CN111690722B - 基于熵驱动和杂交链反应的atp检测核酸传感器及其制备方法 - Google Patents

基于熵驱动和杂交链反应的atp检测核酸传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器及其制备方法。该核酸传感器包括5种探针，分别为H、F、A/B/S、H1和H2；本发明基于ATP核酸适配体构象转变，释放引发链，驱动熵驱动催化放大一级循环和杂交链式反应二级循环，最终通过荧光信号增强检测ATP分子。本核酸传感器具有反应迅速，灵敏度高，抗干扰能力强，反应条件温和等优点，能够弥补现有ATP检测方法的不足，实现ATP的快速准确的定量检测。

Description

基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器及其制备 方法
技术领域
本发明属于核酸传感器领域，更具体地涉及基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器及其制备方法，具体涉及一种基于核酸适配体调控的熵驱动电路耦合杂交链式反应双重放大电路及荧光检测ATP的荧光生物传感器。
背景技术
ATP在临床医学诊断方面有重要的借鉴意义，其含量的高低常与生物体的健康程度相关联，人体血清内ATP的含量大约为 1μmol·L-1，当其含量异常时，会引发各种疾病如心脑血管疾病、帕金森综合征、缺血、低血糖和一些恶性肿瘤等，同时，ATP在临床上有着广泛的应用，可以为脑溢血后遗症、心肌疾患和慢性肝炎等疾病提供重要的辅助性治疗。因此，设计快速，准确，灵敏且具特异性的ATP检测方法，不仅有利于在分子水平上推动对生命奥秘的探索，而且对于最新药物的分析、临床的诊断以及攻克许多疑难杂症等方面都有很重要的意义，在环境学、生物学以及医学等领域都有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器及其制备方法。
为实现上述目的采用以下技术方案：
本发明提供了一种检测ATP的级联方法的核酸传感器，上游墒驱动电路包含：重构探针H、预组装模版探针A/B/S、刺激探针F；下游杂交链反应电路包含：荧光染料修饰的发卡探针H1和发卡探针H2。所述探针序列分别为：
重构探针H：
CAGGTTACCCTACGTCTCCATAGGGTAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT；
预组装模版探针A：CCACATACATCATATTCCCTCAGGTTACCCTACG；
预组装模版探针B：GTCACTCGATCCAATCTACAGCTCTCTTACGG；
预组装模版探针S：
TGGAGACGTAGGGTAACCTGAGGGCCGTAAGAGAGCTGTAGATTGGATCG；
刺激探针F：CGATCCAATCTACAGCTCTCTTACGGCCCTCATTC AATACCCTACG；
发卡探针H1：
CGATCCAA(FAM)TCTACAGCAGATGTGTAGCTGTAGA(Dabcy 1)TTGGATCGAGTGAC；
发卡探针H2：TACACATCTGCTGTAGATTGGATCGGTCACTCGATCCAATCTACAGC；
所述的核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将探针A、B、S溶于Tris-HCl缓冲液中，95℃退火8分钟，使其完全杂交，获得预组装模版探针A/B/S混合液；
（2）将发卡探针H1预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H1发卡溶液；
（3）将发卡探针H2预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H2发卡溶液；
（4）将重构发卡探针H预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H发卡溶液；
（5）混合步骤（1）（2）（3）和（4）制得的溶液，加入刺激探针F，获得传感溶液。
所述Tris-HCl缓冲液包含以下终浓度成分：5 mM Tris-HCl、40 mM氯化钠、 pH7.4；所述传感溶液中，各探针最终浓度为200 nM。
本传感器的工作原理如图1所示：
在ATP存在的情况下，识别探针H发生构象转变，暴露H链隐藏的HI区域，HI 的3端碱基与S的5端未杂交；接着HI继续与S的后续结构互补配对，此位置碱基为原来B与A杂交部分，进而将A置换出来，形成HI/B/S杂交体。此时杂交体T/B/S中的S中间部位存在4个碱基的未杂交部分。溶液中的F可以跟这4个碱基进行杂交，并以此为支点，逐渐向两端与S杂交，逐渐替代原来与S杂交的HI和B，从而释放出HI和B，完成第一个循环过程。释放到溶液中的HI可以继续重复上述第一个循环过程，不断释放B，实现信号放大。
释放到溶液中的B的5端可以与发卡H1的3’端杂交，随后逐渐与H1的颈部杂交，打开发卡H1，形成B/H1的杂交体。形成的B/H1杂交体的H1的5’端可以继续跟H2的3’端碱基发生杂交，从而打开H2的发卡结构，形成B/H1/H2杂交体，H2的5’端可以继续打开H1的3’端，循环重复循环过程，实现信号放大。发卡结构的H1茎部位置修饰有荧光基团FAM，在与其互补的位点上修饰有淬灭集团Dabcy 1。在H1维持发卡结构时，FAM的荧光被淬灭，没有荧光信号。当B打开H1进而打开H2，形成B/H1/H2/H1/H2/H1/H2/H1/H2……杂交体后，FAM远离Dabcy1，FAM荧光恢复，荧光信号增强。通过测量荧光信号的增强即可测量溶液中ATP的浓度。
进一步地，将核酸传感器应用于ATP离子中，包括以下步骤：
（1）将不同浓度的ATP标准溶液和待测溶液分别加入到传感溶液混合均匀，在恒温金属浴中37℃孵育1小时；
（2）从恒温金属浴中取出各组混合溶液，测定各混合溶液的荧光值；
（3）根据不同浓度的ATP标准溶液的荧光值，作ATP浓度对荧光值的标准曲线，计算回归方程，最后根据待测样品的荧光值计算ATP浓度。
步骤（2）所述荧光值测定的激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。
ATP检测浓度为0.1μM-2μM。
本发明的有益效果：本发明提供一种检测ATP的级联信号放大的核酸传感器及其制备方法，利用了ATP核酸适配体构象转变实现了对ATP的高特异性识别；利用熵驱动催化放大一级循环和杂交链式反应二级循环，放大了荧光信号，实现对目标物ATP的超灵敏性检测；反应条件温和，反应速度快，抗干扰能力强，提高了检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明构建的核酸生物传感器的工作原理图。
图2为实施例中ATP浓度-荧光强度标准曲线。
图3为传感器对不同干扰分析物的选择性柱状图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明，但本发明不受下述实施例的限制。
本发明实施例中设计了七种DNA探针，分别为预组装模版探针（以下称为A、B和S）、重构探针（以下称为H）、刺激探针（以下称为F)、荧光染料Dabcy 1和FAM修饰的发卡探针1（以下称为H1）和发卡探针2（以下称为H2)。
实施例1
预组装模版探针、重构探针（ATP识别DNA探针）、刺激探针、荧光染料Dabcy 1和FAM修饰的发卡探针和发卡探针序列设计如表1；
表1传感器完整序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述的核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将探针A、B、S溶于Tris-HCl缓冲液中，95℃退火8分钟，使其完全杂交，获得预组装模版探针A/B/S混合液；
（2）将发卡探针H1预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H1发卡溶液；
（3）将发卡探针H2预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H2发卡溶液；
（4）将重构发卡探针H预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H发卡溶液；
（5）混合步骤（1）（2）（3）和（4）制得的溶液，加入刺激探针 F，获得传感溶液。各组分的最终浓度200nM。
实施例2 发卡探针的退火处理
利用Tris-HCl 缓冲液配制浓度为2μM的发卡探针溶液，取200μL的离心管一支，加入1μL 发卡探针(100μM) 和 49 μL Tris-HCl 缓冲液 (5 mM Tris-HCl, 40 mM氯化钠,pH 7.4)。将离心管在恒温金属浴中95℃保持8分钟，然后快速置于冰水中保持30分钟，使其形成稳定的二级结构。
实施例3 传感器的检测限
利用实施例3的传感器检测不同浓度的ATP标准液，确定其检测范围。具体步骤如下：
（1）制备不同浓度的ATP标准溶液。
（2）取10 μL传感溶液与5 μL不同浓度的ATP标准液混合，然后分别加入35 μLTris-HCl缓冲液于6支离心管中至溶液体积为50 μL，ATP最终浓度为0.1μM，0.2μM，0.5μM，1μM，1μM和2μM。震荡溶液10秒使其均匀，放入恒温金属浴中，37℃恒温避光反应1小时。
（3）从恒温金属浴中取出各组混合溶液，测定各组混合溶液在520 nm的荧光强度值。
（4）根据不同浓度的ATP标准液的荧光强度值，作ATP浓度-荧光强度值的标准曲线，计算回归方程。
（5）标准曲线如图2所示：标准曲线线性范围为0.1-2μM，检测限为38nM。
实施例 4 传感器抗干扰能力验证
（1）配置含有不同类似物的对照溶液(GTP，CTP，UTP)，浓度为20 μM。
（2）按实施例3步骤，取10 μL传感溶液与5 μL不同类似物溶液混合，然后分别加入35 μL Tris-HCl缓冲液于3支离心管中至溶液体积为50 μL，各类似物浓度为20 μM。震荡溶液10秒使其均匀，放入恒温金属浴中，37℃恒温避光反应1小时。
（3）从恒温金属浴中取出各组混合溶液，测定各组混合溶液在520 nm的荧光强度值。
（4）做出荧光值对干扰分析物种类的柱状图
（5）传感器抗干扰能力如图3所示：传感器对GTP，CTP，UTP等没有响应能力，对ATP具有选择性。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器及其制备方法
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caggttaccc tacgtctcca tagggtaacc tgggggagta ttgcggagga aggt 54
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggagacgta gggtaacctg agggccgtaa gagagctgta gattggatcg 50
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacatacat catattccct caggttaccc tacg 34
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcactcgat ccaatctaca gctctcttac gg 32
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgatccaatc tacagctctc ttacggccct cattcaatac cctacg 46
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgatccaatc tacagcagat gtgtagctgt agattggatc gagtgac 47
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tacacatctg ctgtagattg gatcggtcac tcgatccaat ctacagc 47

Claims (4)

1.基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器，其特征在于，上游墒驱动电路包含：重构探针H、预组装模版探针A/B/S、刺激探针F；下游杂交链反应电路包含：荧光染料修饰的发卡探针H1和发卡探针H2；所述探针序列分别为：
重构探针H：
CAGGTTACCCTACGTCTCCATAGGGTAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT；
预组装模版探针A：CCACATACATCATATTCCCTCAGGTTACCCTACG；
预组装模版探针B：GTCACTCGATCCAATCTACAGCTCTCTTACGG；
预组装模版探针S：
TGGAGACGTAGGGTAACCTGAGGGCCGTAAGAGAGCTGTAGATTGGATCG；
刺激探针F：
CGATCCAATCTACAGCTCTCTTACGGCCCTCATTC AATACCCTACG；
发卡探针H1：
CGATCCAA(FAM)TCTACAGCAGATGTGTAGCTGTAGA(Dabcy1)TTGGATCGAGTGAC；
发卡探针H2：
TACACATCTGCTGTAGATTGGATCGGTCACTCGATCCAATCTACAGC；
所述的基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将预组装模版探针A、B、S溶于Tris-HCl缓冲液中，95℃退火8分钟，使其完全杂交，得到预组装模版探针A/B/S混合液；
（2）将发卡探针H1预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H1发卡溶液；
（3）将发卡探针H2预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H2发卡溶液；
（4）将重构发卡探针H预先溶于Tris-HCl缓冲液，95℃退火8分钟，得到稳定的H发卡溶液；
（5）混合步骤（1）（2）（3）和（4）制得的溶液，加入刺激探针F，获得传感溶液。
2.根据权利要求1所述的基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器，其特征在于，Tris-HCl缓冲液由以下成分构成：5 mM Tris-HCl、40 mM氯化钠、pH 7.4；所述传感溶液中，各探针最终浓度为200 nM。
3.一种如权利要求1所述的基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器在制备检测ATP试剂中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）传感溶液中分别加入不同浓度的ATP标准溶液以及待测样品，在恒温金属浴中37℃孵育1h；
（2）取出各组标准样品溶液，利用荧光光谱仪测定各标准溶液的荧光值；并获得ATP浓度-荧光强度标准曲线；
（3）根据待测样品的荧光值计算待测ATP浓度。
4.根据权利要求3所述的基于熵驱动和杂交链反应的ATP检测核酸传感器在制备检测ATP试剂中的应用，其特征在于，步骤（2）所述荧光值测定的激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。
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