CN114349861B

CN114349861B - 一种抗pd1纳米抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114349861B
Application number: CN202210011915.7A
Authority: CN
Inventors: 华子春; 李淑锋
Original assignee: Targetpharma Laboratories Jiangsu Co ltd; Hua Tangsiyuan
Current assignee: Targetpharma Laboratories Jiangsu Co ltd; Hua Tangsiyuan
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114349861A

Abstract

本发明公开了一种抗人PD1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用，本发明的一种抗PD1纳米抗体，所述抗PD1纳米抗体的VHH链具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述抗PD1纳米抗体具有高度特异性，亲和力高，检测敏感性高；(2)所述抗体能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。本发明公开了一种抗人PD1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用，本发明的一种抗PD1纳米抗体，所述抗PD1纳米抗体的VHH链具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述抗PD1纳米抗体具有高度特异性，亲和力高，检测敏感性高；(2)所述抗体能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。

Description

一种抗PD1纳米抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种新的PD1抗体或其功能性片段，具体为抗PD1纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术

程序化死亡分子1（programmed death 1，PD1），又称为CD279，广泛表达于免疫细胞表面，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1 隶属免疫球蛋白超家族CD28/B7，是由288个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，为免疫抑制性受体。其有至少PDL1和PDL2两种配体。在正常情况下，T细胞表面的PD-1能够抑制T淋巴细胞的功能，从而抑制自身免疫应答，防止自身免疫性疾病的发生。但在肿瘤中，肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后，能通过对T淋巴细胞的抑制作用，导致T 细胞增殖下调，甚至诱导T细胞凋亡，促进肿瘤的免疫逃逸。而阻断PD-1/PD-L1负调控通路, 可激活免疫***功能，杀伤肿瘤细胞。目前市面上已有多种靶向PD1单克隆抗体，包括纳武利尤单抗（Nivolumab）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、西米普利单抗（Cemiplimab）、特瑞普利单抗（Toripalimab）、信迪利单抗（Cindilimab）等。这些PD1单抗在临床中已经取得成功应用。但是单克隆抗体具有开发周期长，生产成本高，分子量大，难以穿透组织等缺点。这些因素均限制了其在临床应用中的普及，而纳米抗体是目前最小的抗体分子，具有稳定性好，成本低，水溶性好，可穿过血脑屏障等优点。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种检测敏感度高的纳米抗体的抗PD1纳米抗体及其制备方法和应用。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的抗PD1纳米抗体，所述抗PD1纳米抗体的VHH链具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

进一步地，所述抗PD1纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区，所述框架区具有SEQ ID No.3、5、7、9所示的氨基酸序列，所述互补决定区具有SEQ ID No.4、6、8所示的氨基酸序列；

或者，所述框架区具有SEQ ID No.12、14、16、18所示的氨基酸序列，所述互补决定区具有SEQ ID No.13、15、17所示的氨基酸序列。

本发明的一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的抗PD1纳米抗体。

进一步地，其具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10的所示的核苷酸序列。

本发明的一种重组载体，其包含根据权利要求3或4所述的核酸。

本发明的一种宿主细胞，其包含根据权利要求3或4所述的核酸或根据权利要求5所述的载体。

本发明的所述的抗PD1纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建抗PD1纳米抗体噬菌体文库；

（2）选择与PD1具有特异结合的纳米抗体噬菌体；

（3）培养包含编码抗PD1纳米抗体核酸的载体的宿主；

（4）从宿主细胞中纯化获得抗PD1纳米抗体。

本发明的所述的抗PD1纳米抗体在制备检测PD1的试剂盒中的应用。

本发明的所述的抗PD1纳米抗体在制备***药物中的应用。

本发明的所述的抗PD1纳米抗体在制备与其他治疗抗肿瘤药物或治疗方法联用药物或方法中的应用。

本发明所述抗PD1纳米抗体的实验原理在于：采用基因工程技术，将PD1免疫后的骆驼血清中重链抗体可变区基因展示于T7噬菌体表面，再利用PD1从噬菌体抗体库中筛选出特异识别PD1的噬菌体表面的纳米抗体，由于所展示的纳米抗体与其所对应的基因存在于同一个重组噬菌体内，获得特异识别PD1的噬菌体纳米抗体后，通过对该噬菌体的DNA进行PCR扩增，测序即可获得该重组噬菌体内的纳米抗体对应基因。

有益效果：检测敏感度高，稳定性好，成本低，易于实际应用的。本发明所述抗PD1纳米抗体具有高度特异性，检测敏感性高。能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。

附图说明

图1A为本发明的nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA marker；1为nest-PCR1产物；

图1B为本发明的nest-PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA marker；1为nest-PCR2产物；

图1C为本发明的抗PD1纳米抗体文库多样性鉴定图，其中M为DNA分子标准；1-10为抗PD1纳米抗体文库中随机挑选的单克隆噬菌体PCR产物。

图2为本发明的通过SDS-PAGE分析纯化的可溶性纳米抗体。泳道1：VHH1，泳道2：VHH2。

图3A为本发明的Nbs与VHH1结合的亲和力通过非竞争性ELISA测定。平板用三种浓度的PD1蛋白包被：5mg/mL、2.5mg/mL和1.25mg/mL。图中描述了了三种不同 PD1 涂层浓度下VHH1 的实验剂量反应曲线。

图3B为本发明的Nbs与VHH2结合的亲和力通过非竞争性ELISA测定。平板用三种浓度的PD1蛋白包被：5mg/mL、2.5mg/mL和1.25mg/mL。图中描述了了三种不同 PD1 涂层浓度下VHH2 的实验剂量反应曲线。

图4为本发明的酶联免疫法鉴定纳米抗体的特异性结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本发明的抗PD1纳米抗体，所述抗PD1纳米抗体的VHH链具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列。

本发明的所述的抗PD1纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建抗PD1纳米抗体噬菌体文库；

（2）选择与PD1具有特异结合的纳米抗体噬菌体；

（3）培养包含编码抗PD1纳米抗体核酸的载体的宿主；

（4）从宿主细胞中纯化获得抗PD1纳米抗体。

本发明的所述的抗PD1纳米抗体在制备***药物中的应用。

鉴于目前临床使用中，已有近千种抗PD1抗体与其他药物或治疗方法的联合应用，本发明的所述的抗PD1纳米抗体在制备与其他抗肿瘤药物或治疗方法联用药物或方法中的应用。

实施例2

抗PD1纳米抗体文库构建

（1）将0.5mg人PD1蛋白免疫一只健康的单峰骆驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；

免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；

逆转录PCR

I .采用RT-PCR试剂盒，将外周血淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA，

II .通过nest-PCR扩增cDNA ,得到骆驼重链抗体的VHH片段。

以上述所得的cDNA为模板，nest-PCR1up(SEQ ID NO:19)和nest-PCR1down(SEQID NO:20)为引物，进行第一轮PCR扩增。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在700bp处有特异性条带。切胶回收目的条带(见图1A)。

以回收产物为模板，nest-PCR2up(SEQ ID NO:21)和nest-PCR2down(SEQ ID NO:22)为引物，进行第二轮PCR扩增。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增基因片段在500bp处有特异性条带。切胶回收目的条带，即为VHH片段(见图1B)。所用引物如下：

引物	引物序列
		nest-PCR1up	5 '>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3 '
nest-PCR1down	5 '>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3 '
		nest-PCR2up	5 '>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3 '
nest-PCR2down	5 '>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3 '

VHH片段的双酶切

用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切3小时，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。

T7噬菌体抗体库的构建

用Novagen公司的T7Select10试剂盒构建纳米抗体库。将VHH片段和T7载体连接，进行T7噬菌体的包装。通过噬菌斑滴度测定，构建的纳米抗体库滴度大约为1×10⁷pfu/ml。

T7噬菌体抗体库的扩增

用液体裂解法对T7噬菌体抗体库进行扩增。

检测PD1蛋白纳米抗体文库的重组率

随机挑(5)中的噬菌斑提取噬菌体DNA；以其为模板，按照T7Select10试剂盒说明书，进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳结果显示，构建的PD1蛋白纳米抗体文库的重组阳性率为100％(见图1C)。

2镍离子金属螯合亲和层析介质Ni-NTA淘选抗PD1纳米抗体

（1）Ni-NTA介质的清洗：

取100mlNi-NTA介质于1 .5mlEP管中，加1ml灭菌水洗5次，最后一次用0 .05％TBST代替灭菌水。

（2）封闭：

洗好的Ni-NTA介质加入1ml BSA封闭液，封闭1h；封闭结束后，TBST洗4次。

（3）负筛去除非特异结合的噬菌体：

噬菌体库用TBST稀释至1ml，加入到封闭后的Ni-NTA介质中，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min；离心，上清即为负筛后的T7噬菌体库。

（4）与PD1蛋白特异结合的噬菌体的筛选：

负筛后的噬菌体库加入20mg PD1蛋白，室温结合30min。然后将混合物加入到封闭好的Ni-NTA介质中，室温结合30min；离心，弃上清。TBST洗获得的沉淀，共洗5次；离心，弃上清；加入400ul TB培养基混匀，平均分为两份，一份用来测定筛选后的噬菌体的滴度，一份用来扩增筛选后的噬菌体。

（5）筛选后的噬菌体的扩增：

将筛选后的噬菌体加入到50ml宿主菌中，37℃震荡培养，培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；离心，上清即为扩增的第一轮筛选后的噬菌体，用于下一轮的筛选；按相同筛选步骤，筛选3-4轮。

3 ELISA鉴定特异性的抗PD1的噬菌体

上述最后一轮筛选所得的噬菌体，在150mm的TB固体培养基上培养，并挑选70个单克隆噬菌斑于BLT5403宿主菌中进行液体裂解法扩增，离心，上清即为单克隆噬菌体；

ELISA板每孔加入1mg PD1(胞外段)蛋白包被，4℃过夜，第二天BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆噬菌体，对照组加入等量的野生型T7噬菌体，室温孵育1h；TBST洗去未结合的噬菌体，然后加入兔抗T7噬菌体10A抗体，室温孵育1h；TBST洗3次，然后加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育1h；TBST洗3次，然后加入显色液，ELISA板置于酶标仪上，读取吸光值，当实验孔与对照孔吸光值比值大于2时，判定其为阳性克隆；提取阳性克隆噬菌体的DNA进行测序分析。

最后获得2种核苷酸序列；对其氨基酸序列进行分析，这三种序列均具有典型纳米抗体结构，由框架区(FR1，FR2，FR4，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这两株噬菌体的核苷酸序列，氨基酸序列如下：抗PD1-VHH1核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；抗PD1-VHH1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQ ID NO:3)、CDR1(SEQ ID NO:4)、FR2(SEQ ID NO:5)、CDR2(SEQ ID NO:6)、FR3(SEQ IDNO:7)、CDR3(SEQ ID NO:8)、FR4(SEQ ID NO:9)、抗PD1-VHH2核苷酸序列(SEQ ID NO:10)、抗PD1-VHH2氨基酸序列(SEQ ID NO:11)、框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQ ID NO:12)、CDR1(SEQ ID NO:13) 、FR2(SEQ ID NO:14) 、CDR2(SEQ IDNO:15) 、FR3(SEQ ID NO:16)、 CDR3(SEQ ID NO:17) 、FR4(SEQ ID NO:18) 。

实施例3

1抗PD1纳米抗体蛋白的载体构建和表达纯化

(1)抗PD1-VHH纳米抗体(抗PD1Nb1、抗PD1Nb2)的载体构建与表达纯化。

将抗PD1纳米抗体的核苷酸序列用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切产物，将其***到PET32a中，构建抗PD1纳米抗体的表达载体；转化到BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。离心菌液获得菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心收集上清。通过Ni-IDA亲和层析的方法，获得纯化的抗PD1纳米抗体。然后用SDS-PAGE电泳检测(见图2)。

2 抗PD1纳米抗体亲和常数的测定

通过ELISA确定纳米抗体与PD1结合的亲和常数。分别测量在三个抗原包被浓度下产生最大吸光度值 50% 的抗体浓度，并将其命名为 [Ab]t。获得了三个 [Ab]t 值并用于根据 Beatty 公式计算三个 K 值。最终的亲和力常数是三个 K 值的平均结果。通过ELISA确定纳米抗体与PD-1结合的亲和常数。纳米抗体的亲和力图如图3 所示。计算了VHH1(见图3A)和VHH2 (见图3B)的Kaff。 PD1 VHH1 kaff=0.82×10⁷M^-，PD1 VHH2 kaff=1.54×10⁷M^-。

3酶联免疫法(ELISA)鉴定纯化的纳米抗体的特异性

包被抗原蛋白PD1(人)、PD1(鼠)、PD1(猴子)、CTLA4 (人)、CD28 (人) ，BSA 用作对照，每孔0.5mg，4℃过夜；第二天用PBST洗3次，加入1％BSA室温封闭2小时；将每个纳米抗体稀释至10mg/mL，分别取100mL与各孔孵育，室温反应1小时；用PBST洗去未结合的抗体，加入1: 1000稀释的兔抗HA单克隆抗体，室温孵育一小时。TBST洗板3次，加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育一小时。TBST洗板3次，加入显色液，ELISA板置于酶标仪上读取吸收值。根据吸收值判断纳米抗体的特异性，检测结果显示两个纳米抗体均能够与人源和猴源的PD1相互作用，纳米抗体具有较好的特异性。图4示代表性的antiPD1Nb的特异性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华汤思圆、江苏靶标生物医药研究所有限公司

<120> 一种抗PD1纳米抗体及其制备方法和应用

<130> 2021

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(抗PD1-VHH1核苷酸序列)

<400> 1

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgcgcag cctctggata cgccagcagt agctactcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaggc ggtcgcaggt gttaatcgtg atggtagtac aagatacgca 180

gactccgtga aggaccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctc 240

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtatt actgtgcggc agatcggggt 300

tgggtactcc cccgtcgacc ggaatactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(抗PD1-VHH1氨基酸序列)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Val Asn Arg Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Arg Gly Trp Leu Pro Arg Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR1氨基酸序列)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区CDR1氨基酸序列)

<400> 4

Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Tyr Ser Met Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR2氨基酸序列)

<400> 5

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区CDR2氨基酸序列)

<400> 6

Val Asn Arg Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR3氨基酸序列)

<400> 7

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区CDR3氨基酸序列)

<400> 8

Ala Ala Asp Arg Gly Trp Leu Pro Arg Arg Pro Asp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR4氨基酸序列)

<400> 9

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(抗PD1-VHH2核苷酸序列)

<400> 10

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcgt cctctggata cacctggaat aggtactcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaggc ggtcgccggt attaatcgtg atggtagttt aagatacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcg aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctc 240

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact attgtgcggc agatcggaat 300

tgggtactcc cccgtcgacc ggactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(抗PD1-VHH2氨基酸序列)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Ala Ser Ser Gly Tyr Thr Trp Asn Arg Tyr Ser

20 25 30

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala

35 40 45

Gly Ile Asn Arg Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Asp Arg Asn Trp Leu Pro Arg Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR1氨基酸序列)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Ala Ser Ser

20

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(互补决定区CDR1氨基酸序列)

<400> 13

Gly Tyr Thr Trp Asn Arg Tyr Ser Met Gly

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR2氨基酸序列)

<400> 14

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Gly

1 5 10 15

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(互补决定区CDR2氨基酸序列)

<400> 15

Ile Asn Arg Asp Gly Ser Leu

1 5

<210> 16

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR3氨基酸序列)

<400> 16

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(互补决定区CDR3氨基酸序列)

<400> 17

Ala Ala Asp Arg Asn Trp Leu Pro Arg Arg Pro Asp Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(框架区FR4氨基酸序列)

<400> 18

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccggaattct caggtgcagc tggtggagtc tgg 33

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcccaagctt tgaggagacg gtgacctggg t 31

Claims

1.一种抗PD1纳米抗体，其特征在于：所述抗PD1纳米抗体的VHH链为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的抗PD1纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

4.一种重组载体，其包含根据权利要求3所述的核酸。

5.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸或根据权利要求4所述的载体。

6.权利要求1所述的抗PD1纳米抗体在制备检测PD1的试剂盒中的应用。