CN106699891A

CN106699891A - 一种抗pd‑l1 抗体、其药物组合物及其用途

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Publication number: CN106699891A
Application number: CN201710055374.7A
Authority: CN
Inventors: 王霞; 李锋; 张伯彦; 叶培; 刘慧芳; 李燕
Original assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2037-01-25
Also published as: CN106699891B

Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD‑L1抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:1－3的CDR；和/或所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:4－6的CDR。本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与PD‑L1结合，特异地解除PD‑1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。

Description

一种抗PD-L1抗体、其药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD-L1抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种抗PD-L1的单克隆抗体。

背景技术

肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，初步的临床试验结果表明其治疗有效率非常高。初始T细胞的活化需要两个信号，即由T细胞抗原受体(TCR)与DC上的抗原肽-MHC分子复合物结合提供的抗原特异性信号，又需要DC上的B7共刺激分子与T细胞上的CD28分子结合提供的共刺激信号。只有双信号共同刺激才能有效激活T细胞反应，若缺乏第二信号刺激，将使T细胞处于克隆无能或无应答状态，因此B7/CD28共刺激信号对T细胞的活化起着至关重要的作用。

PD-L1作为B7家族的一个新成员，主要表达于造血细胞，如静息的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞，其受体PD-1全名程序性死亡受体，主要表达在活化的T细胞、B细胞、髓系细胞和胸腺细胞。DC上的PD-L1与其受体结合后，可产生抑制信号，并诱导抗原特异性T细胞凋亡、无反应性和衰竭，对机体的免疫应答起负性调控作用。近年来，PD-L1/PD-1作为B7/CD28协同刺激分子超家族的重要免疫负性调节分子，其在肿瘤免疫逃逸中作用已被越来越多人重视。

PD-1/PD-L1在肿瘤微环境中是一种强有力的免疫抑制因子，特别是能够抑制T细胞的免疫活性。在大多数正常组织中，PD-L1不表达，但当其在肿瘤免疫微环境中的肿瘤细胞的表面表达增高时，PD-L1可以与活化的T细胞上的PD-1结合，传递负性调控信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡或免疫无能，从而抑制免疫反应，进而促使肿瘤细胞的逃逸。PD-1/PD-L1抑制剂可以封闭PD-L1/PD-1信号传导通路，已成为肿瘤免疫治疗的一个重要策略。

PD1/PD-L1通路抑制剂主要包括anti-PD1或anti-PD-L1单抗，也有针对PD-L2的产品。国外很多大公司正在角逐anti-PD1或anti-PD-L1单抗，目前国外已上市的抗PD-1/PD-L1药物是百时美施贵宝(BMS)Opdivo(Nivolumab)、默沙东的Keytruda(Pembrolizumab)和罗氏的Tecentriq(Atezolizumab)，其他处于在研阶段的药物有Pidilizumab(CT-011，CureTech)、Avelumab(默克)、BMS-936559(MDX-1105，BMS)和MED14736(阿斯利康)。其中，罗氏的Atezolizumab(商品名Tecentriq)是唯一获批的PD-L1抗体药物，已经被FDA批准用于治疗肺癌及晚期膀胱癌。

目前，尚需要开发新的具有更好的结合效率的抗PD-L1抗体，以有效地阻断PD-1与PD-L1的结合。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种单克隆抗体。并且本发明人惊奇地发现，该单克隆抗体能够十分有效地阻断PD-1与PD-L1的结合。本发明的单克隆抗体还能够有效地激活T细胞，诱导人淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2；具有用于制备防治肺癌、黑色素瘤、肾肿瘤、卵巢癌、白血病等的药物的潜力。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，

所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:1－3的CDR；

和/或

所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:4－6的CDR。

VH-CDR1：GFTFADSWIH(SEQ ID NO:1)

VH-CDR2：AWISPFGGSNYYADSVKG(SEQ ID NO:2)

VH-CDR3：RHWPGGFDY(SEQ ID NO:3)

VL-CDR1：RASQSIGTALN(SEQ ID NO:4)

VL-CDR2：TASSLQS(SEQ ID NO:5)

VL-CDR3：QQDNYTPMT(SEQ ID NO:6)

在本发明的一个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，

所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7；

和/或

所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8。

重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPFGGSNYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)

轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTALNWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNYTPMTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:8)

通过本领域技术人员所熟知的技术手段例如通过VBASE2数据库，分析上面的重链可变区的氨基酸序列或者轻链可变区的氨基酸序列，可以得到上述的CDR的序列。

在本发明的一个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原PD-L1蛋白；优选地，所述亲和力通过表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测得。

所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/或***；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、***癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。

本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，

所述抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:1－3的CDR；

优选地，所述抗体的重链具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

更优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

本发明的再一方面涉及分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中，

所述抗体轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:4－6的CDR；

优选地，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

更优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。

本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的载体。

本发明的再一方面涉及制备本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。

本发明的再一方面涉及偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

在本发明的一个实施方案中，所述的偶联物，其用于预防和/或***；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、***癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。

本发明的再一方面涉及试剂盒，其包括本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的偶联物；

优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-L1在样品中的存在或其水平。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备预防和/或***的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、***癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备如下药物中的用途：

阻断PD-1与PD-L1结合的药物，

调节(例如下调)PD-L1活性或水平的药物，

解除PD-1对机体免疫抑制的药物，或者

提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的药物。

本发明的再一方面涉及一种在体内或在体外的方法，包括施加细胞以有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤，所述方法选自如下：

阻断PD-1与PD-L1结合的方法，

调节(例如下调)PD-L1活性或水平的方法，

解除PD-1对机体免疫抑制的方法，或者

提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的方法。在本发明的一个实施方案中，所述在体外的方法是非治疗目的的。

本发明的再一方面涉及一种预防和/或***的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、***癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，当提及PD-1蛋白(Programmed cell death protein 1,NCBIGenBank:NM_005018)的氨基酸序列时，其包括PD-1蛋白的全长，或者PD-1的胞外片段PD-1ECD或者包含PD-1ECD的片段；还包括PD-1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在PD-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PD-1蛋白”应包括所有此类序列。并且，当描述PD-1蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

如本文中所使用的，当提及PD-L1蛋白(Programmed death-ligand 1,NCBI GeneID:AK314567)的氨基酸序列时，其包括PD-L1蛋白的全长，或者PD-L1的胞外片段PD-L1ECD或者包含PD-L1ECD的片段；还包括PD-L1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在PD-L1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PD-L1蛋白”应包括所有此类序列。并且，当描述PD-L1蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1、C_H2和C_H3)组成。各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由V_H和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由V_H结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中V_L和V_H结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头-V_L-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的Mil85-6抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabilly etal.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann etal.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的Mil85-6抗体)以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(K_D)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

发明的有益效果

本发明的单克隆抗体均能够很好地特异性与PD-L1结合，并且能够十分有效地阻断PD-1与PD-L1的结合，特异地解除PD-1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。

附图说明

图1：ELISA鉴定全抗体与PD-L1结合亲和力。

图2：ELISA鉴定全抗体与PD-L1结合活性。

图3：全抗体抑制PD-1与PD-L1结合。

图4：全抗体抑制PD-1与PD-L1结合。

图5：全抗体抑制细胞表面PD1与PD-L1结合。

图6：混合淋巴细胞反应刺激T细胞的功能。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：PD-L1全抗体的表达

合成Mil85-6的重链可变区基因和轻链可变区基因。基因序列如下：

编码Mil85-6重链可变区的核酸序列

GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCTGATAGCTGGATCCACTGGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTGGATCAGCCCATTTGGCGGCTCTAATTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGACACTGGCCAGGCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC(SEQ ID NO:9)

编码Mil85-6轻链可变区的核酸序列

GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGAGTATCGGTACCGCCCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGTTAATTTATACGGCCAGCAGCCTGCAGTCTGGCGTGCCGTCGCGTTTTAGCGGCTCGGGTTCGGGCACCGATTTTACCCTGACCATCTCGAGCTTGCAGCCGGAGGACTTCGCCACCTACTATTGCCAGCAAGACAACTACACCCCAATGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(SEQ IDNO:10)

将Mil85-6的重链可变区基因和轻链可变区基因克隆至装有重链恒定区基因和轻链恒定区基因的pCDNA3.1(Invitrogen公司)载体上，转染CHO-K1细胞(购自ATCC，保藏号为ATCC：58995535)，进行全抗体分泌表达，收集细胞培养上清，经过protein A(购自GE公司)纯化后，得到Mil85-6抗体(本文中亦简称为Mil85-6或全抗体)，用于下面的实施例。

实施例2：全抗体与PD-L1的结合

用PBS包被5μg/ml的PD-L1-Fc于96孔板中，4℃孵育过夜，次日弃去包被液，并用PBST洗涤三次后，每孔加入200μl封闭液，室温孵育1h，PBST洗涤三遍，将MIL85-6抗体最高浓度调为20μg/ml，并进行5倍稀释，做十个浓度梯度，每孔加入100μl，室温孵育1h后，PBST洗涤三遍，并加入抗-Fab-HRP，每孔100μl，室温孵育1h，每孔洗涤四次，加入TMB显色液，100μl/孔，室温显色，用10％H₂SO₄终止显色，50μl/孔，450nm读数。其中，所用的PD-L1-Fc可以采用本领域技术人员知悉的方法制备，例如参考下面的步骤：

将抗原PD-L1的胞外区cDNA序列连上人IgG的Fc片段后克隆至表达载体pCDNA3.1(Invitrogen公司)上，使用电转染方法将获得的表达载体转入宿主细胞CHO-K1中，向种子培养基中加入50μM MSX，在37℃CO₂培养箱中培养2－4周，挑选出存活的细胞，通过ELISA法检测获得能够表达蛋白的细胞。通过有限稀释法进行亚克隆筛选，经过6－8周的培养及筛选，获得能够高效表达PD-L1-Fc的单克隆细胞株，后经多步扩大培养，收获上清，采用AKTA(GE公司)进行PD-L1-Fc的分离纯化。

结果如图1所示。

结果显示，Mil85-6抗体能较好的结合PD-L1。

实施例3：全抗体结合活性的比较

以Mil76为对照(其序列参照Atezolizumab，根据MIL85-6抗体的表达纯化方法对其表达纯化获得)，与本发明中获得的抗PD-L1抗体Mil85-6的亲和力进行比较。

用PBS包被1μg/ml的PD-L1-Fc于96孔板中，4℃孵育过夜，次日弃去包被液，并用PBST洗涤三次后，每孔加入200μl封闭液，室温孵育1h后，PBST洗涤三遍，将抗体最高浓度调为10μg/ml，并进行4倍稀释，做8个浓度梯度，每孔加入100μl,室温孵育1h后，PBST洗涤三遍，并加入抗-Fab-HRP，每孔100μl，室温孵育1h，洗涤四次，加入TMB显色液，100μl/孔，室温显色，用10％H₂SO4终止显色，450nm读数。

结果如图2所示。

结果显示，Mil85-6结合活性好于Mil76。

实施例4：全抗体抑制PD1与PD-L1结合

用PBS缓冲液包被PD-L1-Fc，包被浓度为5μg/ml，4℃包被过夜。PBST洗涤三次，4％的milk-PBST 37℃封闭1h。用4％milk-PBST稀释Mil85-6全抗体至50μg/ml然后进行2.5倍梯度稀释，共设置9个稀释梯度，50μl/孔，然后每孔加入等体积的40μg/ml的生物标记的PD1-Fc，37℃孵育1h。用PBST洗三次，将Streptavidin-HRP二抗按1:4000稀释于4％的milk-PBST中，37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，用10％H₂SO₄终止显色，50μl/孔，450nm读数。

结果如图3所示。

结果显示，Mil85-6能较好的抑制PD1与PD-L1的结合。

实施例5：全抗体竞争抑制活性的比较

用PBS缓冲液包被PD-L1-Fc，包被浓度为5μg/ml，4℃包被过夜。PBST洗涤三次，4％的milk-PBST 37℃封闭1h。用4％milk-PBST分别稀释生物标记的PD1-Fc(由嘉暄生物标记生物素)与Mil76，Mil85-6(即Mil85-6-5C6)，全抗体最高终浓度5μg/ml，进行2.5倍梯度稀释，共设置8个稀释梯度，生物标记的PD1-Fc终浓度为5μg/ml，37℃孵育1h后用PBST洗三次，将Streptavidin-HRP二抗按1:4000稀释于4％的milk-PBST中，37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，用10％H₂SO4终止显色，450nm读数。其中，所用的PD1-Fc可以采用本领域技术人员知悉的方法制备，例如参考下面的步骤：

将抗原PD-1的胞外区cDNA序列连上人IgG的Fc片段后克隆至表达载体pCDNA3.1(Invitrogen公司)上，使用电转染方法将获得的表达载体转入宿主细胞CHO-K1中，向种子培养基中加入50μM MSX，在37℃CO₂培养箱中培养2－4周，挑选出存活的细胞，通过ELISA法检测获得能够表达蛋白的细胞。通过有限稀释法进行亚克隆筛选，经过6－8周的培养及筛选，获得能够高效表达PD1-Fc的单克隆细胞株，后经多步扩大培养，收获上清，采用AKTA(GE公司)进行PD1-Fc的分离纯化。

结果如图4所示。

结果显示，Mil85-6抑制PD-1与PD-L1结合的能力优于Mil76。

实施例6：BIAcore测定全抗体亲和力

用HBS-EP+Buffer稀释Mil85-6作为配体。将PD-L1-Fc用HBS-EP+Buffer稀释至8μg/ml、4μg/ml、1.6μg/ml、0.64μg/ml、0.256μg/ml和0.1024μg/ml，作为分析物。采用间接捕获的方法固定配体(抗体)，先用25μg/ml的Anti-Human Fab antibody(28-9583-25，GE)通过氨基偶联共价结合于CM5芯片表面，之后再结合配体和分析物。在Biacore Wizard模式下，以多循环方式，以MIL85不同克隆样品分别为配体，以PD-L1-Fc为分析物，进行亲和力分析实验。每个样品的测试包括3个Start up、1个零浓度对照、6个梯度浓度样品和1个重复浓度样品，每个循环结束之后用10mM Glycine HCl PH2.1再生液使芯片再生。分析物的每个浓度循环设置捕获时间180s，配体溶液流速10μl/min；配体与分析物结合时间180s，分析物溶液流速30μl/min；解离时间1200s。将原始数据导入BIACORETM X100分析软件，扣除零浓度对照，并且扣除参比通道以消除容积效应，用Kinetics分析方法中的1:1binding模式拟合图形，整理数据。如下面的表1所示。

表1：抗体亲和力常数测定

样品	Ka(1/MS)	Kd(1/S)	K_D(M)
				Mil85-6	4.566E+5	1.9455E-4	4.2915E-10
Mil76	4.980E+5	8.388E-5	1.691E-10

结果显示：Mil85-6与Mil76的亲和力相似。

实施例7：全抗体抑制细胞表面PD1与PD-L1的结合

将表达人PD-L1和TCR激活因子的CHO-K1细胞(Promega)以4×10⁴/孔铺入96孔细胞培养板(Costar)中过夜培养，第二天弃掉96孔板中的细胞上清，将稳定表达荧光素酶报告基因的重组Jurkat细胞(Promega)密度调为1.25×10⁶/ml，每孔加入40μl，然后分别将Mil85-3、Mil85-6、Mil85-25抗体最高浓度稀释为5μg/ml，进行2.5倍稀释，设置7个浓度梯度，将抗体40μl/孔加入到96孔板中与两种细胞共同孵育6小时后，加入Bio-Glo TM检测试剂(Promega)80μl/孔，通过检测荧光素酶活性的改变反映抗体的药效。

结果如图5所示。

实验结果显示，Mil85-6能不同程度的阻断细胞表面PD1:PD-L1之间的结合，从而激活了Jurkat细胞内NFAT信号通路并开始荧光素酶的表达。Mil85-6(即图5中的Mil85-6-5C6)阻断细胞表面PD1:PD-L1结合的能力与Mil76相似。

实施例8：PD-L1抗体刺激T细胞的功能

采集健康人新鲜血液，利用人外周血淋巴细胞分离液分离出PBMC后，使用单核细胞分离试剂盒(Miltenyi)从PBMC中分离出单核细胞。将单核细胞以2.5×10⁴/孔的密度铺入96孔含RPMI1640培养基与25ng/ml的GM-CSF和50ng/ml的IL-4的细胞培养板中，每3天换新鲜培养基，第7天单核细胞分化为树突状细胞可准备使用。同时在第7天，使用CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从来自从另一健康人血液中的PBMC中分离出CD4+T细胞。

然后将2×10⁵/孔的CD4+T细胞与树突状细胞共培养在含有不同浓度抗体的RPMI培养基中。Mil85-6抗体最高浓度为50μg/ml，进行5倍稀释，设置6个浓度梯度。培养5天后，使用IFN-γELISA试剂盒(Biolegend)检测IFN-γ在培养基中的含量。

结果如图6所示。

实验结果表明，Mil85-6能有效刺激T细胞的功能。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

<120> 一种抗PD-L1抗体、其药物组合物及其用途

<130> IDC160166

<160> 10

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ala Asp Ser Trp Ile His

1 5 10

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Ala Trp Ile Ser Pro Phe Gly Gly Ser Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ala Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Asp Asn Tyr Thr Pro Met Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 重链可变区

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Phe Gly Gly Ser Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Tyr Thr Pro Met

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Mil85-6重链可变区的核酸序列

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc caggcggcag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcgct gatagctgga tccactgggt gagacaggcc 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtggcctgg atcagcccat ttggcggctc taattactac 180

gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaagacac 300

tggccaggcg gcttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码Mil85-6轻链可变区的核酸序列

<400> 10

gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggtga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcca gagtatcggt accgccctga attggtatca gcagaaaccg 120

ggtaaagcgc cgaaactgtt aatttatacg gccagcagcc tgcagtctgg cgtgccgtcg 180

cgttttagcg gctcgggttc gggcaccgat tttaccctga ccatctcgag cttgcagccg 240

gaggacttcg ccacctacta ttgccagcaa gacaactaca ccccaatgac cttcggtcag 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

Claims

1.单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，

和/或

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，

所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7；

和/或

所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原PD-L1蛋白；优选地，所述亲和力通过表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测得。

5.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，

6.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，

优选地，所述抗体的重链具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

更优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

7.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中，

所述抗体轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:4－6的CDR；

更优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

8.一种载体，其包含权利要求6和/或7所述的分离的核酸分子。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求6和/或7所述的分离的核酸分子，或者权利要求8所述的载体。

10.制备权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求9的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。

11.偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

12.试剂盒，其包括权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求11所述的偶联物；

13.权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求11所述的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-L1在样品中的存在或其水平。

14.一种药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求11所述的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

15.权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求11所述的偶联物在制备预防和/或***的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、***癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。

16.权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求11所述的偶联物在制备如下药物中的用途：

阻断PD-1与PD-L1结合的药物，

调节(例如下调)PD-L1活性或水平的药物，

解除PD-1对机体免疫抑制的药物，或者

提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的药物。

17.一种在体内或在体外的方法，包括施加细胞以有效量的权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求11所述的偶联物的步骤，所述方法选自如下：

阻断PD-1与PD-L1结合的方法，

调节(例如下调)PD-L1活性或水平的方法，

解除PD-1对机体免疫抑制的方法，或者

提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的方法。