CN114989299B - 一种单克隆抗体的组合物及其应用、检测人白细胞介素1β的试剂、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及检测人白细胞介素1β的技术领域，具体公开了一种单克隆抗体的组合物及其应用、检测人白细胞介素1β的试剂、试剂盒和方法。所述组合物包括单克隆抗体IL1β‑3F5和/或单克隆抗体IL1β‑5C9；所述单克隆抗体IL1β‑3F5包括具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链；所述单克隆抗体IL1β‑5C9包括具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链。所述试剂包括所述组合物。所述试剂盒包括所述试剂。本申请具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点。

Description

一种单克隆抗体的组合物及其应用、检测人白细胞介素1β的 试剂、试剂盒和方法
技术领域
本申请涉及检测人白细胞介素1β的技术领域，具体公开了一种单克隆抗体的组合物及其应用、检测人白细胞介素1β的试剂、试剂盒和方法。
背景技术
白细胞介素(interleukin，IL)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确、具有重要调节作用而统一命名的细胞因子。白细胞介素在传递信息、激活与调节免疫细胞、介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
白细胞介素1(IL-1)又名淋巴细胞刺激因子，是一种单体糖蛋白。几乎所有的有核细胞都能分泌该因子，包括单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、树突状细胞和其他类型细胞，主要由活化的单核-巨噬细胞产生。正常情况下只有皮肤、汗液和尿液中含有一定量的IL-1，绝大多数细胞在受到外来抗原或丝裂原刺激后才能合成和分泌IL-1。IL-1主要参与T细胞、NK细胞和巨噬细胞的活化，能刺激集落刺激因子、血小板生长因子等细胞因子的产生，并使T细胞产生白介素-2，在免疫应答和组织修复中起作用。
IL-1有两种存在形式，分别为IL-1α和IL-1β。在人类中，IL-1α和IL-1β由不同的基因表达，两种蛋白的氨基酸序列同源性为21％，但它们能够结合相同的细胞表面受体，发挥同样的生物学功能。IL-1蛋白的异常表达与多种病理状态有关，包括败血症、类风湿关节炎、炎症性肠病、急性和慢性粒细胞白血病、胰岛素依赖性糖尿病、动脉粥样硬化、神经元损伤以及与衰老相关的疾病。
IL-1β在免疫反应、炎症反应、骨重塑、发热、碳水化合物代谢和GH/IGF-I生理机能中起着重要的作用。IL-1β基因位于2号染色体长臂2q14上。前体蛋白含有269个氨基酸分子，分子量约为31KD，几乎没有任何生物学活性。随后在Caspase1(CASP1/ICE)的剪切下，变成成熟IL-1β，成熟IL-1β含有153个氨基酸分子，分子量大小为17.5KD，分泌到细胞外发挥生物学功能。IL-1α和IL-1β都不含有典型的疏水信号肽结构域，但它们能够通过非经典途径进行分泌。因此，了解人白细胞介素1β的含量变化对于了解各种疾病的免疫调节具有重要的意义。然而，本领域中缺乏一种能够以高特异性、灵敏度及稳定性来检测人白细胞介素1β含量变化的手段。
发明内容
为了提高检测人白细胞介素1β的特异性、灵敏度、稳定性，本申请提供一种单克隆抗体的组合物及其应用、检测人白细胞介素1β的试剂、试剂盒和方法。
第一方面，本申请提供一种单克隆抗体的组合物，采用如下技术方案：
一种单克隆抗体的组合物，所述组合物包括单克隆抗体IL1β-3F5和/或单克隆抗体IL1β-5C9；所述单克隆抗体IL1β-3F5包括具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链；
所述单克隆抗体IL1β-5C9包括具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重链、具有可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链。
第二方面，本申请提供一种单克隆抗体的组合物在检测人白细胞介素1β中的应用。
第三方面，本申请提供一种单克隆抗体的组合物在制备用于检测人白细胞介素1β的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
第四方面，本申请提供一种检测人白细胞介素1β的试剂，采用如下技术方案：
一种检测人白细胞介素1β的试剂，所述试剂包括所述单克隆抗体的组合物。
可选的，所述试剂包括单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板、生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9、多聚酶标记的链霉亲和素和显色剂。
可选的，所述单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的制备方法，包括以下步骤：
包被步骤：使用缓冲液将单克隆抗体IL1β-3F5稀释，得到浓度为1～4μg/mL的单克隆抗体IL1β-3F5稀释液；将单克隆抗体IL1β-3F5稀释液加入到酶标板的反应孔中孵育反应并洗板；封闭步骤：封闭酶标板的反应孔底部未被单克隆抗体IL1β-3F5包被的位置。
可选的，所述包被步骤中的所述缓冲液可以选自碳酸盐包被缓冲液和PBS溶液。
可选的，所述包被步骤中所述单克隆抗体IL1β-3F5稀释液的加入量为80～120uL/孔，例如：100uL/孔。
可选的，所述包被步骤中所述孵育反应的温度为4℃。
可选的，所述封闭步骤具体为：向酶标板的反应孔中加入封闭液中孵育反应，甩掉孔内液体后干燥。
可选的，所述封闭步骤中的所述封闭液可以选自5wt％的脱脂奶粉和1wt％的BSA。
可选的，所述封闭步骤中所述封闭液的加入量为200～300uL/孔，例如250uL/孔。
可选的，所述封闭步骤中所述孵育反应的温度为室温。
可选的，所述生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9的制备方法，包括以下步骤：
将单克隆抗体IL1β-5C9用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.0)稀释到1mg/mL；交互用pH＝8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液，对单克隆抗体IL1β-5C9充分透析；
用二甲基亚砜(DMSO，1mL)溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB,1mg)，向1mL单克隆抗体IL1β-5C9溶液中加入10uL的NHSB的DMSO溶液，室温下持续搅拌2～4小时，随后加入1uL的0.1mol/L NH4Cl水溶液，室温下搅拌10分钟。在4℃条件下对上述产物充分透析后，将样品上Sephadex G-25，以PBS缓慢洗脱，收集洗脱峰得到生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9。
可选的，所述多聚酶标记的链霉亲和素的制备方法，包括以下步骤：
将6mg的多聚辣根过氧化物酶溶解于1.5mL双蒸水中，加入0.025mL的新鲜配制的0.1mol/L的高碘酸钠水溶液，室温搅拌20min。向上述反应液中加入乙二醇，作用5min终止反应。用2mmol/L的乙酸钠缓冲液(pH＝4.5)在4℃透析4小时，至少换8次液，然后用0.2mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)调pH＝9.0。加入用0.2mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)配制的6mg链霉亲和素1.5mL，然后室温避光搅拌2小时。滴加0.01mL的新鲜配制的4mg/mL的硼氢化钠水溶液，4℃反应2小时。用pH7.2、0.01mol/L的PBS缓冲液在4℃透析过夜，离心除去沉淀。所得上清即为多聚酶标记的链霉亲和素。
可选的，所述单克隆抗体IL1β-3F5的最佳包被浓度范围(1～4)ug/mL。
可选的，所述单克隆抗体IL1β-5C9的最佳检测抗体工作浓度1:(1000～2000)，最低检出浓度可达pg级水平。
可选的，所述生物素为N-羟基琥珀酰亚胺生物素。
可选的，所述多聚酶为多聚辣根过氧化物酶。
可选的，所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色底物。
可选的，所述试剂还包括人白细胞介素1β标准品。
可选的，所述试剂还包括终止液。所述终止液可以为酸性终止液或碱性终止液。其中，所述酸性终止液可以为2mol/L的HCl水溶液、2mol/L的H2SO4水溶液等。碱性终止液可以为30wt％～40wt％的氢氧化钠水溶液等。
第五方面，本申请提供一种检测人白细胞介素1β的试剂盒，采用如下技术方案：一种检测人白细胞介素1β的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。
第六方面，本申请提供一种检测人白细胞介素1β的方法，采用如下技术方案：
一种检测人白细胞介素1β的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)梯度标准溶液的获得：
将作为标准品的人白细胞介素1β配制成的浓度为(0～20)pg/mL的梯度标准溶液；
(2)梯度标准溶液和检测样本的处理：
首先向单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的反应孔中分别加入所述梯度标准溶液和所述检测样本孵育反应并洗板；然后分别加入生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9孵育反应并洗板；再后分别加入多聚酶标记的链霉亲和素孵育反应并洗板；最后加入显色剂孵育反应并洗板；之后加入终止液终止反应；
(3)待测样本的浓度的获得：
在波长450nm处测定所述梯度标准溶液和所述检测样本的吸光度值；
以所述梯度标准溶液的浓度作为横坐标，以所述梯度标准溶液的吸光度值作为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到所述标准曲线的曲线方程；
根据所述曲线方程，计算出所述待测样本的吸光度值在标准曲线上所对应横坐标的浓度。
可选的，所述梯度标准溶液的浓度可以为0pg/mL、0.3125pg/mL、0.625pg/mL、1.25pg/mL、2.5pg/mL、5.0pg/mL、10.0pg/mL、20.0pg/mL。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
第一、本申请通过单克隆抗体IL1β-3F5和单克隆抗体IL1β-5C9，提高了检测人白细胞介素1β的特异性、灵敏度、稳定性。本申请的试剂盒可以很好的应用于人体血清、血浆、细胞上清中人白细胞介素1β含量的检测。
第二、本申请中试剂盒使用的多聚酶标记链霉亲和素可以提高人白细胞介素1β检测结果的灵敏度，极大地降低检测下限，提高检测样本中微量人白细胞介素1β的检出率。
附图说明
图1为将IL1β基因与PET-28A表达载体连接后的双切酶鉴定结果；
图2为通过SDS-PAGE电泳检测IL1β蛋白质表达情况的SDS-PAGE电泳图；
图3为轻链和重链可变区氨基酸序列；
图4为根据梯度标准溶液的检测结果建立的标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实验所用试剂：HAT培养基(购自Sigma公司)、HT培养基(购自Sigma公司)、RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)、Pen Strep(购自GIBCO公司)、HEPES(购自GIBCO公司)、L-Glutamine(购自GIBCO公司)、羊抗小鼠IgG-HRP抗体(购自Sigma公司)、胎牛血清(购自GIBCO公司)、DMSO(购自Sigma公司)、50％PEG(购自Sigma公司，分子量1450)、总RNA提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)、反转录试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)、DNA聚合酶(北购自京索莱宝科技有限公司)、Eco RI(购自宝生物)、Xho I(购自宝生物)、T4连接酶(购自宝生物)、DH5α(购自北京索莱宝科技有限公司)、质粒小提试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)、表达菌株BL21(购自北京索莱宝科技有限公司)、DNA产物纯化试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)。
实施例1：抗IL1β抗原的单克隆抗体的制备
S1.IL1β基因克隆
S1.1 IL1β基因序列的合成
THP-1细胞培养24h后加刺激物(5wt％十二烷基硫酸钠SLS的水溶液)刺激，收取刺激后细胞样品，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，42℃反应1h，95℃5min后终止反应，以反转录产物cDNA为模板，通过PCR扩增人IL1β基因。
PCR扩增所用引物序列如下：
上游引物：5'-TTTGAATTCGCACCTGTACGATCACTGAACTGC-3'；
下游引物：5'-TTTCTCGAGTTAGGAAGACACAAATTGCATGGT-3'。
PCR仪器(ABI，2720)，PCR程序为：94℃30s、56℃50s、72℃1min，扩增32个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物随后利用引入的双酶切位点Eco RI/Xho I进行双酶切，双酶切产物经DNA产物纯化试剂盒纯化后进行基因重组。
S1.2基因重组：将经过酶切纯化的IL1β基因3μL、PET-28A表达载体1μL、2×ligasebuffer 5μL和T4连接酶1μL混合后置于16℃连接12h，随后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌中，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，重组菌落形成后，挑取单菌落，将单个菌落接种至LB液体培养基中进行培养，培养后离心收集菌体并提取重组质粒；以引入的双酶切位点Eco RI/Xho I进行双酶切鉴定，鉴定结果如图1所示。将阳性质粒转化表达菌株BL21，挑取阳性克隆子培养并测序，取测序结果正确的表达菌株进行后续诱导表达IL1β蛋白。
S2.IL1β蛋白的表达纯化
将构建好的测序结果正确的重组表达菌株进行37℃1mmol/L的IPTG诱导表达，收取分别诱导3h、4h和5h的诱导表达样品，同时做空载体菌株对照。通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，结果如图2所示。确定蛋白质表达后，超声波破碎菌体，将上清液和沉淀分开，通过SDS-PAGE检测蛋白质的具体表达形式。检测结果表明蛋白质以不溶性的包涵体形式表达。将包涵体复性处理并纯化，得到目的蛋白。
S3.免疫动物
以上述制备的IL1β蛋白为抗原对雌性BALB/c鼠进行初次免疫：IL1β蛋白溶液采用等体积的弗氏完全佐剂乳化，乳化后向小鼠背部皮下四点注射；4周后进行第二次免疫，换用弗氏不完全佐剂乳化抗原，乳化后向小鼠背部皮下四点注射；3周后进行第三次免疫，继续使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，乳化后向小鼠背部皮下四点注射；1周后采集小鼠尾血，测定血清中的抗体效价，未达到融合要求时继续进行免疫，直至血清效价升高达到融合要求。在融合前三天通过腹腔注射抗原进行加强免疫。
S4.细胞融合
S4.1骨髓瘤(SP2/0)细胞活化
解冻并复苏市购SP2/0细胞，随后重悬于细胞培养液(RPMI-1640，添加胎牛血清)中，置于37℃、5％CO2条件下培养箱培养；细胞长至培养皿底面积80％左右时进行传代。
收集细胞并悬浮于1640基础液中，计数后取(0.5～1)×106个细胞注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9～10d且待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75％酒精浸泡5min后无菌操作取瘤。
剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加1640基础液充分研磨后补加10mL 1640基础液，静置2min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL的1640基础液，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000r/min离心10min去上清，随后重悬于30mL 1640基础液中。
于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200r/min离心15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用1640基础液清洗细胞2遍后重悬于10mL 1640基础液中，计数后备用。
S4.2免疫脾细胞的制备
取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75％酒精中浸泡5～10min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。
S4.3饲养细胞的制备
取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2～3mL的1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000r/min离心10min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃、5％CO2培养箱中待用。
S4.4细胞融合及选择性培养
将(1～2)×107个SP2/0与108个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000r/min，离心8min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50wt％的PEG0.8mL，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的1640基础液30mL。混匀后1000r/min离心5min，弃上清于37℃放置5～8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，150uL/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4且培养基略变黄时进行抗体检测。检测前一天进行换液处理，以降低假阳性结果。
S5.杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
S5.1用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
包被已知抗原：用包被缓冲液(pH＝9.6的0.05mol/L碳酸缓冲液)将纯化的包被用抗原稀释至1～5ug/mL，加入到酶标板中，100uL/孔，4℃过夜孵育，甩掉孔内液体并洗板1次。
封闭酶标板孔底部未被抗原包被的位置：向板孔中加入封闭液(5wt％的脱脂奶粉或者1wt％的BSA)，250uL/孔，室温孵育2h；甩掉孔内液体并洗板3次。
加样：将待测的杂交瘤每孔取50uL上清液按顺序加入酶标板中，37℃孵育1h，甩掉孔内液体并洗板4次，拍干。
二抗：加入HRP标记羊抗小鼠IgG，用稀释液将酶标二抗按说明稀释至工作浓度，100uL/孔，37℃孵育30min，甩掉孔内液体并洗板4次，拍干。
显色：加入TMB显色液，100uL/孔，37℃孵育10min。
终止：加入终止液，50uL/孔。
结果：用酶标仪读取OD450吸光值，读值越高，说明阳性结果越强。
S5.2杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)
克隆前制备小鼠饲养细胞层；选取阳性孔杂交瘤细胞进行亚克隆，将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用细胞计数板对细胞进行计数；取50～70个细胞加入到5mL完全培养基中，将该5mL细胞悬液转移至96孔板中，100uL/孔，每株阳性细胞共转移半块96孔板。培养到第4天补液一滴，第5～6天仔细观察各孔内细胞的生长情况并记录。
特异性抗体的检测：在克隆后第7～9天、细胞克隆长至孔底面积1/3～1/2时即可检测，检测前一天进行换液处理，检测过程同阳性杂交瘤细胞筛选过程一致。
杂交瘤细胞定株：上述检测为阳性孔的杂交瘤细胞可继续通过有限稀释法进行亚克隆，重复亚克隆3次，得到单克隆阳性细胞株，即为定株细胞。
S6.单克隆抗体的大量制备
将上述筛选定株后的细胞株进行扩大培养，待细胞生长良好时，腹腔接种小鼠制备腹水，收集腹水，用间接ELISA测定效价，随后对腹水进行纯化，得到单克隆抗体。
S7.单克隆抗体IL1β-3F5与IL1β-5C9可变区序列测定
提取杂交瘤细胞总RNA：采用总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作分别提取两株细胞的总RNA；
合成cDNA：采用反转录试剂盒合成cDNA第一条链；
PCR克隆可变区序列：根据美国国家生物技术信息中心(GenBank)中小鼠抗体序列的保守位点设计引物，以cDNA为模板扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为94℃30s、56℃50s、72℃1min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过琼脂糖凝胶回收连接在T载体上，挑取阳性转化子，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。其中引物序列分别为：重链可变区序列5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWG-3’和5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCC-3’，其中S、M、R、W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’和5’-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3’。
得到基因测序结果：3F5细胞株重链可变区序列长339bp，编码113个氨基酸，序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区序列长321bp，编码107个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。5C9细胞株重链可变区序列长345bp，编码115个氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区序列长309bp，编码103个氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2：检测人白细胞介素1β的试剂
单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板包被：用碳酸盐包被缓冲液或PBS溶液将IL1β-3F5稀释至1～4μg/mL加入到酶标板中，100uL/孔，4℃过夜孵育，甩掉孔内液体并洗板1次。
封闭：封闭酶标板孔底部未被抗体包被的位置，向板孔中加入封闭液(5wt％的脱脂奶粉或1wt％的BSA)，250uL/孔，室温孵育2h，甩掉孔内液体后将酶标板进行干燥，在干房中过夜干燥，随后抽真空，4℃保存。
生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9
将纯化后的单克隆抗体IL1β-5C9用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.0)稀释到1mg/mL；交互用pH＝8.0、0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液，对单克隆抗体IL1β-5C9充分透析；
用二甲基亚砜(DMSO，1mL)溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB,1mg)，向1mL单克隆抗体IL1β-5C9溶液中加入10uL的NHSB的DMSO溶液，室温下持续搅拌2～4小时，随后加入1uL的0.1mol/L NH4Cl水溶液，室温下搅拌10分钟。在4℃条件下对上述产物充分透析后，将样品上Sephadex G-25，以PBS缓慢洗脱，收集洗脱峰，将生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9置于-20℃保存。
多聚酶标记的链霉亲和素
将6mg的多聚辣根过氧化物酶溶解于1.5mL双蒸水中，加入0.025mL的新鲜配制的0.1mol/L的高碘酸钠水溶液，室温搅拌20min。向上述反应液中加入乙二醇，作用5min终止反应。用2mmol/L的乙酸钠缓冲液(pH＝4.5)在4℃透析4小时，至少换8次液，然后用0.2mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)调pH＝9.0。加入用0.2mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)配制的6mg链霉亲和素1.5mL，然后室温避光搅拌2小时。滴加0.01mL的新鲜配制的4mg/mL的硼氢化钠水溶液，4℃反应2小时。用pH7.2、0.01mol/L的PBS缓冲液在4℃透析过夜，离心除去沉淀。所得上清即为多聚酶标记的链霉亲和素，置于-20℃保存。
显色剂
显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色底物。
实施例3：检测人白细胞介素1β的方法
本实施例应用双抗夹心酶联免疫分析法测定人血清样本中白细胞介素1β的水平。
检测人白细胞介素1β的方法，包括以下步骤：
(1)梯度标准溶液的获得：
将作为标准品的人白细胞介素1β配制成的梯度标准溶液，梯度标准溶液的浓度分别为20pg/mL、10pg/mL、5pg/mL、2.5pg/mL、1.25pg/mL、0.625pg/mL、0.312pg/mL、0pg/mL。
(2)梯度标准溶液和检测样本的处理：
酶标板在使用前洗板3次，将梯度标准溶液分别加入酶标板的反应孔中，100uL/孔，同时将待检样品加入到酶标板的反应孔中，100uL/孔；之后，37℃孵育90min，然后甩干孔内液体并洗板4次。同时做空白孔和阴性对照孔。
向单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的反应孔中分别加入生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9的工作液(经滴定后的稀释度)，100uL/孔；37℃孵育60min，甩干孔内液体并洗板4次；
向单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的反应孔中分别加入多聚酶标记链霉亲和素的工作液(经滴定后的稀释度)，100uL/孔；37℃孵育60min，甩干孔内液体并洗板5次；
向单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的反应孔中分别加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色底物，100uL/孔；37℃孵育10～30min，甩干孔内液体并洗板1次；
向单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的中加入终止液，50uL/孔。
(3)待测样本的浓度的获得：
在波长450nm处测定所述梯度标准溶液和所述检测样本的吸光度值；其中，梯度标准溶液的检测数据如表1所示。
表1梯度标准溶液的检测数据
标准品浓度(pg/mL) OD450值
0 0.081
0.312 0.146
0.625 0.184
1.25 0.280
2.5 0.458
5.0 0.839
10.0 1.474
20.0 2.286
以所述梯度标准溶液的浓度作为横坐标，以所述梯度标准溶液的吸光度值作为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图4所示。
用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的四参数Logistic曲线拟合进行分析得到标准曲线的曲线方程为：
Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，其中A＝4.29894、B＝-1.15465、C＝19.21773、D＝0.01612，r^2＝0.99984。
上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值。
将检测样本的吸光度值带入曲线方程中，计算出所述待测样本的吸光度值在标准曲线上所对应横坐标的浓度，即为待测样本中人白细胞介素1β的含量。
经过方阵滴定试验调试后，测得单克隆抗体IL1β-3F5的最佳包被浓度范围(1～4)ug/mL，单克隆抗体IL1β-5C9的最佳检测抗体工作浓度1:(1000～2000)，最低检出浓度可达pg级水平。
表2方阵滴定试验的检测数据
Figure BDA0003705941860000111
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 北京索莱宝科技有限公司
<120> 一种单克隆抗体的组合物及其应用、检测人白细胞介素1β的试剂、试剂盒和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Val Gly Cys Leu Gly Ser Gly Pro Ala Leu Val Gly Leu Ser Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser His Thr Leu Thr Val Ser Gly Pro Ser Ala Ala Ala Thr
20 25 30
Val Gly Thr Val Gly Met Pro Pro Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Met
35 40 45
Ile Thr Gly Leu Met Gly Ala Ala His Ile Met Pro Ser Cys Leu Ser
50 55 60
Ile Ser Leu Ala Ala Ser Leu Ala Cys Ala Pro Leu Leu Met Ala Ser
65 70 75 80
Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr Cys Thr Val Pro Gly Gly
85 90 95
Cys Ala Cys His Thr Thr Gly Val Gly Thr Leu Val Thr Val Pro Thr
100 105 110
Ala
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ile Leu Leu Thr Gly Ser Cys Ala Ala His Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Leu Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Leu Ser Val Gly Leu Thr
20 25 30
Cys Cys Gly Ala Gly Leu Cys Gly Thr Ser Pro Leu Leu Thr Ile Ala
35 40 45
Cys Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Val Pro Gly Ala Pro Ser Gly Leu
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Thr Ile Leu Gly Ile Pro Ala Met Gly Ala Gly
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Thr His Met Val Leu Pro Pro Ser Ala Ala Leu
85 90 95
Thr Pro Met Ala Gly Thr Leu Leu Ala Leu Leu
100 105
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Val Gly Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ala Leu Val His Pro Ser Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Leu His Ser Leu Thr Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Val Gly Met Cys Gly Pro Ala Gly Leu Gly Leu Gly Thr Leu
35 40 45
Gly Val Ile Thr Met Gly Ile Ala His Ile Pro Leu Thr Leu Met Ser
50 55 60
Ala Leu Ser Val Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ser Thr Val Pro Leu Leu
65 70 75 80
Met Ala Ser Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Met Thr Met Leu Leu Val
85 90 95
Pro Gly Gly Cys Ala Cys His Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr Ser His
100 105 110
Thr Val Ser
115
<210> 4
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Ser Gly His Ser Leu Pro Met Gly Leu
1 5 10 15
Val Thr Ile Gly Ala Val Ala Ser Leu Gly Val Gly Thr Leu Thr Gly
20 25 30
Gly Leu Cys Gly Thr Ser Pro Leu Ala Ser Ile Ala Cys Gly Thr Leu
35 40 45
Leu Ala Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Ser Gly Leu Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Gly Thr Ile Leu Gly Ile Pro Ala Ile Met Gly Ala Gly Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Met Ile His Gly Pro Ser Ala Ala Leu Thr Gly Met Ile Gly
85 90 95
Pro Ser Thr Leu Ala Leu Leu
100

Claims (10)

1.一种单克隆抗体的组合物，其特征在于，所述组合物包括单克隆抗体IL1β-3F5和单克隆抗体IL1β-5C9；
所述单克隆抗体IL1β-3F5包括可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的重链和可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示的轻链；
所述单克隆抗体IL1β-5C9包括可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示的重链和可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .4所示的轻链。
2.一种如权利要求1所述的单克隆抗体的组合物在检测人白细胞介素1β中的应用。
3.一种如权利要求1所述的单克隆抗体的组合物在制备用于检测人白细胞介素1β的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
4.一种检测人白细胞介素1β的试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求1所述的单克隆抗体的组合物。
5.一种如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板、生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9、多聚酶标记的链霉亲和素和显色剂。
6.一种如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述生物素为N-羟基琥珀酰亚胺生物素。
7.一种如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述多聚酶为多聚辣根过氧化物酶。
8.一种如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述显色剂为3 ,3 ',5 ,5 '-四甲基联苯胺显色底物。
9.一种检测人白细胞介素1β的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求4至8中任意一项所述试剂。
10.一种检测人白细胞介素1β的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)梯度标准溶液的获得：
将作为标准品的人白细胞介素1β配制成的浓度为(0～20)pg/mL的梯度标准溶液；
(2)梯度标准溶液和检测样本的处理：
首先向单克隆抗体IL1β-3F5包被的酶标板的反应孔中分别加入所述梯度标准溶液和所述检测样本孵育反应并洗板；然后分别加入生物素标记的单克隆抗体IL1β-5C9孵育反应并洗板；再后分别加入多聚酶标记的链霉亲和素孵育反应并洗板；最后加入显色剂孵育反
应并洗板；之后加入终止液终止反应；
所述单克隆抗体IL1β-3F5包括可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的重链和可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示的轻链；
所述单克隆抗体IL1β-5C9包括可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示的重链和可变区氨基酸序列如SEQ ID NO .4所示的轻链；
(3)待测样本的浓度的获得：
在波长450nm处测定所述梯度标准溶液和所述检测样本的吸光度值；
以所述梯度标准溶液的浓度作为横坐标，以所述梯度标准溶液的吸光度值作为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到所述标准曲线的曲线方程；
根据所述曲线方程，计算出所述待测样本的吸光度值在标准曲线上所对应横坐标的浓度。
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