CN114106175B - 一种pd-l1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用 - Google Patents

一种pd-l1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种PD‑L1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用。PD‑L1单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；PD‑L1单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。本发明的PD‑L1单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性；包含有PD‑L1单克隆抗体的检测试剂盒具有检测方法简便、准确性强、成本低的优点。本发明的检测试剂盒可作为非小细胞肺癌辅助诊断的手段和PD‑1/PD‑L1通路肿瘤靶向药物的监测工具。

Description

一种PD-L1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种PD-L1单克隆抗体、试剂盒、其制 备方法和应用。
背景技术
程序性死亡配体1(PD-L1)是在淋巴和非淋巴组织以及肿瘤细胞和病毒感染 的细胞上广泛表达的PD-1蛋白受体的配体(Dong等，1999，Nature Med.)。PD-L1 是B7家族成员，属于I型跨膜蛋白，分子量约65kDa，全长290个氨基酸，包 含1个IgV区、1个IgC区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。 PD-L1主要表达于活化的T细胞、B细胞、多种肿瘤细胞及一些非淋巴组织。
2017年首个被批准的PD-L1的人源化IgG4-kappa抗体Keytruda用于治疗既 往化疗或靶向治疗失败的非小细胞肺癌上市，其研究表明，非小细胞肺癌患者 血清中PD-L1浓度与肿瘤疾病进展及治疗效果评价和疾病转归等方面有重要关 系，在疾病的诊断及预测疾病治疗等方面存在很大的应用价值。
近年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学 基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放 射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法和化学发光免疫分析。这些方法既可以 作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检 测仪器简单、操作方便等优点。
现有技术中针对PD-1/PD-L1通路靶向药物监测及预后的产品目前国内尚属 空白，同类产品其特异性和亲和力等方面还存在进一步的提升可能，因此，本 发明提供一种亲和力高、特异性强的PD-L1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和 应用。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种PD-L1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法 和应用，旨在解决背景技术中指出的现有技术存在的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种PD-L1单克隆抗体，
PD-L1单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序 列，或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
PD-L1单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序 列，或SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
作为本发明实施例的另一种优选方案，PD-L1单克隆抗体的重链高变区 CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3、重链框架区FR-H1、重链框 架区FR-H2、重链框架区FR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所 示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等 功能的氨基酸序列。
作为本发明实施例的另一种优选方案，PD-L1单克隆抗体的重链可变区 387bp(5’-3’)的核酸序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.8所示 的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功 能的氨基酸序列。
作为本发明实施例的另一种优选方案，PD-L1单克隆抗体的轻链高变区 CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3、轻链框架区FR-L1、轻链框架 区FR-L2、轻链框架区FR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQID NO.14、SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同 等功能的氨基酸序列。
作为本发明实施例的另一种优选方案，PD-L1单克隆抗体的轻链可变区 360bp(5’-3’)的核酸序列为SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.16所 示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等 功能的氨基酸序列。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的PD-L1单克隆抗体的制备方 法，包括以下步骤：
一、PD-L1蛋白抗原的制备；
二、PD-L1多克隆抗体的制备；
三、PD-L1单克隆抗体的制备；
四、单克隆抗体筛选：建立剂量反应曲线，筛选最优单克隆抗体；
五、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取：
提取杂交瘤细胞的总RNA；
以OligodT为引物，逆转录合成得到cDNA；
以合成cDNA为模板，进行PCR扩增；
获取编码重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列；
重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列和抗体的恒定区进行密码 子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链；
将获得的重链和轻链基因分别克隆到pMD18-T表达载体中；
将获得的质粒转染感受态细胞中；
收集细胞上清液，纯化、浓缩后获得PD-L1单克隆抗体。
作为本发明实施例的另一种优选方案，PCR扩增的条件为：95℃变性5min； 94℃，1min；50℃，2min；72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min
本发明实施例的另一目的在于提供一种PD-L1检测试剂盒，含有所述的 PD-L1单克隆抗体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的PD-L1检测试剂盒的制备方 法，包括以下步骤：
将PD-L1单克隆抗体用缓冲液稀释，加入链霉亲和素磁珠反应；
清洗缓冲液；
加入含胎牛血清的PBS封闭液，反应后进行磁性分离，去除上清液；
用缓冲液清洗后，磁粒悬于含牛血清白蛋白的PBS的保存缓冲液中，制 成PD-L1包被磁珠；
用PD-L1蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成PD-L1校准品；
将PD-L1多克隆抗体加入吖啶酯溶液，避光反应；
反应完毕后取出，加入赖氨酸盐溶液，继续避光反应；
纯化，得到PD-L1吖啶酯标抗体；
PD-L1包被磁珠中加入血清样本和校准品，再加入PD-L1吖啶酯标抗体， 温育后即形成抗体-抗原-标记抗体复合物；
分别加入HNO3、H2O2发光激发液A、NaOH、Triton-100发光激发液B， 立即放入化学发光免疫检测仪内，检测各孔的发光强度；
根据反应曲线算出样品中PD-L1的含量。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的PD-L1检测试剂盒在制备诊断 非小细胞肺癌临床辅助、评估PD-L1靶向药物疗效检测试剂盒中的应用。
本发明的PD-L1单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良 好的生物学活性；包含有PD-L1单克隆抗体的检测试剂盒具有检测方法简便、准 确性强、成本低的优点。本发明PD-L1单抗与PD-L1多抗建立的PD-L1蛋白检测试 剂盒可作为非小细胞肺癌辅助诊断的手段和PD-1/PD-L1通路肿瘤靶向药物的监 测工具。
附图说明
图1：PD-L1检测剂量-反应体系图。
图2：评估试剂测值与对比试剂测值的回归分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
该实施例提供了一种PD-L1单克隆抗体，PD-L1单克隆抗体的重链可变区氨 基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列 经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序 列。
PD-L1单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区 CDR-H3、重链框架区FR-H1、重链框架区FR-H2、重链框架区FR-H3的氨基酸序 列分别为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一 个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
PD-L1单克隆抗体的重链可变区387bp(5’-3’)的核酸序列为SEQ ID NO.8所示 的氨基酸序列；或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
PD-L1单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序 列；或SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
PD-L1单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区 CDR-L3、轻链框架区FR-L1、轻链框架区FR-L2、轻链框架区FR-L3氨基酸序列分 别为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15所示的氨基酸序列经替换、缺失和/ 或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
PD-L1单克隆抗体的轻链可变区360bp(5’-3’)的核酸序列为SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个 或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1：
Figure BDA0002876208700000061
Figure BDA0002876208700000071
SEQ ID NO.2：
Figure BDA0002876208700000072
SEQ ID NO.3：
Figure BDA0002876208700000073
SEQ ID NO.4：
Figure BDA0002876208700000074
SEQ ID NO.5：
Figure BDA0002876208700000075
Figure BDA0002876208700000081
SEQ ID NO.6：
Figure BDA0002876208700000082
SEQ ID NO.7：
Figure BDA0002876208700000083
SEQ ID NO.8：
Figure BDA0002876208700000084
SEQ ID NO.9：
Figure BDA0002876208700000091
SEQ ID NO.10：
Figure BDA0002876208700000092
SEQ ID NO.11：
Thr Val Lys
1
SEQ ID NO.12：
Figure BDA0002876208700000093
SEQ ID NO.13：
Figure BDA0002876208700000101
SEQ ID NO.14：
Figure BDA0002876208700000102
SEQ ID NO.15：
Figure BDA0002876208700000103
SEQ ID NO.16：
Figure BDA0002876208700000104
实施例2
该实施例提供了一种PD-L1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
一、PD-L1蛋白抗原的制备：
(1)根据GenBank数据库中人PD-L1(GQ904196.1)的序列设计一对引物： 上游引物为vF：5’-cgacatgtGCTABCATGCTGCTCCTGG-3’；
下游引物为vR：ccctcgagGCGGCCGCCTAGATCCTCTTTC-3’；
上游引物、下游引物的下划线部分为序列分别为Pci I和Xho I的酶切位点， 此两位点与哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG上的相应多克隆位点吻合；
通过全基因合成含有人PD-L1基因片段的克隆质粒，以质粒为模板，用 PyrobestDNA聚合酶进行PD-L1基因特异性扩增，PCR扩增的条件：95℃变性 5min；94℃，1min；50℃，2min；72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min；
扩增后的PCR产物进行凝胶回收、氯仿抽提产物、乙醇沉淀、TE溶解，得 到pSec/WG质粒，备用；
回收的PD-L1基因与pSec/WG质粒分别进行Pci I和Xho I双酶切，凝胶电泳 法回收；
再次分别纯化PCR酶切产物和载体的回收产物，PD-L1与pSec/WG按照 1:1的摩尔比混合，用TE溶解，于16℃反应12小时，置于70℃条件下10min 终止反应；
将上述反应产物连接DH-5α感受态细胞，通过氨苄(1mg/mL)抗体筛选出 阳性克隆，进行扩增，抽提重组PD-L1/pSec/WG质粒并经酶切、测序鉴定，备 用；
(2)采用脂质体试剂Lipofectamine 2000转染重组PD-L1/pSec/WG质粒到 真核表达细胞系Flp-In CHO中，转染后将细胞置于含潮霉素的培养基中培养和筛 选；
未转染的Flp-In CHO细胞系在Hams F12完全培养基中培养(含10％FBS、2 mM L-谷氨酰胺)，其中添加1％青/链霉素和100μg/mL Zeocin转染了重组质粒 PD-L1/pSec/WG的Flp-In CHO细胞，因为PD-L1基因***使宿主细胞基因组中的 zeocin抗性基因失活，但同时带入了潮霉素抗性基因(Hyg+)，因此，转染了重组 质粒的宿主细胞可以在含潮霉素的培养基中培养，而未转染的宿主细胞在此条 件下不能存活；在含800μg/mL的潮霉素的HamsF12完全培养基中培养，6-7天 可以筛选出相应的重组基因表达克隆；
将转染了PD-L1/pSec/WG重组质粒的Flp-In CHO细胞在UltraCHO无血清培 养基中培养，每隔3-4天收集细胞培养上清液1次；
收集的培养上清液10000r/min离心5分钟，去除沉淀；上清液中加入0.02％ NaN3，并通过0.22μm滤膜过滤除去所有可能的细胞碎片；
在柱子中填装l.0mL树脂，并用大约10体积的PBS(pH 7.2)平衡；将含目的 蛋白的上清液过Protein G-Sepharose 4B柱2次；20-30体积的PBS(pH 7.2)洗柱； 预先在每支收集小管中加入28μL的1.25M Tris-HCl(pH 8.0)；再用100mM Glycine-HCl(pH 3.0)洗脱液洗脱，按每管1.0rnl收集于收集小管中，使洗脱液能 在收集小管中立即被中和；通常蛋白在第3-10管被洗脱下来，峰值大约在3、4、 5管；收集所有A280＞0.01的洗脱液，再用UltraFree 15(MWCO 10000，Millipore) 的离心过滤柱浓缩；表达水平为50mg/L，进行SDS-PAGE电泳鉴定，纯化后的 PD-L1蛋白纯度大于98％；蛋白定量后，最后通过0.22μm滤膜过滤除菌，贮存 于-20℃备用；
二、PD-L1多克隆抗体的制备
(1)用雄性大耳兔作为免疫动物，先用10mg卡介苗注射刺激动物，使用 PD-L1蛋白作为免疫抗原一周后开始免疫；足下4-6点皮下注射，使用弗氏完 全佐剂作为免疫佐剂，分四次免疫动物；每次取1mg PD-L1蛋白将等量的弗氏 完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内充分乳化1小时，进行足皮下注 射，每次间隔两周；
取耳静脉血ELISA法检测效价，达到1:40000进行颈动脉放血，5000rpm 离心取血清，利用DEAE离子交换纯化，得到血清粗提多克隆抗体，备用；
(2)血清粗提多克隆抗体用0.5mol/L PBS(pH 7.5)稀释至1mg/mL，配置 CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶3mL，用偶联剂偶联9mg PD-L1蛋白抗原，室 温反应4小时，制成PD-L1抗体亲和层析柱，将血清粗提多克隆抗体上柱纯化， 洗脱收集，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD 值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50％甘油置于-20℃可长期保存；
三、PD-L1单克隆抗体的制备
(1)培养上述获得稳定表达的PD-L1/pSec/WG重组质粒Flp-In CHO细胞， 免疫5只雌性BALA/c小鼠，每只BALB/c小鼠皮下注射1×107细胞，连续免疫4 次，每次间隔2周；免疫7天后取血，用CLIA法检测血清效价，选择效价最高 的小鼠，脾内注射1×106个细胞加强免疫，3天后取小鼠脾脏，研磨，并对脾细 胞计数备用；
(2)取脾细胞与骨髓细胞Sp2/0按细胞计数5:1的比例融合，PEG1200诱 导，融合后加到含有饲养层的96孔板中培养，一周后用HAT培养基半量换液， 观察融合后细胞状态；
用间接CLIA法筛选阳性杂交瘤细胞株，选择1株PD-L1Ab持续分泌阳性率 98％以上的杂交瘤细胞(B7-H1)进行扩大培养准备腹腔注射小鼠，小鼠1周前 腹腔注射500μL液体石蜡；
离心收集杂交瘤细胞，用不完全培养液悬浮并混匀，将细胞数调至1×109/L， 开始接种小鼠，每只小鼠腹腔注射500μL，1周后对腹部明显肿胀小鼠抽取腹水， 所得腹水3000r/min离心3分钟，收集上清液；
(3)protein G纯化柱纯化腹水；用0.02mol/L PB缓冲液平衡纯化柱，加 入腹水上样，用0.1mol/L甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.7)进行洗脱，EP管收集，0.05mol/LPB透析，浓缩得到PD-L1单克隆抗体，置于-20℃冻存；
四、单克隆抗体筛选
(1)包被制备好的PD-L1单克隆抗体，以0.5mol/L PBS稀释抗体至 2～5μg/mL；100μL/孔加入酶标板中包被，2-8℃过夜后，0.9％NaCl洗3次，加 入含有1％BSA的封闭液，150μL/孔封闭，2-8℃过夜后晾干备用；
(2)筛选最优单克隆抗体：稀释制备好的PD-L1蛋白抗原，按比例稀释 8个梯度(0、10、50、100、200、400、1000、2000pg/mL)，依次加入前述 制备好的酶标中，每孔50μL，再加入生物素化多克隆抗体及标记有辣根过氧 化物酶的链霉亲和素，37℃温育1小时，PBST洗涤5次，加入显色底物液， 用酶标仪检测OD值；
以PD-L1浓度为横坐标X值，OD值为纵坐标Y值，建立剂量反应曲线(见 图1所示)。图1可以看出，PD-L1检测试剂盒所建立的剂量反应曲线，线性系 数R>0.99，检测范围可达0-800pg/ml，试剂盒的分析性能优越；终挑选评价指 标最好的PD-L1单克隆抗体；单克隆抗体隆抗体作为夹心法ELISA检测方法的 评价标准应同时满足S0 OD值＜0.1，S7/S1(P/N)最大，剂量反应曲线相关系 数大于0.99，30例质控血清检出率大于90％；
五、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取
(1)用Trizol试剂提取5×106的选中杂交瘤细胞(B7-H1)的总RNA；
再以OligodT为引物，AMV逆转录酶逆转录温度37℃、时间15分钟，合 成得到cDNA；
以合成cDNA为模板，针对RNA序列的引物和基因特异性引物GSP进行 巢式PCR扩增，PCR的条件均为：95℃变性5min；94℃，1min；50℃，2min； 72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min；
(2)将PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取并回收目的凝胶条带， 调取目的基因，连接到pGEM-T载体中，EcoRI酶切鉴定阳性的重组质粒，进行 DNA序列的测定，分别获得编码重链可变区基因序列，编码轻链可变区基因序 列；
将获得重链和轻链可变区基因序列和抗体的恒定区一起进行密码子优化并 合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，将获得的重链和轻链基因分别克 隆到pMD18-T表达载体中；质粒分别提取150μg的量，并去内毒素(＜1EU/mg)， 将获得的2种质粒1:1共转染到50mL体积的悬浮的感受态TG1细胞中，转染试 剂采用PEI，质粒和PEI的比值为1:2；
转染3-7天后，收集细胞上清液，SDS-PAGE检测抗体表达是否正确，ProteinA 柱纯化，浓缩后获得合格的PD-L1单克隆抗体，纯度大于98％。
实施例3
该实施例提供了一种PD-L1检测试剂盒，含有实施例1所述的PD-L1单克隆 抗体。
实施例4
该实施例提供了一种PD-L1检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)以链霉亲和素磁珠作为免疫反应载体，将PD-L1单克隆抗体用 0.02mol/LTris-HCl偶联缓冲液稀释至2.5μg/mL，加入链霉亲和素磁珠，于37℃ 摇床中反应30min；
用0.01mol/L PBS、0.05％tween-20清洗缓冲液，清洗3次左右；
加入1ml含2％胎牛血清的0.01mol/L PBS封闭液，于37℃，180rpm，摇 床中反应2h，磁性分离，去除上清液；
用1ml pH7.4，含0.1％tween-20的0.01mol/L PBS缓冲液清洗3次，磁粒 悬于1mlpH7.4的含1％牛血清白蛋白的0.01mol/L PBS的保存缓冲液中，制成 PD-L1包被磁珠，4℃备用；
(2)用1％BSA/0.5mol/L PBS稀释制备的PD-L1蛋白抗原，按比例稀释6 个梯度(10、50、100、200、400、800pg/mL)分装制成PD-L1校准品；
将生物素化PD-L1多克隆抗体加入0.5mM的吖啶酯(4-(2-琥珀酰亚氨基羧 基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μl，避光于25℃，180rpm，摇 床中反应20min；
反应完毕后取出，加入10％的赖氨酸盐溶液100μl，继续避光于25℃， 180rpm，摇床中反应30min；
用G-25脱盐柱纯化，得到PD-L1吖啶酯标抗体；
(3)在包被好PD-L1的磁珠中加入各50μL/孔的血清样本和校准品，再加 入50μL/孔PD-L1吖啶酯标抗体，37℃温育1h，温育后即形成固相抗体-抗原- 标记抗体的复合物，0.01mol/LPBS洗涤5次，除去未结合的PD-L1多克隆抗体 和吖啶酯；
分别加入0.1mol/L HNO3，0.1％H2O2发光激发液A 50μl，0.25mol/L NaOH， 2％Triton-100发光激发液B 50μl，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测累计 时间1.5s各孔的发光强度(RLU)；
样品的RLU值随PD-L1浓度的增加而升高，根据反应曲线即可算出样品中 PD-L1的含量。
实验例检测PD-L1检测试剂盒的性能
(1)PD-L1检测试剂盒的性能分析
重复性：PD-L1检测试剂盒的批内变异系数(CV)不大于10％；批间变异系 数(CV)不大于15％；
分析灵敏度：试剂盒最低检出限不大于6pg/mL；
分析特异性：一定浓度特异性物质(PD-1、PD-L2)检测结果不大于6pg/mL；
线性范围：在0-800pg/mL浓度范围内，线性相关系数r不小于0.9900。
(2)PD-L1检测试剂盒的临床性能
2.1开展998例检测，650例正常人，348例非小细胞肺癌患者血清PD-L1 检测，试剂盒正常参考值0-150pg/mL，试剂盒检测结果如下：
表1 PD-L1与CYFRA21-1试剂盒对非小细胞肺癌检测结果
Figure BDA0002876208700000171
表2PD-L1与CYFRA21-1试剂盒对非小细胞肺癌鉴别诊断效果
Figure BDA0002876208700000172
程序性死亡配体1(PD-L1)化学发光检测试剂盒对非小细胞肺癌灵敏度为82.76％，特异性为94.92％；优于目前市场上同类产品，能够起到非小细胞肺癌 临床辅助诊断的作用。
2.2PD-L1检测试剂盒的检测一致性分析
采用Keytruda的PD-L1的人源化IgG4-kappa抗体作为包被抗体，用本试剂 盒的制备方法制成PD-L1检测的制备对比试剂盒，评价其检测血清中PD-L1的能 力与本发明试剂盒的一致性。
选择胃癌患者样本56例和正常人样本59例组成试验样本115例。
符合率及其置信区间见下表所示。
表3符合率及其置信区间
Figure BDA0002876208700000181
表4对称的测量
Figure BDA0002876208700000182
a.未使用虚无假设。
b.正在使用具有虚无假设的渐近标准误。
一致性系数Kappa(K)值为：1.000。
2.3回归分析
a.考核***每个样本测定值与相对应的对比***测定值作散点图(以考核 ***-评价试剂盒作Y轴，对比可试剂盒作X轴)进行回归分析。
b.相关性分析
表5相关性分析
Figure BDA0002876208700000183
**.相关性在0.01层上显著(双尾)。
由图2和SPSS输出表格可以看出，两种试剂检测结果的相关系数为0.997， 对相关系数进行的假设检验的结果为P＜0.05，表明两种试剂检测结果之间有直 线相关关系；相关系数r接近最大的可能值1，表明两种试剂检测结果间具有很 强的相关性。
c.两种试剂的回归方程及方程斜率b的95％置信区间
表6b的95％信赖区间
系数a
Figure BDA0002876208700000191
a.应变数\:对比试剂测值
由SPSS输出的上图可以看出临床试验试剂盒检测结果与对比试剂检测结果 之间的回归方程为Y＝1.008X-0.923，方程斜率b在95％置信区间内。
本发明程序性死亡配体1(PD-L1)化学发光检测试剂盒与对照试剂盒检测 能力一致，说明本发明PD-L1单抗与Keytruda的PD-L1的人源化IgG4-kappa抗 体结合血清中游离PD-L1蛋白的能力一致，PD-L1检测试剂盒可以作为的 PD-1/PD-L1通路靶向药物的监测工具。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
Figure RE-RE-GDA0003484186440000201
/>
Figure RE-GDA0003484186440000211
/>
Figure RE-GDA0003484186440000221
/>
Figure RE-GDA0003484186440000231
/>
Figure RE-GDA0003484186440000241
/>
Figure RE-GDA0003484186440000251
/>
Figure RE-GDA0003484186440000261
/>
序列表
<110> 北京普若维生物技术有限公司
<120> 一种PD-L1单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn
20 25 30
Leu Gly Gly Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr
35 40 45
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Ser Leu Ile
50 55 60
Tyr Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
65 70 75 80
Ala Leu Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala
85 90 95
Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Arg Asp Ser Ser Asn Ala
100 105 110
Gly Ser Val Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Ser
115 120 125
Ser Arg Ser Ser
130
<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Ser Leu Ile Tyr Asp
85 90 95
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Lys Asn Asp Asp Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Thr Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Gly Thr Thr Leu
1 5
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Ala Leu Thr Gln Pro
20 25
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr
1 5 10 15
Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Ser Leu Ile Tyr
20 25 30
<210> 8
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Ala Leu Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln
1 5 10 15
Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Arg Asp Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Gly Ser Val Phe Gly
35
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Thr Val Lys
1
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr Gln Gln Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val
1 5 10
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu
1 5
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile Met
1 5 10 15
Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
20 25 30
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp
1 5 10
<210> 15
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60
gcggccctga ctcagccgtc ctcggtgtca gcaaacctgg gaggaaccgt caagatcacc 120
tgctccgggg gtagtggcag ctacggctgg tatcagcaga aggcacctgg cagtgcccct 180
gtcagtctga tctatgacaa caccaacaga ccctcggaca tcccttcacg attctccggt 240
gccctatccg gctccacagc cacattaacc atcactgggg tccaagccga ggacgaggct 300
gtctattact gtgggagcag ggacagcagt aatgctggtt ctgtatttgg ggccgggaca 360
accctgaccg tcctaggtca gtcctct 387
<210> 16
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatatca tgatgtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct atttatccta gtggtggtat cacattctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgaatcaag 300
cttggtaccg tcacgacagt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgacatgtgc tabcatgctg ctcctgg 27
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccctcgaggc ggccgcctag atcctctttc 30

Claims (8)

1.一种PD-L1单克隆抗体，其特征在于，
PD-L1单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
PD-L1单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的PD-L1单克隆抗体，其特征在于，
PD-L1单克隆抗体的重链高变区CDR-H1、重链高变区CDR-H2、重链高变区CDR-H3、重链框架区FR-H1、重链框架区FR-H2、重链框架区FR-H3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的PD-L1单克隆抗体，其特征在于，
PD-L1单克隆抗体的重链可变区387bp(5’-3’)的核酸序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的PD-L1单克隆抗体，其特征在于，
PD-L1单克隆抗体的轻链高变区CDR-L1、轻链高变区CDR-L2、轻链高变区CDR-L3、轻链框架区FR-L1、轻链框架区FR-L2、轻链框架区FR-L3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的PD-L1单克隆抗体，其特征在于，
PD-L1单克隆抗体的轻链可变区360bp(5’-3’)的核酸序列为SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
6.一种PD-L1检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1~5任一所述的PD-L1单克隆抗体。
7.一种如权利要求6所述的PD-L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将PD-L1单克隆抗体用缓冲液稀释，加入链霉亲和素磁珠反应；
清洗缓冲液；
加入含胎牛血清的PBS封闭液，反应后进行磁性分离，去除上清液；
用缓冲液清洗后，磁粒悬于含牛血清白蛋白的PBS的保存缓冲液中，制成PD-L1包被磁珠；
用PD-L1蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成PD-L1校准品；
将PD-L1多克隆抗体加入吖啶酯溶液，避光反应；
反应完毕后取出，加入赖氨酸盐溶液，继续避光反应；
纯化，得到PD-L1吖啶酯标抗体；PD-L1包被磁珠、PD-L1校准品和PD-L1吖啶酯标抗体共同组成PD-L1检测试剂盒。
8.一种如权利要求6所述的PD-L1检测试剂盒在制备诊断非小细胞肺癌临床辅助、评估PD-L1靶向药物疗效检测试剂盒中的应用。
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