CN116024313A - 一种可编程式核酸分子检测方法及平台 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可编程式核酸分子检测方法及平台。本发明一些实例的编程式核酸分子检测平台通过三重信号扩增元件RCA‑Cas12a‑HCR大幅度提升微弱的初始信号，有效提升检测平台的灵敏度。与传统的扩增元件相比，该三重扩增元件中的滚环扩增元件RCA可以通过更换滚环探针中的核酸分子识别区域，即可实现对多种不同类型的核酸分子的灵敏检测，同时采用Cas12a***为RCA与HCR的媒介，有效提升检测的特异性和鲁棒性。用于DNA检测时，通过现有技术将DNA转录为相应的RNA即可。利用适配体核酸分子可以特异性与靶分子结合的特性，使得结合靶分子的适配体引发RCA扩增，可进一步其他物质的灵敏分析，如：蛋白，药物，离子等。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种可编程式核酸分子检测方法及平台。
背景技术
光电化学(PEC)生物传感作为一种新兴技术引起了人们的广泛关注。与传统酶联免疫相比，光电化学采用“光信号激发，电信号接收”的独特信号分离模式，确保了检测的灵敏度和低背景干扰。此外，光电化学作为可一种可迁移式的生物检测技术，有利于开发微型化器件实现即时检测(POCT)。然而，传统的单信号光电化学传感平台已经不能满足人们对检测准确性的需求。因此，开发具有多模态信号传导的检测平台具有重要的现实意义。
microRNA(miRNA)是一种在动、植物中广泛存在的非编码短链核糖核酸，长度在18至25个核糖核苷酸之间，在细胞发育进程和生理代谢过程中起着关键作用。近年来，大量研究表明miRNA在肿瘤的发展、浸润、扩散和转移等过程中起着重要的调控作用。此外，miRNA还与植物、动物的分化发育过程有密切的关系。因此，监测植物、动物以及人体中各类型miRNA的含量，对于早期病变筛查、疾病发展进程和疾病预后诊断有重要的现实意义。由于miRNA丰度低、同源相似度高和不稳定的特点，现有的miRNA生物检测方法存在样品前处理复杂、操作繁琐、设备昂贵和检测灵敏度不高的问题，无法适应当前大量、复杂、种类多样化的检测需求。所以，迫切要建立一种快速、准确、低成本、可编程式的检测方法用于不同类型miRNA的灵敏检测。
滚环扩增(RCA)是是借鉴病原生物体的滚环复制方式而提出的，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在DNA聚合酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段，不仅能直接扩增特定的DNA、RNA分子，而且能实现这些靶核酸的信号放大。滚环扩增技术在核酸测序、单核苷酸多态性基因分型及细胞原位检测分析、DNA芯片、蛋白质芯片分析等方面都有广泛的应用前景。
CRISPR***是一种发现于古生菌、细菌和真菌中的适应性免疫***，用于抵挡外界核酸的侵染。自1987年发现以来，CRISPR***已经在基因编辑、基因治疗和代谢调控等领域被广泛应用。近年来CRISPR/Cas12a***由于其独特的反式切割(trans-cleavage)性能引起了分析检测领域的广泛关注。Cas12a***不仅能通过crRNA介导特异性识别并顺式切割(cis-cleavage)目标序列；还能激活其反式切割性能，任意切割单链DNA。因此，研究人员将Cas12a***与传统核酸扩增方法结合，利用Cas12a独特的性能提升生物传感器的特异性与灵敏度。
杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)是一种新型的信号扩增技术，它通过单链DNA(ssDNA)引发两种稳定的DNA发夹探针在恒温下发生杂交反应，从而放大检测信号，实现选择性检测靶分子的目的。
虽然现有技术中存在多种核酸序列的检测方法，但是均需要借助专业仪器才能实现定量分析，这些专业仪器往往体积较大、昂贵，使用不便，有待进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种可编程式核酸分子检测方法及平台。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种可编程式核酸分子检测平台，包括扩增元件、生物负载元件和信号转换元件，
所述扩增元件由滚环扩增***、CRISPR/Cas12a***和杂交链式反应***依次耦合而成，其中：
所述滚环扩增***用于对待测核酸分子进行扩增；
所述CRISPR/Cas12a***识别所述滚环扩增***的扩增产物，激活CRISPR/Cas12a***的反式切割性能，切割所述杂交链式反应***的触发探针TS，得到降解产物；
所述杂交链式反应***包括固定在所述生物负载元件的发夹探针H1、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1，发夹探针H1和发夹探针H2在未切割的触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，得杂交链式反应HCR产物；
所述HCR产物负载的生物酶与第一信号元件耦合发生第一级联反应，与第二信号元件耦合发生第二级联反应，利用第一级联反应和第二级联反应的产物实现光电化学检测和比色检测。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述生物负载元件为CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料的制备方法包括以下步骤：
先合成分支氧化锌纳米棒阵列B-ZnO NRs，在分支氧化锌纳米棒阵列B-ZnO NRs上负载硫化镉/硫化银CdS/Ag2S层，制备得CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述生物酶为葡萄糖氧化酶。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述第一信号转换元件为纳米金，其可与葡萄糖氧化酶构成第一级联反应，并与底物反应，实现光电化学检测；和/或所述第二信号转换元件为铁基材料，其可与葡萄糖氧化酶构成第二级联反应，并与底物反应，实现比色检测。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述纳米金为β-环糊精修饰的纳米金；和/或所述铁基材料为NH2-MIL-88B(Fe)的铁基有机框架材料。
本发明的第二个方面，提供：
一种可编程式核酸分子检测方法，包括如下步骤：
使用滚环扩增***对待测核酸分子样本进行扩增，得扩增产物；
使用CRISPR/Cas12a***识别所述扩增产物，激活CRISPR/Cas12a反式切割性能，切割触发探针TS，得到降解产物；
将降解产物、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1与固定有发夹探针H1的生物负载元件混合，其中，发夹探针H1和发夹探针H2在未切割的触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，得杂交链式反应HCR产物；
基于所述HCR产物的生物酶和第一信号转换元件耦合的第一级联反应，实现目的核酸分子的定量；
基于所述HCR产物的生物酶与第二信号转换元件耦合的第二级联反应，实现目的核酸分子的定量。
在一些可编程式核酸分子检测方法的实例中，所述生物负载元件为CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。所述生物酶为葡萄糖氧化酶，其可与纳米金耦合成第一级联反应与底物反应，实现光电化学检测；和/或所述第二信号转换元件为铁基材料，其可与葡萄糖氧化酶耦合成第二级联反应与底物反应，实现比色检测。
在一些可编程式核酸分子检测方法的实例中，所述纳米金为β-环糊精修饰的纳米金；和/或所述铁基材料为NH2-MIL-88B(Fe)的铁基有机框架材料。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的编程式核酸分子检测平台通过三重信号扩增元件RCA-Cas12a-HCR大幅度提升微弱的初始信号，有效提升检测平台的灵敏度。与传统的扩增元件相比，该三重扩增元件中的滚环扩增元件RCA可以通过更换滚环探针中的核酸分子识别区域，即可实现对多种不同类型的核酸分子的灵敏检测，同时采用Cas12a***为RCA与HCR的媒介，有效提升检测的特异性和鲁棒性。该检测平台既可用于DNA的检测，也可以用于RNA的检测直接将RNA替换为DNA即可。
本发明一些实例的编程式核酸分子检测平台采用葡萄糖氧化酶GOx与β-环糊精修饰的纳米金β-CD@AuNPs形成的内部级联反应和葡萄糖氧化酶GOx与铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)形成外部级联反应，构建光电化学检测和比色检测耦合的双模态传感。这种基于双信号读出的检测平台，两种信号采用不同的转换机制和信号传输模式。与传统的单信号相比，双模态检测平台能得到更加准确可靠的检测结果。除此之外，该检测平台引入了比色检测模式，使读出更为直观和便捷。
本发明编程式核酸分子检测平台具有良好的拓展应用前景，不仅可以利用其可编程性能实现对不同类型的核酸分子的检测，还可以通过结合适配体核酸分子拓展到其他物质的灵敏分析，如：蛋白，药物，离子等。
附图说明
图1为三重信号扩增元件可编程式检测核酸分子的原理图。
图2为CdS/Ag2S/B-ZnO NRs扫描电镜图。A：放大倍数：20000x，B放大倍数：80000x。
图3为光电性能响应曲线。a：B-ZnO NRs，b:CdS/B-ZnO NRs，c:Ag2S/B-ZnO NRs，d:CdS/Ag2S/B-ZnO NRs。
图4为三重扩增元件RCA-Cas12a-HCR的可行性分析。A:RCA反应，B:Cas12a切割，C：HCR反应。
图5为级联反应的可行分析。A：葡萄糖氧化酶GOx与环糊精修饰的纳米金β-CD@AuNPs形成的内部级联反应，B：和葡萄糖氧化酶GOx与铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)形成外部级联反应。
具体实施方式
本发明的第一个方面，提供：
一种可编程式核酸分子检测平台，包括扩增元件、生物负载元件和信号转换元件，
所述扩增元件由滚环扩增***、CRISPR/Cas12a***和杂交链式反应***依次耦合而成，其中：
所述滚环扩增***用于对待测核酸分子样本进行扩增；
所述CRISPR/Cas12a***识别所述滚环扩增***的扩增产物，激活CRISPR/Cas12a***的反式切割性能，切割所述杂交链式反应***的触发探针TS，得到降解产物；
所述杂交链式反应***包括固定在所述生物负载元件的发夹探针H1、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1，发夹探针H1和发夹探针H2在未切割的触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，得杂交链式反应HCR产物；
所述HCR产物负载的生物酶，与第一信号元件耦合发生第一级联反应，与第二信号元件耦合发生第二级联反应，利用第一级联反应和第二级联反应的产物实现光电化学检测和比色检测。
检测平台的工作原理如图1所示，示例如下：
滚环扩增***对待测核酸分子样本进行扩增，得扩增产物；
使用CRISPR/Cas12a***识别所述扩增产物，激活CRISPR/Cas12a反式切割性能，切割触发探针TS，得到降解产物；
将降解产物、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1与固定有发夹探针H1的生物负载元件混合，其中，发夹探针H1和发夹探针H2在所述触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，即杂交链式反应HCR，最终得到固定在生物负载元件上HCR产物；
引入第二信号转换元件实现多模态信号输出；
基于所述HCR产物负载的生物酶和第一信号转换元件耦合的第一级联反应，实现目的核酸分子的定量。
基于所述引入的第二信号转换元件，信号启动元件与第二信号转换元件耦合的第二级联反应，实现目的核酸分子的定量。
当待测样本中存在目标核酸分子时，会产生相应的扩增产物并激活CRISPR/Cas12a***对触发探针TS进行切割。TS的被切割程度会影响HCR的组装程度，而葡萄糖氧化酶和纳米金是在HCR的产物上的，因此会通过级联反应产生不可溶性生物沉淀，该沉淀会影响光电材料的光吸收性能。因此生物沉淀的产生会导致光电流的降低。随着核酸分子的含量升高，被激活反式切割性能的Cas12a更多，导致TS的降解程度上升，进而导致HCR的组装程度低。最终，通过级联反应产生的沉淀少，光电流高。因此，目标核酸分子浓度越高，光电流的强度与核酸分子浓度呈现正相关。对于比色信号来说，利用HCR产物上的葡萄糖氧化酶和铁基材料(另外引入)耦合的级联反应实现的。同理，当目标核酸分子含量越高，HCR的产物组装程度越低，负载在HCR产物上的葡萄糖氧化酶就越少，导致比色信号越弱。因此，目标核酸分子浓度越高，比色信号与核酸分子的浓度呈现负相关。通过光电化学和比色检测的耦合，能进一步提升检测***的准确性和可靠性。
生物负载元件可以根据检测的信号不同而进行相应的选择。在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述生物负载元件为CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。这样有利于实现高精度的光电检测。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料的制备方法包括以下步骤：
先合成分支氧化锌纳米棒阵列B-ZnO NRs，在分支氧化锌纳米棒阵列B-ZnO NRs上依次负载硫化银层Ag2S和硫化镉层CdS，制备得CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。
生物酶的类型可以根据信号转换元件的性质进行相应的选择。在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述生物酶为葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶的底物易得，
信号转换元件可是常用的光、电等转化元件。在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述第一信号转换元件为纳米金，其可与葡萄糖氧化酶构成第一级联反应，并与底物反应，实现光电化学检测；和/或所述第二信号转换元件为铁基材料，其可与葡萄糖氧化酶构成第二级联反应，并与底物反应，实现比色检测。
在一些可编程式核酸分子检测平台的实例中，所述纳米金为β-环糊精修饰的纳米金；和/或所述铁基材料为NH2-MIL-88B(Fe)的铁基有机框架材料。
本发明的第二个方面，提供：
一种可编程式核酸分子检测方法，包括如下步骤：
使用滚环扩增***对待测核酸分子样本进行扩增，得扩增产物；
使用CRISPR/Cas12a***识别所述扩增产物，激活CRISPR/Cas12a反式切割性能，切割触发探针TS，得到降解产物；
将降解产物、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1与固定有发夹探针H1的生物负载元件混合，其中，发夹探针H1和发夹探针H2在未切割的触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，得杂交链式反应HCR产物；
基于所述HCR产物的生物酶和第一信号转换元件耦合的第一级联反应，实现目的核酸分子的定量；
基于所述HCR产物的生物酶与第二信号转换元件耦合的第二级联反应，实现目的核酸分子的定量。
在一些可编程式核酸分子检测方法的实例中，所述生物负载元件为CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。所述生物酶为葡萄糖氧化酶，其可与纳米金耦合成第一级联反应与底物反应，实现光电化学检测；和/或所述第二信号转换元件为铁基材料，其可与葡萄糖氧化酶耦合成第二级联反应与底物反应，实现比色检测。
在一些可编程式核酸分子检测方法的实例中，所述纳米金为β-环糊精修饰的纳米金；和/或所述铁基材料为NH2-MIL-88B(Fe)的铁基有机框架材料。
下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
本部分将详细描述本发明的具体实施例，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中设计的核酸序列如下：
实施例1
1.光电活性材料CdS/Ag2S/B-ZnO NRs的制备
将50mL纯水加入到烧杯中，在剧烈搅拌下加入0.15g硝酸锌和0.07g乌洛托品得到混合溶液，将混合溶液升温至80℃并保持低速搅拌得到电化学沉积前驱体；采用FTO导电玻璃为负载基底，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，使用电化学工作站中电流-时间模式在-1.3V初始电压下沉积40分钟得到B-ZnO NRs。将B-ZnO NRs浸入含有30mM硫代乙酰胺的水溶液中，置于90℃中2小时以形成硫化层；将硫化处理后的B-ZnO NRs浸入含有100mM硝酸银的溶液中，25℃反应30分钟得到Ag2S/B-ZnO NRs；将Ag2S/B-ZnO NRs浸入含有10mM硝酸镉和10mM硫代乙酰胺的混合液中，至于烘箱中75℃反应30分钟得到CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料。
2.发夹探针H1修饰的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs的制备
将CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料在25℃下浸入0.3M L-半胱氨酸盐酸盐溶液中90分钟，得到羧基化的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料；随后将羧基化的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs浸入10mg/mL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10mg/mL的N-羟基琥珀亚酰胺混合液中，37℃孵育1小时得到活化的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料；将30μL2μM的发夹探针H1溶液滴加到活化的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料上，37℃孵育1小时得到发夹探针H1修饰的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料，随后用5％的脱脂奶粉溶液封闭表面活性位点，用水清洗复合材料表面并于4℃保存待用。
图2为CdS/Ag2S/B-ZnO NRs扫描电镜图。A：放大倍数：20000x，B放大倍数：80000x。可光电活性材料CdS/Ag2S/B-ZnO NRs被成功制备且拥有明显的分支结构，有较大的比表面积，有利于生物分子的负载。
3.葡萄糖氧化酶修饰的探针GOx-H1的制备
将15μL浓度为10mM的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP加入到1毫升浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶GOx中，在25℃下搅拌3小时。随后采用30kD超滤管将活化后的葡萄糖氧化酶浓缩至10mg/mL，体积为200μL。然后，向上述溶液中加入200μL浓度为2μM经过退火处理的巯基修饰发夹探针H2，在25℃下孵育2小时，最后用30kD超滤管纯化GOx-H2探针。制备好的GOx-H2放置于4℃保存待用。
4.环糊精修饰的纳米金修饰的探针β-CD@AuNPs-H2的制备
将35mL纯水加入到双口烧瓶中升温至沸腾，依次加入5mL浓度为100mM的磷酸缓冲液(pH 7.4)、1mL浓度为10mM的氯金酸溶液和10mL浓度为10mM的β-环糊精溶液，反应40分钟得到酒红色溶液，随后8000转/分钟离心10分钟，得到沉淀物；将沉淀物重新分散到2mL纯水中，放置于4℃保存待用。采用EDC/NHS偶联法制备β-CD@AuNPs-H1。将1mg/mL的β-CD@AuNPs加入到10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10mg/mL的N-羟基琥珀亚酰胺混合液(EDC/NHS)中，37℃孵育2小时后6000转/分钟离心得到得到活化的β-CD@AuNPs并加入200μL纯净水复溶。随后，向上述溶液中加入200μL浓度为2μM经过退火处理的氨基化发夹探针H1(退火处理具体为将2μM的发夹探针溶液加热至95℃保温5分钟，随后以最大速率1℃/s快速降温到25℃并孵育2小时)在37℃下孵育2小时，随后加入20μL的6-巯基己醇MCH对表面剩余活性位点进行封闭。最后6000转/分钟离心分离，去除上清液后重悬至1mL纯水中，放置于4℃保存待用。
5.铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)的制备
将15mL纯水加入到烧杯中，强力搅拌下加入0.16g泊洛沙姆和0.18g硝酸铁，持续搅拌60分钟得到混合溶液A；随后向混合溶液A中加入150μL冰醋酸，持续强力搅拌得到混合溶液B；最后向混合溶液B中加入0.06g 2-氨基对苯二甲酸，轻微搅拌得到前驱体溶液；将前驱体溶液转移到50mL反应釜中，110℃反应16小时得到粗NH2-MIL-88B(Fe)，随后11000转/分钟离心15分钟，得到沉淀物，用水离心洗涤沉淀物三次得到纯化的NH2-MIL-88B(Fe)；将纯化后的NH2-MIL-88B(Fe)纳米酶分散到纯水中，放置于室温保存待用。
实施例2
1.对miR-21的捕获
将1nM的miR-21(SEQ ID NO.2)、1μM的PP-miR-21探针(SEQ ID NO.1)、1×T4DNALigase Buffer混合，置于95℃孵育10分钟，随后缓慢降至室温，完成退火捕获过程。
2.RCA反应
将40U T4DNA连接酶加入到捕获miRNA的退火产物中，25℃下孵育2小时。随后取出20μL上述产物加入到1×phi29 DNA polymerase Buffer、10U phi29 DNA聚合酶、3μL浓度为10mM的脱氧核糖核苷酸中，在30℃下孵育2小时，并在65℃下加热10分钟终止反应，得到miR-21触发产生的RCA产物。
3.Cas12a***激活
将5μL T7RNA聚合酶介导的体外转录得到的crRNA反应液(SEQ ID NO.4)、2UDNaseⅠ和1×DNaseⅠ反应缓冲液加入DEPC处理水中，总体积为100μL。反应液放置于37℃下孵育30分钟，再升温至80℃保持20分钟终止反应，经过去模板的crRNA放置于-20℃待用。
将2U Cas12a核酸酶、30nM crRNA混合并再25℃下孵育30分钟形成Cas12a/crRNA结构。随后，将30μL RCA产物加入Cas12a/crRNA复合物和杂交链式反应HCR的引物TS(SEQID NO.3)的溶液中，在37℃下孵育30分钟，得到切割溶液A；
4.HCR反应
将30μL切割溶液A滴加在CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料表面并在37℃下孵育1小时，随后用pH为7.4浓度为0.01M的磷酸-吐温缓冲液冲洗复合材料表面；然后将20μL探针溶液(具体组成为：10μL GOx-H1与10μLβ-CD@AuNPs-H2的混合溶液)滴加到电极表面并在37℃下孵育2小时完成HCR反应，随后用磷酸-吐温缓冲液对电极表面进行清洗并用氮气吹干表面。
5.对miR-21的检测
通过固定于杂交链式反应HCR产物上的葡萄糖氧化酶GOx介导的双级联反应实现双模信号输出；将反应后的CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料浸入350μL浓度为1.5mM的葡萄糖溶液中孵化反应，将最终的反应液分为两份，每份100μL，一份中加入200μL浓度为3mM的4-氯-1-萘酚4-CN溶液，与CdS/Ag2S/B-ZnO NRs复合材料在37℃下孵化20分钟，通过固定在杂交链式反应HCR产物上β-CD@AuNPs纳米酶对4-氯-1-萘酚进行氧化，产生不可溶生物沉淀BCP实现光电化学检测，另一份依次加入200μL浓度为0.2M的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，30μL浓度为30mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB，20μL浓度为2mg/mL的铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)，随后在25℃下孵育15分钟后观察溶液颜色变化并用紫外吸收光谱仪记录652nm处的峰强变化实现比色检测。
在光电化学检测端，CdS/Ag2S/B-ZnO NRs作为高性能光电复合材料，具有较大的比表面积，优良的电子传导性能和优异的光电转换效率，可以作为良好的光电化学基底材料提升检测***的鲁棒性。具体来说，硫化银Ag2S作为屏蔽层，能有效抑制硫化镉CdS层上光生电子和光生空穴的快速复合。当CdS/Ag2S/B-ZnO NRs被光照辐射后，硫化镉CdS层被光子激发产生光生电子和光生空穴，随后光生空穴会快速转移到硫化银Ag2S层实现光生电子和光生空穴的有效分离，进而提升CdS/Ag2S/B-ZnO NRs的光电流稳定性。同时，采用抗坏血酸AA为牺牲剂，有效避免CdS/Ag2S/B-ZnO NRs的光腐蚀，进一步提升基底稳定性。此外，更重要的是，在CdS/Ag2S/B-ZnO NRs上通过三重扩增反应形成的HCR产物，该产物由修饰了葡萄糖氧化酶的发夹探针GOx-H1和修饰了环糊精还原的纳米金的发夹探针β-CD@AuNPs-H2交替组装形成。在HCR产物中，葡萄糖氧化酶GOx和环糊精还原的纳米金β-CD@AuNPs形成了内部级联反应，催化4-氯-1-萘酚(4-CN)氧化为不可溶性生物沉淀BCP，该生物沉淀会沉积到电极材料表面，且这种沉积是不可逆转的。因此，通过内部级联反应催化产生BCP作用，光电流强度能随着HCR产物的组装程度的增加而成比例下降，从而构成光电化学信号随目标物浓度降低而降低的PEC检测。
图3为光电性能响应曲线。a：B-ZnO NRs，b:CdS/B-ZnO NRs，c:Ag2S/B-ZnO NRs，d:CdS/Ag2S/B-ZnO NRs。如图3所示，由于光生电子和空穴的快速复合，B-ZnO NRs(曲线a)表现出较低的光电流响应；当在ZnO表面沉积Ag2S层后，Ag2S/B-ZnO NRs光电流(曲线c)与纯B-ZnO NRs相比有所增强；最后在将CdS沉积到Ag2S/B-ZnO NRs后，光电流有进一步的增强(曲线d)；此外，CdS/Ag2S/B-ZnO NRs与没有Ag2S层的CdS/B-ZnO NRs(曲线b)相比，光电流有着显著的差异性，说明Ag2S层能有效的抑制光生电子-空穴的快速复合，提供稳定的光电流，提高了检测***的稳定性。
在比色检测端，采用HCR产物上的葡萄糖氧化酶GOx与铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)形成外部级联反应。由于NH2-MIL-88B(Fe)是一种过氧化氢敏感型过氧化物纳米酶，该纳米酶能利用葡萄糖氧化酶产生的过氧化氢H2O2实现对比色底物3,3’,5,5’,-四甲基联苯胺TMB的高效氧化。
基于三重扩增元件制备的编程式检测平台对miR-21进行双模态灵敏检测。在光电化学检测端，随着miR-21的增加，较少的HCR产物在CdS/Ag2S/B-ZnO NRs产生，说明只有少量的GOx-H1和β-CD@AuNPs-H2固定在基底上，通过内部级联反应产生较少的BCP，由此获得较高的光电化学信号响应。miR-21浓度在1fM-100nM范围内其浓度对数值与电流变化值(ΔI)呈现良好的线性关系，线性回归方程为：ΔI＝68.6+4.1[lgCmiR-21(mol·L-1)](其中ΔI是存在和不存在miR-21时的信号差值)。与此同时，比色检测端通过记录652nm处的吸光度强度实现。随着miR-21的减少，大量的GOx-H1通过HCR反应固定在电极基底上，随后通过GOx与NH2-MIL-88B(Fe)构成的外部级联反应催化TMB(无色)氧化为TMB+(蓝色)，产生显著的蓝色。蓝色随着miR-21浓度的减小而加深，652nm处吸光度变化值与miR-21浓度对数值在1fM-100nM范围内呈现良好的线性关系。线性回归方程为：ΔAbs.＝3.9+0.2[lgCmiR-21(mol·L-1)](其中ΔAbs.是不存在和存在miR-21时的信号差值)。
图4为三重扩增元件RCA-Cas12a-HCR的可行性分析。A:RCA反应，B:Cas12a切割，C：HCR反应。如图4A所示，随着microRNA浓度增加，在顶部的条带亮度逐渐增强(红色虚线框)，说明滚环扩增反应与microRNA浓度呈现出良好的对应关系；随后采用荧光实验对Cas12a的反式切割性能进行分析，只有的RCA产物存在的情况下，Cas12a的反式切割性能才能被激活，切割荧光探针产生明显的荧光信信号(图4B)；随着microRNA浓度上升，滚环扩增产物增多，进而导致Cas12a的反式切割性能被更好地激活，从而对更多的TS探针进行切割，减弱HCR产物的组装(图4C)。该图能有效的说明扩增元件被成功构建。
图5为级联反应的可行分析。A：葡萄糖氧化酶GOx与环糊精还原的纳米金β-CD@AuNPs形成的第一级联反应，B：和葡萄糖氧化酶GOx与铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)形成第二级联反应。只有在葡萄糖氧化酶GOx和环糊精修饰的纳米金β-CD@AuNPs同时存在的情况下，底物才会被氧化产生明显的紫外吸收变化，说明第一级联反应被成功构建(图5A)；葡萄糖氧化酶GOx产生的双氧水能激活铁基材料NH2-MIL-88B(Fe)的类过氧化物酶性能，进而对底物进行氧化，产生明显的颜色信号(图5B)。因此，该实验说明葡萄糖氧化酶GOx与环糊精还原的纳米金β-CD@AuNPs形成的第一级联反应和葡萄糖氧化酶GOx与铁基金属有机框架纳米酶NH2-MIL-88B(Fe)形成第二级联反应被成功构建。光电化学端和比色检测端都可以在1fM-100nM的线性范围内，实现对microRNA的定量检测。因此，该检测平台被成功构建并具有良好的适用性。
利用适配体核酸分子可以特异性与靶分子结合的特性，使得结合靶分子的适配体引发RCA扩增，可进一步其他物质的灵敏分析，如：蛋白，药物，离子等。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可编程式核酸分子检测平台，包括扩增元件、生物负载元件和信号转换元件，其特征在于，所述扩增元件由滚环扩增***、CRISPR/Cas12a***和杂交链式反应***依次耦合而成，其中：
所述滚环扩增***用于对待测核酸分子进行扩增；
所述CRISPR/Cas12a***识别所述滚环扩增***的扩增产物，激活CRISPR/Cas12a***的反式切割性能，切割所述杂交链式反应***的触发探针TS，得到降解产物；
所述杂交链式反应***包括固定在所述生物负载元件的发夹探针H1、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1，发夹探针H1和发夹探针H2在未切割的触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，得杂交链式反应HCR产物；
所述HCR产物负载的生物酶与第一信号元件耦合发生第一级联反应，与第二信号元件耦合发生第二级联反应，利用第一级联反应和第二级联反应的产物实现光电化学检测和比色检测。
2.根据权利要求1所述的可编程式核酸分子检测平台，其特征在于，所述生物负载元件为 CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。
3.根据权利要求2所述的可编程式核酸分子检测平台，其特征在于，所述CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料的制备方法包括以下步骤：
先合成分支氧化锌纳米棒阵列B-ZnO NRs，在分支氧化锌纳米棒阵列B-ZnO NRs上负载硫化镉/硫化银CdS/Ag2S层，制备得CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。
4.根据权利要求1所述的可编程式核酸分子检测平台，其特征在于，所述生物酶为葡萄糖氧化酶。
5.根据权利要求4所述的可编程式核酸分子检测平台，其特征在于，所述第一信号转换元件为纳米金，其可与葡萄糖氧化酶构成第一级联反应，并与底物反应，实现光电化学检测；和/或
所述第二信号转换元件为铁基材料，其可与葡萄糖氧化酶构成第二级联反应，并与底物反应，实现比色检测。
6.根据权利要求5所述的可编程式核酸分子检测平台，其特征在于，所述纳米金为β-环糊精修饰的纳米金；和/或
所述铁基材料为NH2-MIL-88B (Fe)的铁基有机框架材料。
7.一种可编程式核酸分子检测方法，包括如下步骤：
使用滚环扩增***对待测核酸分子样本进行扩增，得扩增产物；
使用CRISPR/Cas12a***识别所述扩增产物，激活CRISPR/Cas12a反式切割性能，切割触发探针TS，得到降解产物；
将降解产物、第一信号转换元件修饰的游离发夹探针H2、生物酶修饰的游离发夹探针H1与固定有发夹探针H1的生物负载元件混合，其中，发夹探针H1和发夹探针H2在未切割的触发探针TS启动下可交替开环，自组装形成重复线性双链DNA结构，得杂交链式反应HCR产物；
基于所述HCR产物的生物酶和第一信号转换元件耦合的第一级联反应，实现目的核酸分子的定量；
基于所述HCR产物的生物酶与第二信号转换元件耦合的第二级联反应，实现目的核酸分子的定量。
8.根据权利要求7所述的可编程式核酸分子检测方法，其特征在于，所述生物负载元件为 CdS/Ag2S/B-ZnO NRs光电复合材料。
9.根据权利要求7所述的可编程式核酸分子检测方法，其特征在于，所述生物酶为葡萄糖氧化酶，其可与纳米金耦合成第一级联反应与底物反应，实现光电化学检测；和/或所述第二信号转换元件为铁基材料，其可与葡萄糖氧化酶耦合成第二级联反应与底物反应，实现比色检测。
10.根据权利要求9所述的可编程式核酸分子检测方法，其特征在于，所述纳米金为β-环糊精修饰的纳米金；和/或
所述铁基材料为NH2-MIL-88B (Fe)的铁基有机框架材料。
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