CN104861062A - 高致病性禽流感病毒h5n1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒 - Google Patents
高致病性禽流感病毒h5n1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了高致病性禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，该试剂盒有含有筛选出的特定的单链抗体、包被有单链抗体的酶联板、Eu3+标记的抗体等，本试剂盒具有敏感性高、快速、简便、易于推广的优点，可及时检测人、禽类、动物及外环境样本中存在的H5N1病毒，首先可有效的防治H5N1病毒在禽类之间互相传播而导致的大规模禽类感染事件，减少了禽类养殖人员的经济损失，也避免了人们产生不敢食用禽类的恐慌心理。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及时间分辨免疫荧光检测，具体为一种高致病性禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒。
背景技术
高致病性禽流感H5N1病毒是一种对人危害大、致死率高的病毒。它是禽流感病毒中的一种亚型，主要发生在禽类，也可发生在哺乳类动物，在人间主要是散发病例。人类通过接触带毒的病、死禽***物、分泌物、或其***物、分泌物污染的环境或物品而感染，带毒的分泌物或***物通过空气飞沫播散，悬浮于空气中成为气溶胶，经消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等途径传播到人。感染了H5N1病毒的患者起病急、病情发展迅速、早期表现虽然类似普通型流感、但后期往往伴随有肺部疾病，难以治愈。
时间分辨荧光免疫分析技术（Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是一种新型的体外超微量分析定量技术，它采用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为90年代后非放射性免疫分析发展的一个新里程碑。
目前，检测H5N1病毒方法主要有：荧光定量PCR检测病毒核酸、ELISA方法检测病毒颗粒或者抗病毒抗体、胶体金检测试剂、血凝抑制(HI)试验检测抗血凝素(HA)抗体、琼脂免疫扩散(AGP)试验检测抗核蛋白的抗体、病毒中和、补体结合、神经氨酸酶抑制和单辐射溶血等方法。
针对H5N1病毒的检测技术，国内外发展最完善的技术是用实时荧光定量PCR检测病毒的核酸，该方法具备敏感、准确等优势，是大型实验室最常用的H5N1病毒检测方法。在用ELISA技术检测H5N1病毒方面，国内大部分产品是检测血清中抗H5N1病毒的抗体，如深圳绿诗源生物科技公司和上海研域化学试剂有限公司生产的禽流感H5N1 ELISA抗体诊断试剂盒，是将浓缩后的抗原包被微孔板，应用间接ELISA原理检测血清中的抗禽流感H5N1亚型的抗体。杨涛等人将禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NS1蛋白原核表达，将表达后的融合蛋白MBP-NS1作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，可为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定基础等。李永清等人还申请了“禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法”的国家发明专利。国外有多家生物公司生产H5N1病毒的检测试剂盒，如Sino Biological公司生产的H5N1病毒HA蛋白的配对ELISA检测试剂盒，是将抗H5N1病毒HA蛋白的单抗包被酶联板，以双抗夹心ELISA法为检测原理，生物素-链亲和素检测体系检测待检样品中HA蛋白，从而判定H5N1病毒的存在。日本的Ohnishi K等人，将纯化的灭活A/Vietnam/1194/2004 H5N1毒株免疫小鼠制备单克隆抗体，从4000个杂交瘤中筛选到8株能特异结合H5N1病毒的克隆，其中6个克隆在体外具备HA的中和活性，有4株具备与H5N1所有簇的结合活性，应用这些抗体建立的抗原夹心ELISA法，可以实现快速特异的检测H5N1病毒。德国Shehata AA等人将截短的H5亚型的HA多肽在毕赤酵母中表达，以表达的多肽为间接ELISA的检测试剂，检测禽等体内的H5抗体，该法与商品化的ELISA试剂及血抑方法比较，灵敏度和特异性都达到100%。
上述每种方法都有一定的缺陷，如荧光定量PCR检测技术虽然最灵敏，但成本高，操作要求复杂，不容易推广。胶体金检测试剂存在敏感度低等缺点。AGP、HI和病毒中和等结果准确，但都需要制备纯化、浓缩完整的病毒作为检测抗原，而H5N1病毒是高致病性病毒，需在P3实验室完成（生物安全防护三级实验室），不易生产、纯化、成本较高，且存在感染性和容易散毒，在应用中存在很大的局限性。此外机体感染H5N1病毒，第10天后开始出现保护性抗体，检测抗体不能达到早期检出病毒的目的。
发明内容
本发明的目的是建立一种敏感性高、快速、简便、易于推广的、以检测人、禽类、动物及外环境样本中存在的H5N1病毒的时间分辨荧光免疫检测试剂盒。
本发明的目的在于提供一种高致病性禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于检测禽流感病毒H5N1的单链抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
进一步的，编码上述单链抗体氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
一种禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的单链抗体。
进一步的，上述试剂盒中含有包被有单链抗体的酶联板，所述单链抗体为上述所述的单链抗体。
进一步的，上述试剂盒中还含有Eu3+标记的抗体，所述抗体为上述所述的单链抗体。
进一步的，上述试剂盒中还含有洗涤液、分析缓冲液、增强液、H5N1病毒参考标准品。
进一步的，上述分析缓冲液中含有50mmol/L pH 7.8 Tris-HCl、0.9g/L NaCl、0.02%w/v BSA、0.05%v/v Tween-20和0.05%w/v NaN3，余量为水。
进一步的，上述洗涤液中含有0.9%w/v NaCl的50mmol/L的Tris-HCl浓缩液，按照1：25倍稀释使用。
进一步的，上述H5N1病毒参考标准品为分别含有0、0.05、0.5、5、50、500ng/ml H5N1病毒抗原的溶液。
一种禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测方法，用上述所述的试剂盒进行检测，具体包括下列步骤：将包被有单链抗体的酶联板可加入H5N1病毒标准品或者待测样品，再加入分析缓冲液室温震荡反应，洗涤液洗涤后加入用分析缓冲液按1：（50～100）体积比稀释的Eu3+标记抗体100～200μl/孔，室温震荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测，即可，该检测方法用于非疾病的检测和治疗。
本发明的有益效果是：
本试剂盒具有敏感性高、快速、简便、易于推广的优点，可及时检测人、禽类、动物及外环境样本中存在的H5N1病毒，首先可有效的防治H5N1病毒在禽类之间互相传播而导致的大规模禽类感染事件，减少了禽类养殖人员的经济损失，也避免了人们产生不敢食用禽类的恐慌心理。其次，如果知道禽类带毒，人们就会采取一定的防护措施，尽量不接触带毒禽类，降低了人类被H5N1感染的风险，从而节约了由此产生的医疗费用和大量的人力、物力开支，也减少了人们担心被感染的的忧虑和恐慌。
附图说明
图1为 SDS-PAGE电泳检测表达的噬菌体抗体A1、A10、B9、F11；
图2 为H5N1-TRFIA标准曲线。
具体实施方式
一种用于检测禽流感病毒H5N1的单链抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
优选的，编码上述单链抗体氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
一种禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的单链抗体。
优选的，上述试剂盒中含有包被有单链抗体的酶联板，所述单链抗体为上述所述的单链抗体。
更优选的，上述试剂盒中含有包被有单链抗体的酶联板，所述单链抗体为SEQ ID NO：3所示的单链抗体。
优选的，上述试剂盒中还含有Eu3+标记的抗体，所述抗体为SEQ ID NO：4所述的单链抗体。
更优选的，上述试剂盒中还含有Eu3+标记的抗体，所述抗体为上述所述的单链抗体。
优选的，上述试剂盒中还含有洗涤液、分析缓冲液、增强液、H5N1病毒参考标准品。
优选的，上述分析缓冲液中含有50mmol/L pH 7.8 Tris-HCl、0.9g/L NaCl、0.02%w/v BSA、0.05%v/v Tween-20和0.05%w/v NaN3，余量为水。
优选的，上述洗涤液中含有0.9%w/v NaCl的50mmol/L的Tris-HCl浓缩液，按照1：25倍稀释使用。
优选的，上述H5N1病毒参考标准品为分别含有0、0.05、0.5、5、50、500ng/ml H5N1病毒抗原的溶液。
一种禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测方法，用上述所述的试剂盒进行检测，具体包括下列步骤：将包被有单链抗体的酶联板可加入H5N1病毒标准品或者待测样品，再加入分析缓冲液室温震荡反应，洗涤液洗涤后加入用分析缓冲液按1：（50～100）体积比稀释的Eu3+标记抗体100～200μl/孔，室温震荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测，即可，该检测方法用于非疾病的检测和治疗。
本发明的主要研究思路如下：
1）抗人禽流感病毒H5N1单链抗体噬菌体文库的构建
利用基因工程技术，从被禽流感病毒H5N1感染过的人禽流感康复患者的外周血淋巴细胞中，提取总mRNA，RT-PCR扩增抗禽流感H5N1抗体的轻重链可变区基因，克隆抗体基因片段到噬菌粒载体上，使抗体片段以融合蛋白的形式表达在噬菌体的外壳蛋白中，形成一个汇集针对H5N1病毒的抗体库，测定文库的重组率和库容。
2、抗H5N1病毒标准株抗体的筛选和制备
从上述构建的抗人禽流感病毒H5N1单链抗体文库和大容量人单链scFv抗体库中，以亲和吸附为原理，以灭活的人禽流感病毒H5N1标准株为靶蛋白，经过2-3轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得能特异结合灭活H5N1病毒标准株的单链抗体分子，将噬菌体呈现的scFv分子进行可溶性表达，排除噬菌体载体对抗体分子活性的影响，纯化分离抗体，序列测定，抗体分子与病毒结合的特异性检测，抗体分子与无关蛋白和类似灭活病毒的非特异性结合活性检测，抗体分子效价测定等。
3、双抗夹心ELISA法的建立及检测条件的优化
通过抗体配对实验：粗配对和精确配对实验筛选能在双抗夹心ELISA中应用的scFv抗体分子。优化双抗夹心ELISA检测条件：确定包被抗体和检测抗体浓度，确定洗涤液、洗涤强度和反应条件。
4、TRFIA-ELISA方法的建立及评估
待标抗体分子的预处理，通过蛋白连接技术将镧系元素铕标记抗体分子，标记抗体分子的纯化、及浓度和抗原结合活性的鉴定，建立单标记的时间分辨免疫荧光法模式，确定检测性能指标包括：标准曲线绘制、精密度测定、灵敏度和特异性分析、稳定性测试等。对试剂盒进行各项性能评价并进行阴阳性样本的考核试验。大规模生产检测试剂盒。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 抗人禽流感病毒H5N1单链抗体的制备
（1）抗人禽流感病毒H5N1单链抗体噬菌体文库的构建
1）总RNA的分离：从禽流感H5N1愈后病人的10mL全血中，应用血液RNA提取试剂盒（Qiagen Corp）提取人总RNA。
2）合成人IgG轻、重链基因的cDNA第一链：以上步提取的RNA为模板，为了增加扩增的特异性，选用逆转录引物（HuIgG1-4H1FOR、HuCkFOR和HuCλFOR）特异性扩增获得人IgG1恒定区和轻链k、λ恒定区的cDNA第一链。
上述逆转录引物引序列为：
HuIgG1-4H1FOR：5'-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3'（SEQ ID NO：9）；
HuCkFOR：5'-AGA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT-3'（SEQ ID NO：10）；
HuCλFOR：5'-TGA AGA TTC TGT AGG GGC CAC TGT CTT-3'（SEQ ID NO：11）。
3）抗体可变区VH、VL基因PCR扩增：以上步获得的cDNA为模板，设计引物扩增人VH、VL基因，将PCR扩增产物进行电泳检测，分别取约350 bp和320 bp的DNA条带进行纯化，分别获得VH、VL基因片段库。
4）VH 和VL拼接得scFv基因片段
将VH 、VL基因片段通过连接子进行PCR拼接，获得VH -连接子-VL基因片段，即单链抗体（single chain Fv，scFv）基因片段。
上述连接子的基因序列为：5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTTCTGGCGG
TGGCGGATCG-3'（SEQ ID NO：12）。
5）重组载体及重组菌的构建
将上述获得的scFv基因片段与噬菌体载体pCANTAB5E进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌TG1，获得抗H5N1的单链抗基因库。
6）抗H5N1单链抗体噬菌体库的构建
将步骤5）中获得的重组大肠杆菌TG1加入2×YT-G培养基，混匀培养1 h，补氨苄、葡萄糖、辅助噬菌体M13KO7共培养1 h，5 000 r/min离心10 min沉淀感染细菌，用无菌生理盐水洗涤一次，最后用10 mL 2×YT-AK培养基悬浮，37 ℃，250 r/min培养过夜，将过夜菌5 000 r/min离心10 min沉淀菌体细胞，加入1 mL的2×YT培养液溶解沉淀，0.45 μm膜过滤，滤液即为抗H5N1噬菌体单链抗体库，4 ℃放置备用。
（2）抗人禽流感病毒H5N1单链抗体的筛选
用禽流感H5N1抗原蛋白 HA/NP包被ELISA板，对上述噬菌体单链抗体库进行筛选，结果发明，13个与HA蛋白有结合活性噬菌体抗体库OD值为0.243~0.827，13个与NP蛋白有结合活性噬菌体抗体库OD值为0.226~2.663。以上结果表明, 本实验构建的抗人禽流感病毒H5N1的人源scFv噬菌体抗体库，可以筛选出有效表达与禽流感H5N1 HA/NP蛋白特异性结合的可溶性单链抗体（scFv）。
为了保证本发明所制备的抗体能特异结合最新流行的禽流感毒株，本实验以灭活的、滴度为1：32的2010年的H5N1标准株（A/Hubei/1/2010）为靶蛋白，去筛选抗H5N1噬菌体单链抗体库，经过3轮筛选，从用第3轮洗脱液铺的平皿上随机挑选96个噬菌体抗体，扩大培养，用ELISA方法检测与Hubei/2011/H5N1的结合活性，结果显示共筛选到14株噬菌体抗体克隆能与灭活的Hubei/2011/H5N1特异结合。
对上述筛选到的14株阳性噬菌体克隆进行PCR扩增，结果显示每一种抗体分子都扩增到了长度为527bp的重链基因、368bp的轻链基因和935bp的轻链－连接子－重链的基因片段，说明筛选到的阳性噬菌体抗体克隆都***了正确的重组抗体分子片段。测序结果显示14株抗体序列中共包括了4条不同序列的单链抗体片段A1、A10、B9和F11。
请给出抗体片段A1、A10、B9和F11的完整氨基酸序列。
对筛选到的单链抗体片段A1、A10、B9和F11这4个阳性单链抗体（scFV）分子进行***片段的全序列测定，单链抗体片段A1、A10、B9和F11的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示，A1、A10、B9和F11的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。通过对序列的分析发现这4条单链抗体片段，在轻链的两个抗原表位47-56位和96-99位的氨基酸组成不同，在重链的两个抗原表位44-47位和85-89位的氨基酸组成不同。（如表1所示）。
表1本发明4个单链抗体（scFV）的重链、轻链氨基酸的区别
4）单链抗体的诱导表达及验证
1. SDS-PAGE实验
1）用阳性噬菌体液10μl侵染200 μl对数期的TG1菌(A600是0.4)，37 ℃放置30 min,将菌液按照1∶102、1∶104和1∶106比例进行稀释，涂布50 μl稀释液于TYE平板上（含100 μg/ml ampicillin 和1 % glucose）37 ℃过夜培养生长；
2）接种单克隆于5ml 2×TY（含100 μg/ml ampicillin和1 % glucose），37 ℃，250 r/min 摇床中生长到A600 为0.4；
3）加入5×1010辅助噬菌体于10 ml上述培养液中，37 ℃水浴30 min，5,000rpm离心10 min，重悬沉淀于200 ml的2×TY（含100 μg/ml ampicilli、50 μg/ml kanamycin和0.1 % glucose），30℃，250 r/min摇床过夜培养；
4）5,000rpm离心过夜菌液15 min，收集上清加入体积比为20 %的PEG/NaCl (Polyethylene glycol 6000, 2.5 mol/L NaCl)振荡混匀，冰浴1 h。
5）5,000rpm离心30 min，弃上清，用2 ml PBS重悬沉淀，12,000rpm离心10 min，收集上清为扩增到的阳性噬菌体抗体克隆，用SDS-PAGE电泳检测表达的抗体。
检测结果如图1所示，从中可以看出4种阳性噬菌体中均能表达相应的抗体蛋白，分子量约为31kDa，大小与预期相符合。
2.噬菌体单链抗体分子抑制血清中抗H5N1抗体与灭活H5N1抗原的结合活性
1）抗H5N1抗体的阳性血清的稀释，在血凝板的每孔中加入25ul PBS，加入25ul的抗H5N1抗体的阳性血清，做2倍系列稀释血清，共做8个稀释度。
2）灭活抗原处理，稀释灭活的A/Hubei/1/2010的H5N1标准株为4个血凝单位抗原，按1:1的浓度分别与噬菌体单链抗体（A1、A10、B9和F11）溶液混合，37 ℃作用30min。
3）免疫反应，将25ul抗原抗体混合液加入血清孔中，混匀后室温孵育20min，每孔加入50ul 1%公鸡红细胞悬液，轻弹血凝板，是红细胞与病毒充分混合。同时每个孔设置阳性对照（25ul抗原）和阴性对照（25ul噬菌体抗体溶液）
4）室温孵育60min后，观察红细胞凝集抑制实验，发现噬菌体单链抗体A1、A10、B9和F11使阳性血清对H5N1抗原的抑制效价从1:160分别提高到1:640、1:320、1:1280和1:640，噬菌体单链抗体（A1、A10、B9和F11）结合了抗原的活性位点，从而部分抑制了抗原与血清中阳性抗体的结合活性。
实施例2 高致病性禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒
H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒含有以下成分：
1）抗H5N1单链抗体
抗H5N1单链抗体选自上述实验例1中所述的单链抗体A1（SEQ ID NO：1）、A10（SEQ ID NO：2）、B9（ SEQ ID NO：3）和F11（SEQ ID NO：4）中的一种。
2）包被抗体的酶联板
用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗体 B9（也可以选用A1、A10、或F11）稀释成1～5μg/ml，然后100μl/孔加入到Elisa板的每个板孔中，4℃过夜，倾去包被液，加入封闭液，200μl/孔，封闭过夜，倾去包被液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存。
3）Eu
3+
标记的抗体
将0.5mg抗体F11（也可以选用A1、A10、或B9）加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中，8000r/min离心6min。再用标记缓冲液（50mmol/L，NaCO3，pH 9.0）重复洗涤6次。将200μl标记抗体F11和50μg铕标记试剂充分混匀，室温震荡过夜。标记完成后用Sephadex G-50层析柱分离纯化，洗脱液（含0.9%w/v NaCl的50mmol/L的Tris-HCl）洗脱，同时收集流出液（1ml/管），逐管测量吸光度（A280），合并峰管，测定蛋白含量，根据Eu3+标记试剂盒说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。
4）参考标准品
用含0.2%w/v BSA，0.1% w/v NaN3，50mmol/L的Tris-HCl（pH 7.8）的标准品缓冲液将H5N1病毒抗原稀释成0，0.05，0.5，5，50，500ng/ml作为系列参考标准溶液，每瓶1ml分装，4℃保存备用。
5）分析缓冲液
分析缓冲液中含有50mmol/L pH 7.8 Tris-HCl、0.09%w/v NaCl（即0.9g/L NaCl）、0.02%w/v BSA、0.05%v/v Tween-20和0.05%w/v NaN3，余量为水。
6）洗涤液
洗涤液中含有0.9%w/v NaCl的50mmol/L的Tris-HCl浓缩液，按照1：25倍稀释使用。
7）增强液
增强液购自Perkin Elmer公司。
实施例3 高致病性禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测的方法
本发明采用实施例2中所述的试剂盒定量检测H5N1病毒，检测的操作步骤为：向包被抗体的酶联板上加入25μl/孔参考标准品或者待测样品，再加入200μl/孔分析缓冲液，震荡温育1h，，洗涤液洗涤4次，再加入用分析缓冲液按1：（50～100）体积比稀释的Eu3+标记抗体200μl/孔，震荡温育1h，。洗涤液洗涤6次，最后加入增强液（购自Perkin Elmer公司）200μl/孔震荡5min后在时间分辨荧光检测仪上进行检测。
下面对上述实施例中制备的试剂盒进行效果的检测。
实施例4 H5N1的时间分辨荧光免疫检测的标准曲线
H5N1-TRFIA标准曲线，见附图2，其相关系数R 2 =0.999，表明线性相关性良好。以零参考标准品作为标本重复测量20次，计算其荧光均值x及标准差s，x+2s所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出其灵敏度达到 0.02ng/ml。
实施例5 特异性实验
选取多个与H5N1类似的病毒或者可能与H5N1同时出现的蛋白，当作样品，用本发明试剂盒测定，检测结果如表2所示，本试剂盒测定高浓度H5N7、H7N9、H9N2、H7N7蛋白时，测定浓度均远低于理论浓度，说明本发明方法和试剂盒对的H5N1的特异性高，不会受H5N7、H7N9、H9N2、H7N7等类似病毒的影响。
表2 特异性实验
实施例6 精密度实验
采用本发明试剂盒对精确定量的高中低三个标准品浓度进行测定（见表3），各设置10个复孔。检测结果如表3所示，从中可以看出本发明试剂盒的批内变异系数和批间变异系数均≤10%，符合试剂盒规定要求。
表3精密度实验检测结果
实施例7精确度实验（回收实验）
按照常规方法进行回收实验，加标回收率，指在没有或低浓度被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值，结果见表4，高中低三个浓度的回收率在100.44~101.24%之间，平均回收率为100.8%。
表4回收实验结果
实施例8健全性实验
把高浓度的H5N1病毒样品按照1：（2～64）比例稀释后用本发明试剂盒测定，换算后的H5N1病毒含量非常接近。用上述比例稀释的病毒样品代替H5N1病毒参考标准品绘制标准曲线，其斜率与标准品的标准曲线斜率基本一致，表明本发明检测H5N1的方法和试剂盒具有良好的健全性。
实施例9临床应用实验
取南方医科大学珠江医院门诊332例流感病人血清，其中15例为确诊的H5N1病毒感染者，但检测时并未标出H5N1感染样本和普通流感样本。
具体检测步骤：取实施例2中所述试剂盒中包被好的酶联板，加入25μl参考标准品或者待测血清，再加入200μl分析缓冲液，震荡温育1h，，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50稀释的Eu3+标记抗体200μl/孔，震荡温育1h，。洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200μl/孔震荡5min后在时间分辨荧光检测仪上进行检测。
结果示检测出14例阳性样本与确诊的H5N1病毒感染者相符，2例阳性样本实际为普通流感样本，阳性检测准确率为93.3%。
实施例10临床应用实验
取一养鸡场的90只经检验合格的健康肉鸡的血清样本，标记备用；取168只发热、呼吸困难、食欲不振等症状的病鸡的血清样本，分别标记备用。
具体检测步骤：同实施例9。
结果显示90个健康肉鸡H5N1阳性样本个数为1，阴性样本个数为89，检测准确率为98.9%；168个病鸡H5N1阳性样本个数为35，阴性样本个数为133；对35个H5N1阳性样本进行荧光定量PCR检测，结果显示全为H5N1阳性；对133个H5N1阴性样本进行荧光定量PCR检测，结果显示有8个H5N1阳性样本，125个H5N1阴性样本，检测准确率为95.2%；总检测准确率为96.5%。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
<110> 广州优迪生物科技有限公司
<120> 高致病性禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒
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Claims (10)
1.一种用于检测禽流感病毒H5N1的单链抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测禽流感病毒H5N1的单链抗体，其特征在于：编码该单链抗体氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
3.一种禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有权利要求1或2所述的单链抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有包被有单链抗体的酶联板，所述单链抗体为权利要求1或2所述的单链抗体。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有Eu3+标记的抗体，所述抗体为权利要求1或2所述的单链抗体。
6.根据权利要求3～5任一所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有洗涤液、分析缓冲液、增强液、H5N1病毒参考标准品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述分析缓冲液中含有50mmol/L pH 7.8 Tris-HCl、0.9g/L NaCl、0.02%w/v BSA、0.05%v/v Tween-20和0.05%w/v NaN3，余量为水。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液中含有0.9%w/v NaCl的50mmol/L的Tris-HCl浓缩液，按照1：25倍稀释使用。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述H5N1病毒参考标准品为分别含有0、0.05、0.5、5、50、500ng/ml H5N1病毒抗原的溶液。
10.一种禽流感病毒H5N1的时间分辨荧光免疫检测方法，其特征在于：用权利要求3~9任一所述的试剂盒进行检测，具体包括下列步骤：将包被有单链抗体的酶联板可加入H5N1病毒标准品或者待测样品，再加入分析缓冲液室温震荡反应，洗涤液洗涤后加入用分析缓冲液按1：（50～100）体积比稀释的Eu3+标记抗体100～200μl/孔，室温震荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测，即可，该检测方法用于非疾病的检测和治疗。
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