CN111575353A - 一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本专利公开了一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，涉及生物传感领域。通过设计结构可切换的哑铃型探针，提高了目标识别的特异性，同时又使得滚环扩增产物具有串联重复茎环结构的特点；滚环扩增产物与修饰DNA‑AuNPs杂交形成DNA网状结构，使得AuNPs发生聚集，利用动态光散射技术对AuNPs尺寸进行测量，从而实现miRNA的检测。本发明灵敏度高、特异性好。

Description

一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法
技术领域
本发明涉及动态光散射技术检测领域，更具体地说是一种以核酸滚环扩增技术为基础构建DNA网状结构，诱导纳米粒子由单分散到聚集状态，利用动态光散射技术检测纳米粒子粒径，进而实现检测miRNA的方法。
背景技术
MicroRNA（miRNA）目前是一个十分活跃的研究领域，它对于深入探讨生命现象的本质、解释细胞行为和疾病发生机制、以及疾病诊断、基因治疗药物的开发都具有重大意义。miRNA广泛存在于各种动、植物中，参与多种重要的生命活动。它作为基因调控的重要调控因子，在许多生物学过程中发挥着重要作用，但它的调控范围并不仅限于正常的生理活动，还与许多肿瘤、癌症的发生有着密切的联系。
MiRNA被视为一种新型的生物标志物和各种疾病的潜在治疗靶标。它的广泛存在与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。MiRNA无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，因此miRNA的检测成为当前研究的热点和前沿。然而，由于miRNA固有的易降解和低丰度的特点，使得难以高灵敏的检测miRNA。
为了解决miRNA在低浓度下也能被检测的问题，miRNA的识别和信号放大检测策略变得尤为重要。然而，目前常见的miRNA检测方法，例如荧光比色法、荧光法、化学发光法等光学检测方法灵敏度不高且易受光稳定性和复杂生物样品的影响。因此发展一种既稳定又能高灵敏的检测miRNA的方法具有重要意义。本实验试图开发一种灵敏稳定的方法，设计结构可切换的哑铃型探针，利用滚环扩增技术构建DNA网状结构，利用稳定的动态光散射技术实现miRNA的高灵敏检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是通过滚环扩增技术构建DNA网状结构实现miRNA的高灵敏检测。
一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）探针设计
根据目标链序列设计相应的挂锁探针PP、修饰金纳米粒子（AuNPs）的DNA序列；其中，哑铃型挂锁探针PP序列的5端修饰了磷酸基团，修饰AuNPs的DNA序列的3端修饰了巯基（C6-SH）；
（2）哑铃型挂锁探针PP的连接
哑铃型挂锁探针PP的连接反应在10 μL溶液体积中进行，其中包10 μM挂锁探针PP，2 μL 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，1 μM目标miRNA，20 U/μL T4 DNA连接酶和5 μL的DEPC处理水，加入T4 DNA连接酶之前，将反应混合物在55°C下加热5分钟，然后在39°C退火30分钟，冷却至室温，然后加入T4 DNA连接酶，在16°C下进行连接反应2小时；
（3）滚环扩增反应
向（2）步骤中得到的溶液中加入2.5 μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，0.5 μLBSA，3 μL浓度为25 mM的dNTPs，1 μL的phi29 DNA聚合酶和8 μL的DEPC处理水；所得混合物在30°C下反应6小时，然后在65°C下孵育10分钟终止反应；
（4）动态光散射技术检测
向（3）步骤中得到的溶液中加入10 μL DNA-AuNPs，将混合液在37°C孵化30分钟；然后进行动态光散射测量，实验参数如下：25 °C，平衡稳定时间10秒和测量角度90°。
本发明的有益效果
（1）探针的哑铃型结构使得滚环扩增产物具有串联重复茎环序列，与DNA-AuNPs杂交形成DNA网状结构，使得AuNPs发生聚集，尺寸变大；
（2）利用结构可切换的哑铃型探针特异性识别miRNA，启动滚环扩增反应，实现信号的放大；
（3）本发明所述方法灵敏度高、特异性好。
附图说明
图一为本文所述方法的实验原理图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）探针设计
根据目标链let-7a序列设计相应的挂锁探针PP、修饰AuNPs的DNA序列；其中，哑铃型挂锁探针PP序列的5端修饰了磷酸基团，修饰AuNPs的DNA序列的3端修饰了巯基；
（2）哑铃型挂锁探针PP的连接
哑铃型挂锁探针PP的连接反应在10 μL溶液体积中进行，其中包10 μM 挂锁探针PP，2μL 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，1 μM let-7a，20 U/μL T4 DNA连接酶和5 μL的DEPC处理水，加入T4 DNA连接酶之前，将反应混合物在55°C下加热5分钟，然后在39°C退火30分钟，冷却至室温，然后加入T4 DNA连接酶，在16°C下进行连接反应2小时；
（3）滚环扩增反应
向（2）步骤中得到的溶液中加入2.5 μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，0.5 μLBSA，3 μL浓度为25 mM的dNTPs，1 μL的phi29 DNA聚合酶和8 μL的DEPC处理水；所得混合物在30°C下反应6小时，然后在65°C下孵育10分钟终止反应；
（4）动态光散射技术检测
向（3）步骤中得到的溶液中加入10 μL DNA-AuNPs，将混合液在37°C孵化30分钟；然后进行动态光散射测量，实验参数如下：25 °C，平衡稳定时间10秒和测量角度90°。
实施例2
检测步骤同例1，不同之处是：步骤3中反应时间为2小时。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法
<130> 3
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctcattct tctctccctg aggtagtagg tcccccaact atacaaccta ct 52
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcttctctc cc 12
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ugagguagua gguuguauag uu 22

Claims (4)

1.一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）探针设计
根据目标链序列设计相应的哑铃型挂锁探针PP、修饰AuNPs的DNA序列；其中，哑铃型挂锁探针PP序列的5端修饰了磷酸基团，修饰AuNPs的DNA序列的3端修饰了巯基（C6-SH）；
（2）哑铃型挂锁探针PP的连接
哑铃型挂锁探针PP的连接反应在10 μL溶液体积中进行，其中包10 μM挂锁探针PP，2μL10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，1 μM let-7a，20 U/μL T4 DNA连接酶和5 μL的DEPC处理水，加入T4 DNA连接酶之前，将反应混合物在55°C下加热5分钟，然后在39°C退火30分钟，冷却至室温，然后加入T4 DNA连接酶，在16°C下进行连接反应2小时；
（3）滚环扩增反应
向（2）步骤中得到的溶液中加入2.5 μL 10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，0.5 μLBSA，3 μL浓度为25 mM的dNTPs，1 μL的phi29 DNA聚合酶和8 μL的DEPC处理水；所得混合物在30°C下反应6小时，然后在65°C下孵育10分钟终止反应；
（4）动态光散射技术检测
向（3）步骤中得到的溶液中加入10 μL DNA-AuNPs，将混合液在37°C孵化30分钟；然后进行动态光散射测量，实验参数如下：25 °C，平衡稳定时间10秒和测量角度90°。
2.根据权利要求1所述一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，具有串联茎环结构的滚环扩增产物与DNA-AuNPs杂交，形成DNA网状结构，使得AuNPs由分散到聚集，尺寸由小变大。
3.根据权利要求1所述一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，哑铃型的挂锁探针以自身为模板连接成为哑铃型的密封探针，只有目标miRNA存在时，通过链置换反应才能将密封探针从哑铃型活化成圆形，从而启动滚环扩增反应。
4.如权利要求1所述的一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法，其特征是步骤中哑铃型挂锁探针PP、修饰AuNPs的DNA序列，它们的核苷酸序列为序列清单中所述序列。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112903786A (zh) * 2021-03-03 2021-06-04 江苏师范大学 基于无酶级联循环信号放大的血清中循环miRNA的电化学检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342459A (zh) * 2018-04-25 2018-07-31 中山大学 一种基于金纳米颗粒的定量pcr检测方法
CN109811039A (zh) * 2019-03-18 2019-05-28 济南大学 一种基于连接环介导等温扩增法快速检测肿瘤相关microRNA的方法
CN110305939A (zh) * 2019-07-08 2019-10-08 济南大学 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342459A (zh) * 2018-04-25 2018-07-31 中山大学 一种基于金纳米颗粒的定量pcr检测方法
CN109811039A (zh) * 2019-03-18 2019-05-28 济南大学 一种基于连接环介导等温扩增法快速检测肿瘤相关microRNA的方法
CN110305939A (zh) * 2019-07-08 2019-10-08 济南大学 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GANGLIN WANG 等: "A versatile dynamic light scattering strategy for the sensitive detection of microRNAs based on plasmonic core-satellites nanoassembly coupled with strand displacement reaction", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
LI ZOU 等: "Sensitive DNA detection by polymerase chain reaction with gold nanoparticles", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *
RUIJIE DENG 等: "Toehold-initiated Rolling Circle Amplification for Visualizing Individual MicroRNAs In Situ in Single Cells", 《ANGEW. CHEM. INT. ED. 》 *
刘海云: "癌症相关MicroRNA检测及成像研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112903786A (zh) * 2021-03-03 2021-06-04 江苏师范大学 基于无酶级联循环信号放大的血清中循环miRNA的电化学检测方法
CN112903786B (zh) * 2021-03-03 2023-01-13 江苏师范大学 基于无酶级联循环信号放大的血清中循环miRNA的电化学检测方法

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