CN111733264B - 一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用 - Google Patents

一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用，传感器包括玻碳电极、引物序列、模板序列、DNA连接酶、DNA聚合酶、水溶性银盐、还原剂；玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点；所述模板序列能够形成哑铃状结构，哑铃状结构能够被DNA连接酶连接闭合；模板序列、引物序列和幽门螺旋杆菌核酸序列能够形成三聚体结构，三聚体结构在DNA聚合酶作用下能够使引物序列进行滚环扩增，扩增后的DNA长链具有富含胞嘧啶碱基的重复序列。本发明能够实现对幽门螺旋杆菌核酸的超灵敏检测。

Description

一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用
技术领域
本发明涉及一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性菌，是最常见的细菌病原体之一，主要生存于人体胃幽门部位，是胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等多种疾病的潜在诱因，67％-80％的胃溃疡和95％的十二指肠溃疡被认为是由幽门螺旋杆菌引起的。近年，幽门螺旋杆菌感染被发现和胃癌有密切的相关性，世界卫生组织将幽门螺旋杆菌定义为1类胃癌致病因子。
检测幽门螺旋杆菌对胃部健康至关重要。现有检测方法主要包括胃镜法、碳13尿素呼气法、血清法、粪便检查和尿液检查等。胃镜法能直接取样检测菌体，但侵入式检查会给病人带来痛苦；碳13尿素呼气法需要使用同位素标记的尿素胶囊，成本较高，检测呼出气体中标记同位素含量所需的仪器也比较昂贵；针对抗体的样本检测由于免疫反应的持续性，无法区分感染分期，尤其是对康复过程的跟踪有很长的滞后性。核酸检测由于特异性强、检测速度快而成为微生物检测的重要方法。然而，经过发明人的研究发现，无论是环境样本还是生理样本中，幽门螺旋杆菌核酸均已经过了高倍稀释，现有技术的检测灵敏度不足，从而限制了幽门螺旋杆菌核酸检测的发展。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用，能够实现对幽门螺旋杆菌核酸的超灵敏检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种幽门螺旋杆菌核酸传感器，包括玻碳电极、引物序列、模板序列、DNA连接酶、DNA聚合酶、水溶性银盐、还原剂；玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点；
所述模板序列能够形成哑铃状结构，哑铃状结构能够被DNA连接酶连接闭合；模板序列、引物序列和幽门螺旋杆菌核酸序列能够形成三聚体结构，三聚体结构在DNA聚合酶作用下能够使引物序列进行滚环扩增，扩增后的DNA长链具有富含胞嘧啶碱基的重复序列。
另一方面，一种幽门螺旋杆菌核酸的检测方法，提供上述幽门螺旋杆菌核酸传感器；包括以下步骤：
将模板序列孵育成哑铃状结构，利用DNA连接酶将哑铃状结构的DNA两端连接闭合；
将玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点获得引物传感电极；
将待测含有幽门螺旋杆菌核酸的样品与闭合哑铃状结构的模板序列、传感电极孵育，使引物传感电极表面的引物序列与模板序列、幽门螺旋杆菌核酸形成三聚体结构，在DNA聚合酶作用下，三聚体结构的引物序列进行滚环扩增获得具有重复序列的长链，使引物传感电极成为扩增传感电极；
向扩增传感电极中添加水溶性银盐、还原剂，进行还原反应使得扩增后的DNA长链的负载纳米银簇获得电化学传感电极；
以电化学传感电极作为工作电极在过硫酸盐溶液中进行电致化学发光检测。
第三方面，一种上述幽门螺旋杆菌核酸传感器在制备检测幽门螺旋杆菌试剂中的应用。
第四方面，一种幽门螺旋杆菌检测试剂盒，包括上述幽门螺旋杆菌核酸传感器、缓冲溶液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。
本发明的有益效果为：
本发明结合滚环扩增反应和电致化学发光，实现了幽门螺旋杆菌核酸的超灵敏检测。其对于幽门螺旋杆菌核酸的检测限低至1pM。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中的检测过程示意图。
图2为本发明实施例1中制备的CdS NCs的表征图，A为荧光谱，B为TEM。
图3为本发明实施例1中核酸反应过程的凝胶电泳表征图。
图4为本发明实施例1中目标target存在对ECL信号的影响表征图。
图5为本发明实施例1中检测不同浓度目标序列的ECL信号结果表征图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有技术对幽门螺旋杆菌核酸的检测灵敏度较低的问题，本发明提出了一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种幽门螺旋杆菌核酸传感器，包括玻碳电极、引物序列、模板序列、DNA连接酶、DNA聚合酶、水溶性银盐、还原剂；玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点；
所述模板序列能够形成哑铃状结构，哑铃状结构能够被DNA连接酶连接闭合；模板序列、引物序列和幽门螺旋杆菌核酸序列能够形成三聚体结构，三聚体结构在DNA聚合酶作用下能够使引物序列进行滚环扩增，扩增后的DNA长链具有富含胞嘧啶碱基的重复序列。
所述水溶性银盐是指溶于水且电离出银离子的化合物，例如硝酸银等。
所述还原剂为能够将银离子还原的化合物，例如硼氢化钠等。
该实施方式的一些实施例中，所述模板序列由5’端至3’端的核酸链序列为AGCTTATTCCAGATCCGCTTTATAAATAAGCTTATAACAGGAGGAAGGAGGTGTTATA；
引物序列由5’端至3’端的核酸链序列为ATACCAATATCTGGA；
幽门螺旋杆菌核酸由5’端至3’端的核酸链序列为ATTTATAAAGCGGATATTGGTAT。
经过实验表明采用该组序列能够更好的对幽门螺旋杆菌核酸的超灵敏检测，重新性更佳。
该实施方式的一些实施例中，引物序列的5’端修饰为巯基。
该实施方式的一些实施例中，玻碳电极表面连接巯基乙醇。采用巯基乙醇封闭位点。
该实施方式的一些实施例中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
该实施方式的一些实施例中，所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
本发明的另一种实施方式，提供了一种幽门螺旋杆菌核酸的检测方法，提供上述幽门螺旋杆菌核酸传感器；包括以下步骤：
将模板序列孵育成哑铃状结构，利用DNA连接酶将哑铃状结构的DNA两端连接闭合；
将玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点获得引物传感电极；
将待测含有幽门螺旋杆菌核酸的样品与闭合哑铃状结构的模板序列、传感电极孵育，使传感电极表面的引物序列与模板序列、幽门螺旋杆菌核酸形成三聚体结构，在DNA聚合酶作用下，三聚体结构的引物序列进行滚环扩增获得具有重复序列的长链，使引物传感电极成为扩增传感电极；
向扩增传感电极中添加水溶性银盐、还原剂，进行还原反应使得扩增后的DNA长链的负载纳米银簇获得电化学传感电极；
以电化学传感电极作为工作电极在过硫酸盐溶液中进行电致化学发光检测。
本发明所述的检测方法主要以非疾病的诊断与治疗为目的。
该实施方式的一些实施例中，所述CdS量子点的制备过程为：在65～75℃下，将硫化钠溶液滴加至硝酸镉，回流反应。
在一种或多种实施例中，回流反应后，离心分离，收集沉淀，加水超声分散，再离心分离，收集上清液即为CdS量子点溶液。
该实施方式的一些实施例中，模板序列孵育成哑铃状结构的过程为：先在93～97℃孵育5～15min，然后以0.05～0.15℃/s的速度降温至20～30℃，静置3～5h。
该实施方式的一些实施例中，将模板序列孵育成哑铃状结构后，加入DNA连接酶在15～17℃下过夜反应，再加热至60～70℃反应5～15min，然后冷却至室温。
该实施方式的一些实施例中，向玻碳电极滴加CdS量子点溶液，使玻碳电极表面连接CdS量子点，然后滴加引物序列溶液，使引物序列连接在玻碳电极表面。
在一种或多种实施例中，将引物序列连接在玻碳电极表面后添加巯基乙醇，在室温下进行孵育。
该实施方式的一些实施例中，将待测含有幽门螺旋杆菌核酸的样品与模板序列、DNA聚合酶、dNTP、牛血清白蛋白(BSA)、缓冲液混合均匀制备RCA反应液，将RCA反应液滴加至引物传感电极表面，在27～33℃孵育5～7h。
该实施方式的一些实施例中，向扩增传感电极表面滴加水溶性银盐溶液，在3～5℃孵育，然后滴加还原剂，先冷冻，然后在3～5℃过夜反应。
该实施方式的一些实施例中，电致化学发光检测的参数为扫速设置为90～110mVs-1，电位设置-1.4V～0V。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述幽门螺旋杆菌核酸传感器在制备检测幽门螺旋杆菌试剂中的应用。
本发明的第四种实施方式，提供了一种幽门螺旋杆菌检测试剂盒，包括上述幽门螺旋杆菌核酸传感器、缓冲溶液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
CdS量子点溶液的合成。
在70℃并不断搅拌下，将0.1937g硫化钠(Na2S)溶于30mL超纯水中(新制)的Na2S溶液缓慢加入到0.1861g四水合硝酸镉(Cd(NO)3·4H2O)溶于30mL超纯水的溶液中，得到橙黄色溶液，70℃下回流3小时，冷却至室温。将溶液转移至离心管15000r/min离心10min，收集沉淀，再用乙醇和超纯水各洗一次，每次洗涤后15000转离心去除上清液，收集沉淀，加入纯水超声分散，再12000转离心，收集上清液即为CdS量子点溶液，获得的CdS量子点的荧光图谱如图2A所示，TEM如图2B所示。
电极上的修饰和反应过程。
1)1.0μM的template(溶剂TE缓冲液)加热到95℃维持10min，程序降温0.1度/秒降温到25℃，维持4小时。再加入1×T4 DNA ligase reaction buffer和T4 DNA ligase(1U/μL)，16℃过夜反应。最后加热到65℃并维持10min，冷却至室温后，放4℃冰箱备用。
2)首先将玻碳电极用铝粉打磨，在水和乙醇中各超声2min，氮气吹干。将8μL CdS量子点溶液滴在清洗好的玻碳电极上，过夜，晾干。再将10μL 2.5μM的primer滴在电极上，4℃，过夜。再将电极用超纯水冲洗，氮气吹干，滴加10μL 1mM的巯基乙醇(MCH)，室温孵育2小时。再将电极用超纯水冲洗，氮气吹干，滴加RCA反应液，30℃孵育6小时。RCA反应液包含2μL100nM的target(幽门螺旋杆菌核酸)，2μL template，1μL 1000U/mL的phi29 polymerase，2μL 2.5mM的dNTP，0.5μL 10mg/mL的BSA和2μL 10×phi29 polymerase reaction buffer。再将电极用超纯水冲洗，氮气吹干。1.44μL 25mM的硝酸银(AgNO3)溶液加入到450μL 20mM的PBS(pH为7.3，含有1.0mM的MgCl2)中，混合均匀后，取10μL滴加到电极上，4℃孵育30min，注意避光。最后将10μL 12.5mM新制的硼氢化钠(NaBH4)溶液滴于电极上，先冷冻1min，后4℃过夜反应，注意避光。
电致化学发光检测过程。
0.1M的PBS(pH为7.3)含有0.05M过硫酸钾(K2S2O8)，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，修饰的玻碳电极为工作电极，扫速设置为100mV s-1，电位设置-1.4V～0V。
实施例中采用的序列如下：
template:
5’-AGCTTATTCCAGATCCGCTTTATAAATAAGCTTATAACAGGAGGAAGGAGGTGTTATA-3’，见SEQ ID NO.1。
Primer:5’-SH-ATACCAATATCTGGA-3’，见SEQ ID NO.2。
Target:5’-ATTTATAAAGCGGATATTGGTAT-3’，见SEQ ID NO.3。
本实施例的检测原理如图1所示，包括核酸扩增过程和电致化学发光检测。
核酸扩增过程如下所述：首先利用设计的特殊序列经退火后构建双发卡模板DNA，加入T4 DNA连接酶闭环后形成哑铃状模板DNA。在基底金电极上通过共价键修饰固定引物DNA，当目标DNA存在时，引物链、模板链和目标链在基底金电极上形成三聚体稳定结构。加入phi29 DNA聚合酶和ATP，以dNTPs为原料，引发DNA复制，使引物链沿模板链方向延伸，由于双链DNA的刚性结构，使模板DNA的双发卡结构断开形成单环。随着聚合反应继续进行，引物链延长，使目标链释放，可以引发新的循环，而引物链在滚环扩增作用下形成一条具有重复序列的DNA长链。
电致化学发光检测：在电极表面预孵CdS量子点，构建了CdS-S2O8 -电致化学发光体系。电极表面在目标序列驱动下产生具有重复序列的DNA长链后，使用硝酸银和硼氢化钠在富含C碱基的DNA长链上合成了纳米银簇，这种银簇可以催化S2O8 -发生分解反应，消耗电极表面共反应剂，使电致化学发光信号被猝灭。目标序列数量越多，产生的DNA长链数量越多，导致纳米银簇数量增加，猝灭作用增强，表现为ECL信号降低。
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对RCA过程可以进行验证。验证结果如图3所示。在2、3、4号泳道中分别加入的是primer、target DNA、template三条单链，在跑胶图上各形成一个单一条带。5号和6号泳道加入的是primer+template和target+template两种不同的单链组合，仅有两个条带说明两条单链之间并未形成稳定双链。在第7号泳道中，将primer、target DNA、template三种单链同时加入其中，此时可以看到方框位置出现新的条带，证明三条单链已经反应形成了三聚体。最后，对8号和9号我们进行了RCA循环的表征，其中8号为阴性对照未加入target DNA。如图3结果所示：9号泳道中加样区出现的条带证明有高碱基数DNA长链产生，而阴性对照组未见此条带，说明产生了RCA产物链。
电致化学发光检测结果如图4所示，从曲线1可以看出制备好的CdS纳米晶膜和共反应剂S2O8 2-离子能产生既强且稳定的ECL发光，当目标序列引发了RCA循环并合成了银簇后，由于银簇的消耗作用，发光信号被强烈猝灭，曲线2为使用1nM目标序列参加反应后的ECL信号，可以看到相比曲线1有明显的信号降低，猝灭效率达到95％。
对不同浓度的target进行电致化学发光检测结果如图5所示，使用不同浓度目标序列引发RCA循环后产生的最终ECL信号，建立工作曲线，检测限为1pM，线性区间为10pM～100nM。证明本实施例提供的方法具有较宽的线性范围，且检测限较低，具有超灵敏检测性能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建医科大学
<120> 一种幽门螺旋杆菌核酸传感器与检测方法及应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atttataaag cggatattgg tat 23

Claims (15)

1.一种幽门螺旋杆菌核酸传感器，其特征是，包括玻碳电极、引物序列、模板序列、DNA连接酶、DNA聚合酶、水溶性银盐、还原剂；玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点；
所述模板序列能够形成哑铃状结构，哑铃状结构能够被DNA连接酶连接闭合；模板序列、引物序列和幽门螺旋杆菌核酸序列能够形成三聚体结构，三聚体结构在DNA聚合酶作用下能够使引物序列进行滚环扩增，扩增后的DNA长链具有富含胞嘧啶碱基的重复序列；
所述模板序列由5’端至3’端的核酸链序列为AGCTTATTCCAGATCCGCTTTATAAATAAGCTTATAACAGGAGGAAGGAGGTGTTATA；
引物序列由5’端至3’端的核酸链序列为ATACCAATATCTGGA；
幽门螺旋杆菌核酸由5’端至3’端的核酸链序列为ATTTATAAAGCGGATATTGGTAT。
2.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器，其特征是，引物序列的5’端修饰为巯基。
3.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器，其特征是，玻碳电极表面连接巯基乙醇。
4.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器，其特征是，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
5.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器，其特征是，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。
6.一种权利要求1~5任一所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器在制备检测幽门螺旋杆菌试剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征是，提供权利要求1~5任一所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器；采用以下步骤检测：
将模板序列孵育成哑铃状结构，利用DNA连接酶将哑铃状结构的DNA两端连接闭合；
将玻碳电极表面连接引物序列和CdS量子点获得引物传感电极；
将待测含有幽门螺旋杆菌核酸的样品与闭合哑铃状结构的模板序列、传感电极孵育，使传感电极表面的引物序列与模板序列、幽门螺旋杆菌核酸形成三聚体结构，在DNA聚合酶作用下，三聚体结构的引物序列进行滚环扩增获得具有重复序列的长链，使引物传感电极成为扩增传感电极；
向扩增传感电极中添加水溶性银盐、还原剂，进行还原反应使得扩增后的DNA长链的负载纳米银簇获得电化学传感电极；
以电化学传感电极作为工作电极在过硫酸盐溶液中进行电致化学发光检测。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述CdS量子点的制备过程为：在65~75℃下，将硫化钠溶液滴加至硝酸镉，回流反应。
9.如权利要求7所述的应用，其特征是，模板序列孵育成哑铃状结构的过程为：先在93~97℃孵育5~15min，然后以0.05~0.15℃/s的速度降温至20~30℃，静置3~5h。
10.如权利要求7所述的应用，其特征是，将模板序列孵育成哑铃状结构后，加入DNA连接酶在15~17℃下过夜反应，再加热至60~70℃反应5~15min，然后冷却至室温。
11.如权利要求7所述的应用，其特征是，向玻碳电极滴加CdS量子点溶液，使玻碳电极表面连接CdS量子点，然后滴加引物序列溶液，使引物序列连接在玻碳电极表面。
12.如权利要求7所述的应用，其特征是，将待测含有幽门螺旋杆菌核酸的样品与模板序列、DNA聚合酶、dNTP、牛血清白蛋白、缓冲液混合均匀制备RCA反应液，将RCA反应液滴加至引物传感电极表面，在27~33℃孵育5~7h。
13.如权利要求7所述的应用，其特征是，向扩增传感电极表面滴加水溶性银盐溶液，在3~5℃孵育，然后滴加还原剂，先冷冻，然后在3~5℃过夜反应。
14.如权利要求7所述的应用，其特征是，电致化学发光检测的参数为扫速设置为90~110 mV s-1，电位设置-1.4 V~0 V。
15.一种幽门螺旋杆菌检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1~5任一所述的幽门螺旋杆菌核酸传感器、缓冲溶液、脱氧核糖核苷三磷酸。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355400B (zh) * 2021-04-06 2023-08-22 南京师范大学 一种基于t3 dna连接酶的镉离子检测方法
CN113388616B (zh) * 2021-07-27 2022-04-26 中国海洋大学 特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101608210A (zh) * 2008-06-18 2009-12-23 中山大学达安基因股份有限公司 幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒
CN109182569A (zh) * 2018-10-31 2019-01-11 济南市中心医院 高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN110982881A (zh) * 2019-12-20 2020-04-10 宁波美康盛德医学检验所有限公司 检测幽门螺杆菌的分子信标探针、试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060199187A1 (en) * 2005-03-02 2006-09-07 Meyerhoff Mark E Enzyme amplified electrochemical DNA detection

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101608210A (zh) * 2008-06-18 2009-12-23 中山大学达安基因股份有限公司 幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒
CN109182569A (zh) * 2018-10-31 2019-01-11 济南市中心医院 高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN110982881A (zh) * 2019-12-20 2020-04-10 宁波美康盛德医学检验所有限公司 检测幽门螺杆菌的分子信标探针、试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Silver Nanoclusters for High-Efficiency Quenching of CdS Nanocrystal Electrochemiluminescence and Sensitive Detection of microRNA;Zhang YanYan等;《Acs Appl Mater Interfaces》;20151111;全文 *
基于目标物引发的滚环扩增信号放大策略构建电致化学发光传感器用于microRNA检测;何晓静等;《化学传感器》;20170315;全文 *

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