引物。

3)将步骤2)反应产物中加入2μL 10×NEB缓冲液2.0(500mMNaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂、10mM DTT，pH7.9@25℃)，2μL10×CutSmart(500mM KAc，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)2、1000μg/mLBSA，pH7.9@25℃)，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL10U Klenow片段(3'-5'exo-)和0.5μL 10UNt.BbvCI加入到混合物中，在37℃下诱导增强的链置换扩增(E-SDA)80min，得到扩增产物。

4)将步骤3)得到扩增产物中加入2μL 1μM LbCas12a，2μL 1μM CrRNA，10μL 10×NEB缓冲液2.1(500mM NaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂、1000μg/mL BSA，pH将7.9@25℃)和2μL 10μM单链报告DNA分子添加到混合物中，并通过ddH₂O将最终体积调整为100μL。然后将混合物在37℃下温育25min，并通过在95℃下加热5min而终止。通过LS-55分光光度荧光计(P.E.USA)在495nm处激发***并在发射波长为556nm来记录反应混合物的荧光光谱。在测量过程中，用于激发和发射的狭缝分别设置为12nm和8nm，结果如图6A和图6B所示。

从图中的荧光光谱图中可以看出，随着UDG酶量的增加，***在556nm处的荧光强度逐渐增加。这是因为仅在存在UDG的情况下，才能识别和除去UDG引物中脱氧核糖和尿嘧啶之间的N-糖苷键，以生成AP位点。加入外切核酸酶IV后，UDG引物在其AP位点被完全剪切。因此，经过处理后的UDG引物可以充当引物来诱导E-SDA的引发，从而产生大量的d*(激活链序列片段)。然后产生的d*充当激活剂以解锁CRISPR/Cas12a***的反式切割。因此，***的荧光强度与UDG活性成正比。从对应的拟合模拟数据可以看出，荧光强度与UDG浓度的对数从5.0×10^-5到0.1U/mL可以得到良好的线性关系(R²＝0.99609)，其对应的回归方程为Y₂＝97.36126lgX₂+454.10471。根据S/N＝3的规则，检测限(LOD)估计为3.1×10^-5U/mL，这是我们所知最低的值(表4)。

表4将本发明与其他先前报道的方法(UDG活性)进行比较

实施例9特异性实验

为了验证本发明检测***在检测UDG活性时具有出色的抗干扰能力，在实验过程中，目标UDG被其它等浓度的干扰酶代替进行比较研究，其它步骤过程同UDG分析相同(实施例8)。所述干扰酶包括hoGG 1，hAGG和BSA，结果如图7A和7B所示。

从图中可以看出，实验组的荧光强度显著高于干扰组的荧光强度，且干扰组的荧光强度与空白组相当，其荧光增量可以忽略不计，这表明基于E-SDA与CRISPR/Cas12a偶联的用于检测UDG活性的拟议检测方法具有很高的选择性和特异性。

三、一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增在UDG抑制剂筛选中的应用

为了证实所提出的检测方法可用于UDG抑制剂的筛选以及对UDG及其抑制剂之间相互作用的进一步研究，进行了UDG抑制试验。UDG可与化学计量比为1：1M的UGI整合，形成紧密且不可逆的复合物，从而抑制UDG酶活性。

1)将1μL 1μM模板-2、1μL 1μM UDG引物，5μLddH₂O，1μL 10×UDG缓冲液(200MmTris-HCl，10mM EDTA，100mMNaCl，pH8.2@25℃)，1μL 10×核酸内切酶IV缓冲液(500MmTris-acetate，500mM KCl，10mM EDTA，0.5％(v/v)Triton X-100，pH 7.5)加入到200μL离心管中。混匀后将混合物在95℃下加热5分钟，然后以0.1℃/S的速率冷却至25℃并保持20分钟。

2)将步骤1)的反应体系中加入不同浓度的UGI、相同浓度的UDG(0.1U/mL)和0.5μL10U核酸内切酶IV，并在37℃下孵育1h，充分修复UDG引物。

3)将步骤2)反应产物中加入2μL 10×NEB缓冲液2.0(500mMNaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂、10mM DTT，pH7.9@25℃)，2μL10×CutSmart(500mM KAc，200mM Tris-Ac，100mM Mg(Ac)2、1000μg/mLBSA，pH7.9@25℃)，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL10U Klenow片段(3'-5'exo-)和0.5μL 10UNt.BbvCI加入到混合物中，在37℃下诱导增强的链置换扩增(E-SDA)80min，得到扩增产物。

4)将步骤3)得到扩增产物中加入2μL 1μM LbCas12a，2μL 1μM CrRNA，10μL 10×NEB缓冲液2.1(500mM NaCl，100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂、1000μg/mL BSA，pH将7.9@25℃)和2μL 10μM单链报告DNA分子添加到混合物中，并通过ddH₂O将最终体积调整为100μL。然后将混合物在37℃下温育25min，并通过在95℃下加热5min而终止。通过LS-55分光光度荧光计(P.E.USA)在495nm处激发***并在发射波长为556nm来记录反应混合物的荧光光谱。在测量过程中，用于激发和发射的狭缝分别设置为12nm和8nm，结果如图8A和图8B所示。

从图中可以看出，随着UGI浓度的增加，荧光强度迅速降低。抑制剂的抑制效率可以表示为半数最大抑制浓度(IC₅₀)，其代表酶活性降低50％所需的抑制剂浓度。图8B证明了UGI对UDG的抑制是剂量依赖性的，并且其对UGI的IC₅₀估计为0.079U/mL。这些结果说明本发明所提出的检测***可用于UDG抑制剂的筛选以及UDG与其抑制剂之间相互作用的进一步研究。

四、实际应用使用本发明的检测***来检测HeLa裂解物中UDG活性

用细胞裂解液溶解HeLa裂解物得到HeLa细胞裂解液；向HeLa细胞裂解液中加入UDG的抑制剂UGI得到HeLa+UGI；细胞裂解液作为阴性对照。分别将上述三种溶液作为待检测进行UDG活性检测，实验步骤同实施例8，结果如图9所示。

从图中可以看出，与阴性对照相比，HeLa细胞裂解液的荧光强度明显较高，说明HeLa细胞裂解液具有较高的UDG活性，但向HeLa细胞裂解液加入了UGI后，HeLa+UGI的荧光强度下降明显，与阴性对照的荧光强度差异不大，说明加入UGI后HeLa细胞裂解液中的UDG被抑制了。表明本发明所提出的检测方法具有重要的实用价值。

综上，该平台将CRISPR/Cas12a***与增强的链置换扩增(E-SDA)结合使用，可以超灵敏地检测序列特异性DNA(例如HIV-1)或UDG活性。在最佳实验条件下，提出的的检测方法对HIV-1表现出从100aM到5pM的良好线性(R²＝0.99884)，检测限(LOD)估计为87.3aM。正常人血清中的加标实验表明，建立的检测方法在检测特定序列DNA方面具有极其重要的实用价值。此外，我们用该检测方法对UDG活性进行检测，检测结果以良好的拟合系数(R²＝0.99609)实现了从5.0×10^-5U/mL到0.1U/mL的UDG活性检测。其的检出限(LOD)为3.1×10^{- 5}U/mL，这是我们所知最低的。UDG抑制试验表明，所提出的生物传感平台可用于UDG抑制剂的筛选以及对UDG及其抑制剂之间相互作用的进一步研究。并且其在HeLa裂解物中对UDG活性的检测证明了所提出的生物传感平台可用于实际样品中UDG活性的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学；

<120> 一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcagcacctt cctccgcaat actatctaca cttagtagaa attaccctat agtgagtcgt 60

attaatttc 69

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acctggggga gtattgcgga ggaaggtgct gaggatagtg agtgctgagg ccaaggccca 60

gccctcacac a 71

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acctggggga gtattgcgga ggaaggtgct gaggtcagtg agtgctgagg gatcctttgg 60

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaaaggatu aaaat 15

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtgtgaggg ctgggccttg g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggaagctgt atcctggtgg taagg 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctaaaacgc ggagtagccc gt 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actgctagag attttccact a 21

Claims (10)

1.一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***，其特征在于，包括模板、LbaCas12a、crRNA、报告单链DNA分子、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI；所述模板与待检测序列碱基互补，并合成与所述模板互补的双链DNA，所形成的双链DNA包含两个核酸内切酶Nt.BbvCI识别位点，所述双链DNA经剪切和聚合置换得到激活链序列片段；所述crRNA包括固定序列和识别序列，所述固定序列与LbaCas12a特异性识别，所述识别序列与所述激活链序列片段互补；所述crRNA引导LbaCas12a与激活链序列片段结合，激活LbaCas12a的反式切割活性，从而切割报告单链DNA分子，产生荧光。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***，其特征在于，还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、缓冲液、稀释剂、镁离子、锰离子或辅助因子。

3.一种如权利要求1或2所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***在特定序列DNA的检测、UDG活性抑制剂的筛选或UDG活性生物样品的检测方面的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI存在下，引发增强型链置换扩增产生激活链序列片段；

（2）将步骤（1）得到的激活链序列片段与crRNA识别区域互补配对激活CRISPR/Cas12a体系反式切割活性；

（3）步骤（2）中被激活的CRISPR/Cas12a体系切割加入到体系中的报告单链DNA分子，检测所述体系中的荧光强度即可。

5.一种如权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***在HIV-1检测的方法，其特征在于，该方法用于非诊断或治疗目的，包括以下步骤：

S1：针对LbaCas12a序列和激活链序列片段，设计识别区域特异性的crRNA序列，所述crRNA序列如SEQ ID NO：1所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

S2：合成模板-1，所述模板-1序列如SEQ ID NO：2所示，所述模板-1能与待检测的HIV-1序列互补，合成双链DNA；

S3：将步骤S2合成的模板-1、不同浓度的HIV-1、dNTPs、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于37℃下进行链置换扩增反应，反应结束，然后高温使酶失活，得到扩增产物；

S4：取步骤S3得到的扩增产物，加入一定浓度的报告单链DNA分子、LbaCas12a和步骤S1所述的crRNA分子，以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于在37℃下进行剪切反应，反应一段时间后终止反应，读取荧光检测信号；

S5：根据不同浓度HIV-1的标准溶液做HIV-1浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中HIV-1的浓度。

6.一种如权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测***在UDG活性检测的方法，其特征在于，该方法用于非诊断或治疗目的，包括以下步骤：

1）针对LbaCas12a序列和激活链序列片段，设计识别区域特异性的crRNA序列，所述crRNA序列如SEQ ID NO：1所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

2）合成模板-2序列和UDG引物，所述模板-2序列如SEQ ID NO：3所示，所述UDG引物序列如SEQ ID NO：4所示；所述UDG引物在其3’端修饰有尿嘧啶，待检测物UDG酶能够识别并将UDG引物链中的尿嘧啶处理成为AP位点，所述AP位点又能够被核酸内切酶IV剪切，得到预处理后的UDG引物；所述的模板-2能与预处理后的UDG引物碱基互补合成双链DNA；

3）将步骤2）合成的模板-2和UDG引物以及不同浓度的UDG酶和核酸内切酶IV混合，并置于37℃下恒温反应40~80 min；

4）将步骤3）得到的反应溶液加入dNTPs、DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于37℃下进行链置换扩增反应，反应结束，然后高温使酶失活，得到扩增产物；

5）取步骤4）得到的扩增产物，加入报告单链DNA分子、LbaCas12a和步骤(1)所述的crRNA分子中，以适当比例混合于缓冲溶液中得到反应体系，并置于在37℃下进行剪切反应，反应一段时间后终止反应，读取荧光检测信号；

6）根据不同浓度UDG酶的标准溶液做UDG酶的活性-荧光强度的标准曲线，计算回归方程；再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中UDG酶的活性。

7.根据权利要求5或6所述检测方法，其特征在于，所述链置换扩增反应时间为60~100min，所述剪切反应时间为15~35 min。

8.根据权利要求5或6所述检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶和核酸内切酶Nt.BbvCI在反应体系中的浓度独立选自0.15~0.35 U/μL。

9.根据权利要求5或6所述检测方法，其特征在于，所述报告单链DNA分子的两端分别带有HEX和BHQ1基团的7碱基单链DNA分子，序列如下所示：HEX-NNNNNNN-BHQ1。

10.根据权利要求5或6所述检测方法，其特征在于，所述荧光检测是在波长496 nm处激发荧光，在波长556 nm处检测荧光强度。

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