CN110004214B - 一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法 - Google Patents

一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双重DNA机器检测microRNA‑21的方法。所述方法包括：在microRNA‑21存在的情况下，采用T4连接酶将5’端磷酸化处理的锁式探针连接形成环状DNA模板；并在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的同时作用下引发环状DNA机器运转，得到单链产物；使所述单链产物与回文发夹探针杂交，得到杂交双链，并实现双向DNA机器的循环链置换扩增，得到扩增产物；对反应体系中扩增产物的荧光信号进行检测，获得microRNA‑21的浓度。本发明具有很高的miRNA‑21检测灵敏度，检测限为10fM，而且具有良好的特异性，是一种通用的核酸检测平台。

Description

一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法
技术领域
本发明属于生命健康领域，涉及肿瘤标志物microRNA-21的检测方法，具体涉及一种基于RCA的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的双重DNA机器检测microRNA-21的荧光检测方法。
背景技术
microRNA是一类短而小但在生物体内发挥重要作用的内源性非编码RNA，与基因调控、细胞***和凋亡等各种生物过程息息相关。研究表明，许多疾病的发生都伴随着microRNA表达种类或含量的改变，这种改变在癌症中表现的尤为明显。因此，microRNA被认为是癌症检测的新型标志物，建立灵敏、可靠、有效和准确的microRNA检测方法对于癌症早期诊断、治疗和癌症机理研究等多种领域有着极为重要的研究及现实意义。目前的常规检测方法如逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量逆转录酶-聚合酶链反应（qRT-PCR）、分子印迹和微阵列分析等技术由于成本较高、操作繁琐、过程复杂且灵敏度低、特异性差等，很难满足超微量microRNA的临床检测要求。因此，开发操作简单、成本低、检测性能好等优良性质的microRNA检测新方法与新技术具有十足的必要性。
发明内容
为解决microRNA检测的操作复杂性、检测限灵敏度不够高等问题，本发明建立了一种基于滚环扩增（RCA）的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的双重DNA机器检测microRNA-21的荧光检测方法。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法，其包括：
在microRNA-21存在的情况下，采用T4连接酶将5’端磷酸化处理的锁式探针连接形成环状DNA模板；并在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的同时作用下引发环状DNA机器运转，得到单链产物；
使所述单链产物与回文发夹探针杂交，得到杂交双链，且使杂交双链中回文发夹探针的3’端进行分子间互补配对，在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶作用下实现双向DNA机器的循环链置换扩增，得到扩增产物；
对反应体系中扩增产物的荧光信号进行检测，获得microRNA-21的浓度。
在一些实施例中，所述方法具体包括：
（1）将T4连接酶缓冲液、5’端磷酸化处理的锁式探针、microRNA-21和去离子水均匀混合，使所得混合物于90～95℃加热2～5 min，冷却至室温，再加入5～10 U T4连接酶，之后使所得第一反应体系于16～25℃反应30～60 min，形成环状DNA模板；
（2）使包含步骤（1）所获第一反应体系、1-2 μL DNA聚合酶缓冲液、1～2 μL回文发夹探针、1～2 μL dNTPs、3～5 μL DNA聚合酶和5～10 U 限制性核酸内切酶的第二反应体系于30～37℃孵育反应1～2.5 h，得到扩增产物；
（3）根据步骤（1）和（2），对一系列不同浓度microRNA-21标准溶液进行定量检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，获得microRNA-21浓度-荧光强度值标准曲线；
（4）根据步骤（1）和（2），对含有microRNA-21的待测生物样品进行检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测生物样品中microRNA-21的浓度。
本发明实施例还提供了一种产品，应用于前述的双重DNA机器检测microRNA-21的方法，所述的产品包括锁式探针和回文发夹探针，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述回文发夹探针的序列如SEQ ID NO: 2所示。
与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：
1）与现有的荧光检测方法相比，本发明提供的双重DNA机器检测microRNA-21的方法具有很高的miRNA-21检测灵敏度，检测限为10 fM，线性范围广（10 fM~ 50 nM）；
2）本发明的双重DNA机器检测microRNA-21的方法背景信号低，目标信号强，所得信噪比高（S/N= 24），远超出现有荧光检测方法；
3）本发明的双重DNA机器检测microRNA-21的方法具有良好的特异性，可以较易区分完全互补的目标RNA和碱基错配的非目标RNA；
4）本发明可用于人血清样品的直接检测，可以通过简单的设计用于其他DNA或RNA的灵敏检测，是一种通用的核酸检测平台。
附图说明
图1为本发明实施例1中microRNA-21标准品溶液检测得到的标准曲线图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的microRNA检测的操作复杂性、检测限灵敏度不够高等问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是一种基于RCA的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的双重DNA机器检测microRNA-21的荧光检测方法，所述荧光检测方法的操作步骤如下：（1）环状DNA模板的连接；（2）基于双重DNA机器的荧光信号放大；（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线；（4）对含microRNA-21的实际样品进行定量检测。
本发明实施例的一个方面提供了一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法，其包括：
在microRNA-21存在的情况下，采用T4连接酶将5’端磷酸化处理的锁式探针连接形成环状DNA模板；并在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的同时作用下引发环状DNA机器运转，得到单链产物；
使所述单链产物与回文发夹探针杂交，得到杂交双链，且使杂交双链中回文发夹探针的3’端进行分子间互补配对，在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶作用下实现双向DNA机器的循环链置换扩增，得到扩增产物；
对反应体系中扩增产物的荧光信号进行检测，获得microRNA-21的浓度。
（1）将T4连接酶缓冲液、5’端磷酸化处理的锁式探针、microRNA-21和去离子水均匀混合，使所得混合物于90～95℃加热2～5 min，冷却至室温，再加入5～10 U T4连接酶，之后使所得第一反应体系于16～25℃反应30～60 min，形成环状DNA模板；
（2）使包含步骤（1）所获第一反应体系、1-2 μL DNA聚合酶缓冲液、1～2 μL回文发夹探针、1～2 μL dNTPs、3～5 μL DNA聚合酶和5～10 U 限制性核酸内切酶的第二反应体系于30～37℃孵育反应1～2.5 h，得到扩增产物；
（3）根据步骤（1）和（2），对一系列不同浓度microRNA-21标准溶液进行定量检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，获得microRNA-21浓度-荧光强度值标准曲线；
（4）根据步骤（1）和（2），对含有microRNA-21的待测生物样品进行检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测生物样品中microRNA-21的浓度。
进一步地，所述锁式探针（Padlock probe，PP）的序列如SEQ ID NO: 1所示，具体为5’-P-CTGATAAGCTATACGCGTACTTCAACAACAACAACAACCCTCAGCTCAACATCAGT-3’。
进一步地，所述回文发夹探针（Palindromic hairpin probe，PHP）的序列如SEQID NO: 2所示，具体为：
5’-DABCYL-tacgcgtacttcAACAACAACAACAAC CCTCAGCgaagtacgcgt(FAM)a-3’。
进一步地，所述DNA聚合酶包括Klenow，但不限于此。
进一步地，所述限制性核酸内切酶包括Nb. BbvCI，但不限于此。
在一些更为具体的实施例中，所述制备方法包括：在microRNA-21存在的情况下，首先利用T4连接酶把PP连接形成环状DNA模板，并在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的同时作用下引发环状DNA机器运转，产生大量单链产物。所得单链产物又能与PHP直接杂交，迫使其荧光基团和淬灭基团分离，释放强烈的荧光信号。与此同时，不同PHP/PP双链中PHP的3’端可以分子间互补配对，在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶作用下实现双向DNA机器的循环链置换扩增。最后，通过反应体系荧光信号的强度与microRNA-21浓度之间的线性变化关系，建立microRNA-21的荧光检测方法。
其中，在一些更为优选的实施案例之中，本发明利用基于RCA的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的双重DNA机器荧光检测microRNA-21的方法，具体操作步骤如下：
（1）环状DNA模板的连接：①在无菌的离心管中依次加入1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL 2 μM 的5’端磷酸化处理的锁式探针（Padlock probe，PP）、1 μL microRNA-21和6 μL去离子水，所得混合物在90℃加热2 min后逐渐冷却至室温；② 在上述溶液中继续加入1 μL T4连接酶（10 U），16℃反应30 min环化PP。
（2）基于双重DNA机器的一锅法荧光信号放大：向装有环状DNA模板的离心管中继续加入2 μL 10× Klenow (exo-)缓冲液、2 μL10 μM回文发夹探针（Palindromic hairpinprobe，PHP）、2 μL 25mM dNTPs，3 U Klenow及10 U Nb. BbvCI，反应液置于37 ℃孵育反应2.5 h。
（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：①将购置所得的标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解至100 μM的储存液。储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得不同浓度的microRNA-21标准溶液；②根据步骤（1）和（2）中所述方法对不同浓度的microRNA-21标准溶液进行定量检测，并测量其产物在激发光为490 nm时490 nm处的荧光强度值；③以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以490 nm处的荧光强度值为纵坐标，建立microRNA-21检测的microRNA-21浓度-荧光强度值标准曲线；
（4）对含microRNA-21的实际生物样品进行定量检测：将未知的含有microRNA-21的生物样品作为检测目标，按照步骤（1）和（2）中相同处理方法进行检测，所得荧光强度值带入microRNA-21检测的标准曲线，计算出microRNA-21的浓度。
进一步地，所述待测生物样品包括人血清，但本发明对人血清的检测不是为了获得人体健康状况为目的的，即，不是为了疾病或其征兆的诊断目的。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种产品，应用于前述的双重DNA机器检测microRNA-21的方法，所述的产品包括锁式探针和回文发夹探针，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述回文发夹探针的序列如SEQ ID NO: 2所示。
综上所述，本发明提供的双重DNA机器检测microRNA-21的方法具有很高的miRNA-21检测灵敏度，检测限为10 fM，线性范围广（10 fM~ 50 nM），且该方法背景信号低，目标信号强，所得信噪比高（S/N= 24），远超出现有荧光检测方法；同时，该方法具有良好的特异性，可以较易区分完全互补的目标RNA和碱基错配的非目标RNA，可用于血清样品的直接检测，可以通过简单的设计用于其他DNA或RNA的灵敏检测，是一种通用的核酸检测平台。
但需要注意的是，本发明对人血清的检测不是为了获得人体健康状况为目的的，即，不是为了疾病或其征兆的诊断目的。
以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
（1）环状DNA模板的连接：① 在无菌的离心管中依次加入1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL 2 μM 的5’端磷酸化处理的锁式探针（Padlock probe，PP）、1 μL microRNA-21和 6 μL去离子水，所得混合物在90℃加热2 min后逐渐冷却至室温；② 在上述溶液中继续加入1 μL T4连接酶（10 U），16 ℃反应30 min环化PP。
（2）基于双重DNA机器的一锅法荧光信号放大：向装有环状DNA模板的离心管中继续加入2 μL 10× Klenow (exo-)缓冲液、2 μL10 μM回文发夹探针（Palindromic hairpinprobe，PHP）、2 μL 25mM dNTPs，3 U Klenow及10 U Nb. BbvCI，反应液置于37℃孵育反应2.5 h。
（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：①将购置所得的标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解至100 μM的储存液。储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得不同浓度的microRNA-21标准溶液；②根据（2）和（3）中所述方法对不同浓度的microRNA-21标准溶液进行定量检测，并测量其产物在激发光为490 nm时520 nm处的荧光强度值；③以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以520 nm处的荧光强度值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线，如图1所示。
（4）癌细胞总RNA的提取：①在癌细胞加入1 mL Trizol试剂，静置5-10 min后，转入离心管，再加入200 μL氯仿，摇匀静置5-10 min后于4℃、12000 g条件下离心15-20 min；② 吸取最上层水层，加入等量的异丙醇后静置10-15 min，在4℃、12000 g条件下离心10-25 min，弃去上清液；③加入1ml的75％的乙醇，离心：4℃，12000g，5-10 min，再静置10min使酒精风干后加入20μl的DEPC水，使RNA溶解。
（5）对从癌细胞提取的microRNA-21样品进行定量检测：将癌细胞的RNA总提取液作为检测目标，按照（1）、（2）和（3）中相同处理方法进行检测，所得荧光强度值带入（3）中建立的检测miRNA-21的标准曲线，计算出癌细胞样品中microRNA-21的浓度。
本实施例荧光检测过程中所用的探针序列如表1所示。
表1：荧光检测过程中所用的探针序列
Figure 765576DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
（1）环状DNA模板的连接：① 在无菌的离心管中依次加入1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL 2 μM 的5’端磷酸化处理的锁式探针（Padlock probe，PP）、1 μL microRNA-21和 6 μL去离子水，所得混合物在90℃加热3 min后逐渐冷却至室温；② 在上述溶液中继续加入1 μL T4连接酶（10 U），16 ℃反应40 min环化PP。
（2）基于双重DNA机器的一锅法荧光信号放大：向装有环状DNA模板的离心管中继续加入2 μL 10× Klenow (exo-)缓冲液、2 μL10 μM回文发夹探针（Palindromic hairpinprobe，PHP）、2 μL 25mM dNTPs，3 U Klenow及10 U Nb. BbvCI，反应液置于35℃孵育反应2.5h。
（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：①将购置所得的标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解至100 μM的储存液。储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得不同浓度的microRNA-21标准溶液；②根据（2）和（3）中所述方法对不同浓度的microRNA-21标准溶液进行定量检测，并测量其产物在激发光为490 nm时520 nm处的荧光强度值；③以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以520 nm处的荧光强度值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线。
（4）血清样品的处理：取健康人的血清样品，用PB（10 mM，pH 7.0）稀释5-10倍，95℃加热5min后在冰浴下使其冷却。热处理的血清样品130000 g离心（4 ℃，20 min），取五分之二上清保存备用。
（5）对含microRNA-21的血清样品进行定量检测：将添加有10 fM 浓度的microRNA-21的健康人血清样品作为检测目标，按照（1）、（2）和（3）中相同处理方法进行检测，所得荧光强度值带入（3）中建立的检测miRNA-21的标准曲线，计算出血清样品中microRNA-21的浓度。本实施例荧光检测过程中所用的探针序列如表1所示。
实施例3
（1）环状DNA模板的连接：① 在无菌的离心管中依次加入1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL 2 μM 的5’端磷酸化处理的锁式探针（Padlock probe，PP）、1 μL microRNA-21和 6 μL去离子水，所得混合物在92℃加热2 min后逐渐冷却至室温；② 在上述溶液中继续加入1 μL T4连接酶（10 U），20 ℃反应60 min环化PP。
（2）基于双重DNA机器的一锅法荧光信号放大：向装有环状DNA模板的离心管中继续加入1 μL 10× Klenow (exo-)缓冲液、1.5 μL10 μM回文发夹探针（Palindromichairpin probe，PHP）、1 μL 25mM dNTPs，4 U Klenow及5 U Nb. BbvCI，反应液置于30℃孵育反应2.5 h。
（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：①将购置所得的标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解至100 μM的储存液。储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得不同浓度的microRNA-21标准溶液；②根据（2）和（3）中所述方法对不同浓度的microRNA-21标准溶液进行定量检测，并测量其产物在激发光为490 nm时520 nm处的荧光强度值；③以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以520 nm处的荧光强度值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线。
（4）血清样品的处理：取健康人的血清样品，用PB（10 mM，pH 7.0）稀释5-10倍，95℃加热5min后在冰浴下使其冷却。热处理的血清样品130000 g离心（4 ℃，20 min），取五分之二上清保存备用。
（5）对含microRNA-21的血清样品进行定量检测：将添加有10 pM 浓度的microRNA-21的健康人血清样品作为检测目标，按照（1）、（2）和（3）中相同处理方法进行检测，所得荧光强度值带入（3）中建立的检测miRNA-21的标准曲线，计算出血清样品中microRNA-21的浓度。本实施例荧光检测过程中所用的探针序列如表1所示。
实施例4
（1）环状DNA模板的连接：① 在无菌的离心管中依次加入1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL 2 μM 的5’端磷酸化处理的锁式探针（Padlock probe，PP）、1 μL microRNA-21和 6 μL去离子水，所得混合物在95℃加热5 min后逐渐冷却至室温；② 在上述溶液中继续加入1 μL T4连接酶（10 U），25℃反应30 min环化PP。
（2）基于双重DNA机器的一锅法荧光信号放大：向装有环状DNA模板的离心管中继续加入1.5 μL 10× Klenow (exo-)缓冲液、1 μL10 μM回文发夹探针（Palindromichairpin probe，PHP）、1 μL 25mM dNTPs，5 U Klenow及8U Nb. BbvCI，反应液置于37℃孵育反应1 h。
（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：①将购置所得的标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解至100 μM的储存液。储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得不同浓度的microRNA-21标准溶液；②根据（2）和（3）中所述方法对不同浓度的microRNA-21标准溶液进行定量检测，并测量其产物在激发光为490 nm时520 nm处的荧光强度值；③以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以520 nm处的荧光强度值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线。
（4）血清样品的处理：取健康人的血清样品，用PB（10 mM，pH 7.0）稀释5-10倍，95℃加热5min后在冰浴下使其冷却。热处理的血清样品130000 g离心（4 ℃，20 min），取五分之二上清保存备用。
（5）对含microRNA-21的血清样品进行定量检测：将添加有10 nM浓度的microRNA-21的健康人血清样品作为检测目标，按照（1）、（2）和（3）中相同处理方法进行检测，所得荧光强度值带入（3）中建立的检测miRNA-21的标准曲线，计算出血清样品中microRNA-21的浓度。本实施例荧光检测过程中所用的探针序列如表1所示。
实施例5
（1）环状DNA模板的连接：① 在无菌的离心管中依次加入1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL 2 μM 的5’端磷酸化处理的锁式探针（Padlock probe，PP）、1 μL microRNA-21和 6 μL去离子水，所得混合物在90℃加热2 min后逐渐冷却至室温；② 在上述溶液中继续加入1 μL T4连接酶（10 U），16 ℃反应30 min环化PP。
（2）基于双重DNA机器的一锅法荧光信号放大：向装有环状DNA模板的离心管中继续加入2 μL 10× Klenow (exo-)缓冲液、2 μL10 μM回文发夹探针（Palindromic hairpinprobe，PHP）、1.5μL 25mM dNTPs，3 U Klenow及5 U Nb. BbvCI，反应液置于37℃孵育反应2h。
（3）对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：①将购置所得的标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解至100 μM的储存液。储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得不同浓度的microRNA-21标准溶液；②根据（2）和（3）中所述方法对不同浓度的microRNA-21标准溶液进行定量检测，并测量其产物在激发光为490 nm时520 nm处的荧光强度值；③以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以520 nm处的荧光强度值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线。
（4）血清样品的处理：取健康人的血清样品，用PB（10 mM，pH 7.0）稀释5-10倍，95℃加热5min后在冰浴下使其冷却。热处理的血清样品130000 g离心（4 ℃，20 min），取五分之二上清保存备用。
（5）对含microRNA-21的血清样品进行定量检测：将添加有50 nM浓度的microRNA-21的健康人血清样品作为检测目标，按照（1）、（2）和（3）中相同处理方法进行检测，所得荧光强度值带入（3）中建立的检测miRNA-21的标准曲线，计算出血清样品中microRNA-21的浓度。本实施例荧光检测过程中所用的探针序列如表1所示。
藉由上述技术方案，本发明提供的双重DNA机器检测microRNA-21的方法具有很高的miRNA-21检测灵敏度，检测限为10 fM，线性范围广（10 fM~ 50 nM），且该方法背景信号低，目标信号强，所得信噪比高（S/N= 24），远超出现有荧光检测方法；同时，该方法具有良好的特异性，可以较易区分完全互补的目标RNA和碱基错配的非目标RNA，可用于人血清样品的直接检测，可以通过简单的设计用于其他DNA或RNA的灵敏检测，是一种通用的核酸检测平台。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> 一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ctgataagct atacgcgtac ttcaacaaca acaacaaccc tcagctcaac atcagt 56
<210> 2
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
tacgcgtact tcaacaacaa caacaaccct cagcgaagta cgcgta 46

Claims (7)

1.一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法，其特征在于包括：
（1）将T4连接酶缓冲液、5’端磷酸化处理的锁式探针、microRNA-21和去离子水均匀混合，使所得混合物于90～95℃加热2～5 min，冷却至室温，再加入5～10 U T4连接酶，之后使所得第一反应体系于16～25℃反应30～60 min，形成环状DNA模板；
（2）使包含步骤（1）所获第一反应体系、1-2 μL DNA聚合酶缓冲液、1～2 μL回文发夹探针、1～2 μL dNTPs、3～5 μL DNA聚合酶和5～10 U 限制性核酸内切酶的第二反应体系于30～37℃孵育反应1～2.5 h，得到扩增产物；
（3）根据步骤（1）和（2），对一系列不同浓度microRNA-21标准溶液进行定量检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，获得microRNA-21浓度-荧光强度值标准曲线；
（4）根据步骤（1）和（2），对含有microRNA-21的待测生物样品进行检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测生物样品中microRNA-21的浓度；
其中，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述回文发夹探针的序列如SEQ IDNO: 2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶包括Klenow酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述限制性核酸内切酶包括Nb. BbvCI。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括：将标准microRNA-21粉末用DEPC处理后的水溶解，得到储存液，所述储存液继续用DEPC处理后的水逐级稀释，获得一系列不同浓度的microRNA-21标准溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述激发光波段的波长为 490 nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测生物样品包括人血清。
7.一种产品，应用于权利要求1-6中任一项所述的方法中，其特征在于：所述的产品包括锁式探针和回文发夹探针，所述锁式探针的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述回文发夹探针的序列如SEQ ID NO: 2所示。
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