CN109265548A - 抗pd-l1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗PD‑L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:20所示。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述抗PD‑L1纳米抗体具有高度特异性，检测敏感性高；(2)所述抗体能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。

Description

抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种新的PD-L1抗体或其功能性片段，具体为抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用。
背景技术
程序性死亡因子1配体1(programmed death 1ligand 1，PD-L1)又称CD274，B7-H1，为B7家族成员，是PD-1的配体，属于I型跨膜蛋白。在正常情况下，T细胞表面的PD-1能够抑制T淋巴细胞的功能，从而抑制自身免疫应答，防止自身免疫性疾病的发生。但在肿瘤中，肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后，能通过对T淋巴细胞的抑制作用，导致T细胞增殖下调,甚至诱导T细胞凋亡,促进肿瘤的免疫逃逸。而阻断PD-1/PD-L1负调控通路,可激活免疫***功能，杀伤肿瘤细胞。目前市面上已有多种靶向PD-L1单克隆抗体，如罗氏PD-L1单克隆抗体atezolizumab(Tecentriq)，阿斯利康公司研发的Durvalumab(商品名：Imfinzi)，辉瑞/默克的avelumab(商品名：Bavencio)，这些PD-L1单抗在临床中已经取得成功应用。但是单克隆抗体具有开发周期长，生产成本高，分子量大，难以穿透组织等缺点。这些因素均限制了其在临床应用中的普及，而纳米抗体是目前最小的抗体分子，具有稳定性好，成本低，水溶性好，可穿过血脑屏障等优点。而且选择wasabi作为表达纳米抗体的融合片段，具有表达量高，成本低,便于检测应用等优点。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种检测敏感度高，稳定性好，成本低，易于实际应用的纳米抗体，本发明提供了抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用。
技术方案：抗PD-L1纳米抗体，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQID NO:11或SEQ ID NO:20所示。
抗PD-L1纳米抗体，所述抗体VHH链包括框架区和互补决定区；其中：
所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQ ID NO:3，FR2、SEQ ID NO:5，FR3、SEQ ID NO:7，FR4、SEQ ID NO:9；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQ IDNO:4，CDR2、SEQ ID NO:6，CDR3、SEQ ID NO:8；
或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQ ID NO:12，FR2、SEQ ID NO:14，FR3、SEQ ID NO:16，FR4、SEQ ID NO:18；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQ ID NO:13，CDR2、SEQ ID NO:15，CDR3、SEQ ID NO:17；
或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQ ID NO:21，FR2、SEQ ID NO:23，FR3、SEQ ID NO:25，FR4、SEQ ID NO:27；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQ ID NO:22，CDR2、SEQ ID NO:24，CDR3、SEQ ID NO:26。
编码抗PD-L1纳米抗体的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10或SEQID NO:19。
重组载体，所述重组载体中包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:19序列。
宿主细胞，所述宿主细胞中包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:19序列。
以上所述抗PD-L1纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建抗PD-L1纳米抗体噬菌体文库；
(2)选择与PD-L1具有特异结合的纳米抗体噬菌体；
(3)培养包含编码抗PD-L1纳米抗体核酸的载体的宿主；
(4)从宿主细胞中纯化获得抗PD-L1纳米抗体。
优选的，采用巢式PCR方法构建抗PD-L1纳米抗体的文库，其中第一轮扩增反应引物序列为SEQ ID NO:28-29，第二轮扩增反应引物序列为SEQ ID NO:30-31。
免疫偶联物，该免疫偶联物含有抗PD-L1纳米抗体的VHH链或抗PD-L1纳米抗体；和wasabi蛋白。
以上所述的抗PD-L1纳米抗体在(a)制备检测PD-L1的试剂盒；(b)制备***药物中的应用。
以上所述的免疫偶联物在(a)制备检测PD-L1的试剂盒；(b)制备***药物中的应用。
本发明所述抗PD-L1纳米抗体的实验原理在于：采用基因工程技术，将PD-L1免疫后的骆驼血清中重链抗体可变区基因展示于T7噬菌体表面，再利用PD-L1从噬菌体抗体库中筛选出特异识别PD-L1的噬菌体表面的纳米抗体，由于所展示的纳米抗体与其所对应的基因存在于同一个重组噬菌体内，获得特异识别PD-L1的噬菌体纳米抗体后，通过对该噬菌体的DNA进行PCR扩增，测序即可获得该重组噬菌体内的纳米抗体对应基因。
有益效果：(1)本发明所述抗PD-L1纳米抗体具有高度特异性，检测敏感性高；(2)所述抗体能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。
附图说明
图1A为nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA marker；1为nest-PCR1产物；
图1B为nest-PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA marker；1为nest-PCR2产物；
图1C为抗PD-L1纳米抗体文库多样性鉴定图，其中M为DNA分子标准；1-10为抗PD-L1纳米抗体文库中随机挑选的单克隆噬菌体PCR产物；
图2为免疫偶联物wasabi-antiPD-L1Nb28、wasabi及3种抗PD-L1纳米抗体的SDS-PAGE图，其中，M为分子量标准，1为wasabi-antiPD-L1Nb28蛋白，2为wasabi蛋白，3-5为antiPD-L1Nb15、antiPD-L1Nb22、antiPD-L1Nb28；
图3为酶联免疫法鉴定纳米抗体的特异性结果图；
图4为纳米抗体检测HEK293T/PD-L1荧光图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1抗PD-L1纳米抗体文库构建
(1)将1mg带有His标签的PD-L1胞外段(19-239)抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫5次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
(2)免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；
(3)逆转录PCR
I.采用RT-PCR试剂盒，将外周血淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA，
II.通过nest-PCR扩增cDNA,得到骆驼重链抗体的VHH片段。
以上述所得的cDNA为模板，nest-PCR1up(SEQ ID NO:28)和nest-PCR1down(SEQID NO:29)为引物，进行第一轮PCR扩增。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在700bp处有特异性条带。切胶回收目的条带(见图1A)。
以回收产物为模板，nest-PCR2up(SEQ ID NO:30)和nest-PCR2down(SEQ ID NO:31)为引物，进行第二轮PCR扩增。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增基因片段在500bp处有特异性条带。切胶回收目的条带，即为VHH片段(见图1B)。所用引物如下：
引物 引物序列
nest-PCR1up 5'>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3'
nest-PCR1down 5'>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3'
nest-PCR2up 5'>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3'
nest-PCR2down 5'>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3'
(4)VHH片段的双酶切
用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切3小时，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。
(5)T7噬菌体抗体库的构建
用Novagen公司的T7Select10试剂盒构建纳米抗体库。将VHH片段和T7载体连接，进行T7噬菌体的包装。通过噬菌斑滴度测定，构建的纳米抗体库滴度大约为1×107pfu/ml。
(6)T7噬菌体抗体库的扩增
用液体裂解法对T7噬菌体抗体库进行扩增。
(7)检测PD-L1蛋白纳米抗体文库的重组率
随机挑(5)中的噬菌斑提取噬菌体DNA；以其为模板，按照T7Select10试剂盒说明书，进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳结果显示，构建的PD-L1蛋白纳米抗体文库的重组阳性率为100％(见图1C)。
2镍离子金属螯合亲和层析介质Ni-NTA淘选抗PD-L1纳米抗体
(1)Ni-NTA介质的清洗：
取100ulNi-NTA介质于1.5mlEP管中，加1ml灭菌水洗5次，最后一次用0.05％TBST代替灭菌水。
(2)封闭：
洗好的Ni-NTA介质加入1ml BSA封闭液，封闭1h；封闭结束后，TBST洗4次。
(3)负筛去除非特异结合的噬菌体：
噬菌体库用TBST稀释至1ml，加入到封闭后的Ni-NTA介质中，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min；离心，上清即为负筛后的T7噬菌体库。
(4)与PDL1蛋白特异结合的噬菌体的筛选：
负筛后的噬菌体库加入20ug PD-L1蛋白，室温结合30min。然后将混合物加入到封闭好的Ni-NTA介质中，室温结合30min；离心，弃上清。TBST洗获得的沉淀，共洗5次；离心，弃上清；加入400ul TB培养基混匀，平均分为两份，一份用来测定筛选后的噬菌体的滴度，一份用来扩增筛选后的噬菌体。
(5)筛选后的噬菌体的扩增：
将筛选后的噬菌体加入到50ml宿主菌中，37℃震荡培养，培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；离心，上清即为扩增的第一轮筛选后的噬菌体，用于下一轮的筛选；按相同筛选步骤，筛选3-4轮。
3ELISA鉴定特异性的抗PD-L1的噬菌体
上述最后一轮筛选所得的噬菌体，在150mm的TB固体培养基上培养，并挑选70个单克隆噬菌斑于BLT5403宿主菌中进行液体裂解法扩增，离心，上清即为单克隆噬菌体；
ELISA板每孔加入1ug PD-L1(胞外段)蛋白包被，4℃过夜，第二天BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆噬菌体，对照组加入等量的野生型T7噬菌体，室温孵育1h；TBST洗去未结合的噬菌体，然后加入兔抗T7噬菌体10A抗体，室温孵育1h；TBST洗3次，然后加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育1h；TBST洗3次，然后加入显色液，ELISA板置于酶标仪上，读取吸光值，当实验孔与对照孔吸光值比值大于2时，判定其为阳性克隆；提取阳性克隆噬菌体的DNA进行测序分析。
最后获得3种核苷酸序列；对其氨基酸序列进行分析，这三种序列均具有典型纳米抗体结构，由框架区(FR1，FR2，FR4，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这三株噬菌体的核苷酸序列，氨基酸序列如下
抗PD-L1-VHH15核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGGCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTCCACTAGCAACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTTATACTGGTGGTGGTAGCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGGGGATTTGGACCCCGCCGAATATAGCGACTATGACCCTACCGTCTTTAACTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
抗PD-L1-VHH15氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
QVQLVESGGGSVQAGGALRLSCAASGYTSTSNCMGWFRQAPGKEREGVAAIYTGGGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGDLDPAEYSDYDPTVFNYWGQGTLVTVSS
框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：
FR1(SEQ ID NO:3)：QVQLVESGGGSVQAGGALRLS
CDR1(SEQ ID NO:4)：CAASGYTSTSNCMG
FR2(SEQ ID NO:5)：WFRQAPGK
CDR2(SEQ ID NO:6)：EREGVAAIYTGGGST
FR3(SEQ ID NO:7)：YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC
CDR3(SEQ ID NO:8)：AAGDLDPAEYSDYDPTVFNY
FR4(SEQ ID NO:9)：WGQGTLVTVSS
抗PD-L1-VHH22核苷酸序列(SEQ ID NO:10)：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGACACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGGTTCACTTTTGATGGTTCTGACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGACTGAGTGCGAGTTGGTGTCAACTATTAGTAGTGATGGAAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGACTTCACTGCACGGGTAGCTGGGCCTTGATAATGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
抗PD-L1-VHH22氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：
QVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCVASGFTFDGSDMGWYRQAPGTECELVSTISSDGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCARLHCTGSWALIMGQGTQVTVSS框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：
FR1(SEQ ID NO:12)：QVQLVESGGGSVQAGGSLTLS
CDR1(SEQ ID NO:13)：CVASGFTFDGSDMG
FR2(SEQ ID NO:14)：WYRQAPGT
CDR2(SEQ ID NO:15)：ECELVSTISSDGST
FR3(SEQ ID NO:16)：YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
CDR3(SEQ ID NO:17)：ARLHCTGSWALI
FR4(SEQ ID NO:18)：MGQGTQVTVSS
抗PD-L1-VHH28核苷酸序列(SEQ ID NO:19)：
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTTGATGGTTCTGACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGACTGAGTGCGAGTTGGTGTCAACTATTAGTAGTGATGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACACTATATCTGCAATTGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGGCGAGGCTGCCCCATATTGATGTGGTCGCTACTGCTAAGGGATGTAAGGCGAACAGCTACTTGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
抗PD-L1-VHH28氨基酸序列(SEQ ID NO:20)：
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTFDGSDMGWYRQAPGTECELVSTISSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLNSLKPEDTAVYYCAARLPHIDVVATAKGCKANSYLGQGTQVTVSS
框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：
FR1(SEQ ID NO:21)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLS
CDR1(SEQ ID NO:22)：CTASGFTFDGSDMG
FR2(SEQ ID NO:23)：WYRQAPGT
CDR2(SEQ ID NO:24)：ECELVSTISSDGST
FR3(SEQ ID NO:25)：YYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLNSLKPEDTAVYYC
CDR3(SEQ ID NO:26)：AARLPHIDVVATAKGCKANSY
FR4(SEQ ID NO:27)：LGQGTQVTVSS
实施例2
1抗PD-L1纳米抗体蛋白、抗PD-L1纳米抗体与wasabi融合蛋白的载体构建和表达纯化
(1)抗PD-L1-VHH纳米抗体(抗PD-L1Nb15、抗PD-L1Nb22、抗PD-L1Nb28)的载体构建与表达纯化。
将抗PD-L1纳米抗体的核苷酸序列用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切产物，将其***到PET32a中，构建抗PD-L1纳米抗体的表达载体；转化到BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。离心菌液获得菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心收集上清。通过Ni-IDA亲和层析的方法，获得纯化的抗PD-L1纳米抗体。然后用SDS-PAGE电泳检测(见图2)。
(2)构建抗PD-L1Nb28与wasabi的融合蛋白表达载体，制备wasabi-anti-PD-L1Nb28蛋白。
所述wasabi-anti-PD-L1Nb28融合蛋白的氨基酸序列如下所示。
MVSKGEETTMGVIKPDMKIKLKMEGNVNGHAFVIEGEGEGKPYDGTNTINLEVKEGAPLPFSYDILTT AFSYGNRAFTKYPDDIPNYFKQSFPEGYSWERTMTFEDKGIVKVKSDISMEEDSFIYEIHLKGENFPPNGPVMQKE TTGWDASTERMYVRDGVLKGDVKMKLLLEGGGHHRVDFKTIYRAKKAVKLPDYHFVDHRIEILNHDKDYNKVTVYE IAVARNSTDGMDELYKQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTFDGSDMGWYRQAPGTECELVSTISSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLNSLKPEDTAVYYCAARLPHIDVVATAKGCKANSYLGQGTQVTVSS(带下划线的为wasabi氨基酸序列)。
wasabi-anti-PD-L1Nb28的核苷酸序列如下：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGACCACAATGGGCGTAATCAAGCCCGACATGAAGATCAAGCTGAAGAT GGAGGGCAACGTGAATGGCCACGCCTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGACGGCACCAACACC ATCAACCTGGAGGTGAAGGAGGGAGCCCCCCTGCCCTTCTCCTACGACATTCTGACCACCGCGTTCAGTTACGGCA ACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGACGACATCCCCAACTACTTCAAGCAGTCCTTCCCCGAGGGCTACTCTTGGGA GCGCACCATGACCTTCGAGGACAAGGGCATCGTGAAGGTGAAGTCCGACATCTCCATGGAGGAGGACTCCTTCATC TACGAGATACACCTCAAGGGCGAGAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGGAGACCACCGGCTGGGACG CCTCCACCGAGAGGATGTACGTGCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTCAAGATGAAGCTGCTGCTGGAGGGCGG CGGCCACCACCGCGTTGACTTCAAGACCATCTACAGGGCCAAGAAGGCGGTGAAGCTGCCCGACTATCACTTTGTG GACCACCGCATCGAGATCCTGAACCACGACAAGGACTACAACAAGGTGACCGTTTACGAGATCGCCGTGGCCCGCA ACTCCACCGACGGCATGGACGAGCTGTACAAGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTTGATGGTTCTGACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGACTGAGTGCGAGTTGGTGTCAACTATTAGTAGTGATGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACACTATATCTGCAATTGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGGCGAGGCTGCCCCATATTGATGTGGTCGCTACTGCTAAGGGATGTAAGGCGAACAGCTACTTGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(带下划线的为wasabi核苷酸序列)
将编码wasabi-antiPD-L1Nb28核苷酸序列克隆进PET28a载体，转化到BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。离心菌液获得菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心收集上清。通过Ni-IDA亲和层析的方法，获得纯化的wasabi-anti-PD-L1Nb28。(见图2)
2酶联免疫法(ELISA)鉴定纯化的纳米抗体的特异性
包被抗原蛋白PD-L1(人)、PD-L1(鼠)、PD-L1(猴子)、PD-L2(人),每孔0.5μg，包被IgG1为对照，4℃过夜；第二天用PBST洗3次，加入1％BSA室温封闭2小时；将每个纳米抗体稀释至10μg/mL，分别取100μL与各孔孵育，室温反应1小时；用PBST洗去未结合的抗体，加入1:1000稀释的兔抗HA单克隆抗体，室温孵育一小时。TBST洗板3次，加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育一小时。TBST洗板3次，加入显色液，ELISA板置于酶标仪上读取吸收值。根据吸收值判断纳米抗体的特异性，检测结果显示三个纳米抗体均能够与人源和猴源的PD-L1相互作用，而不与鼠源的PD-L1及人PD－L2相互作用，纳米抗体具有较好的特异性。图3示代表性的antiPD-L1Nb28的特异性。
3荧光显微镜下wasabi-antiPD-L1Nb28鉴定HEK 293T/PD-L1细胞PD-L1表达情况
转染PD-L1质粒到HEK293T细胞，24小时后PBS清洗2遍，加入4％多聚甲醛固定15min。PBS清洗2遍，加入1％BSA于37℃封闭1h。PBS清洗，实验组加入wasabi-antiPD-L1Nb28蛋白，对照组加入wasabi对照，PBST清洗，荧光显微镜检测HEK293T细胞膜上PD-L1表达情况。可见HEK293T/PD-L1实验组在细胞膜位置出现明显荧光(图4)。
序列表
<110> 东南大学
<120> 抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> 骆驼(Camel)
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggaggggc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cacctccact agcaactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtcgcagct atttatactg gtggtggtag cacatactat 180
gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcaggggat 300
ttggaccccg ccgaatatag cgactatgac cctaccgtct ttaactactg gggccagggg 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Ser Asn
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Asp Leu Asp Pro Ala Glu Tyr Ser Asp Tyr Asp Pro Thr
100 105 110
Val Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Arg Leu Ser
20
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 4
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Ser Asn Cys Met Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 5
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 6
Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ser Thr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 38
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 7
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 8
Ala Ala Gly Asp Leu Asp Pro Ala Glu Tyr Ser Asp Tyr Asp Pro Thr
1 5 10 15
Val Phe Asn Tyr
20
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 9
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 354
<212> DNA
<213> 骆驼(Camel)
<400> 10
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgacactc 60
tcctgtgtag cctctgggtt cacttttgat ggttctgaca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggactg agtgcgagtt ggtgtcaact attagtagtg atggaagcac atactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgcg acttcactgc 300
acgggtagct gggccttgat aatgggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu His Cys Thr Gly Ser Trp Ala Leu Ile Met Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 21
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser
20
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 13
Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser Asp Met Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 14
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Thr
1 5
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 15
Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 38
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 16
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 17
Ala Arg Leu His Cys Thr Gly Ser Trp Ala Leu Ile
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 18
Met Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 381
<212> DNA
<213> 骆驼(Camel)
<400> 19
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggatt cacttttgat ggttctgaca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggactg agtgcgagtt ggtgtcaact attagtagtg atggtagcac atactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac actatatctg 240
caattgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccgtgtatt actgtgcggc gaggctgccc 300
catattgatg tggtcgctac tgctaaggga tgtaaggcga acagctactt gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc a 381
<210> 20
<211> 127
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Pro His Ile Asp Val Val Ala Thr Ala Lys Gly Cys Lys
100 105 110
Ala Asn Ser Tyr Leu Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser
20
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 22
Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Ser Asp Met Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 23
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Thr
1 5
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 24
Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 38
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 25
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 26
Ala Ala Arg Leu Pro His Ile Asp Val Val Ala Thr Ala Lys Gly Cys
1 5 10 15
Lys Ala Asn Ser Tyr
20
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 骆驼(Camel)
<400> 27
Leu Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccggaattct caggtgcagc tggtggagtc tgg 33
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcccaagctt tgaggagacg gtgacctggg t 31

Claims (10)

1.抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQID NO:11或SEQ ID NO:20所示。
2.抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗体VHH链包括框架区和互补决定区；其中：
所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQ ID NO:3，FR2、SEQ ID NO:5，FR3、SEQID NO:7，FR4、SEQ ID NO:9；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQ ID NO:4，CDR2、SEQ ID NO:6，CDR3、SEQ ID NO:8；
或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQ ID NO:12，FR2、SEQ ID NO:14，FR3、SEQ ID NO:16，FR4、SEQ ID NO:18；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQ ID NO:13，CDR2、SEQ ID NO:15，CDR3、SEQ ID NO:17；
或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQ ID NO:21，FR2、SEQ ID NO:23，FR3、SEQ ID NO:25，FR4、SEQ ID NO:27；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQ ID NO:22，CDR2、SEQ ID NO:24，CDR3、SEQ ID NO:26。
3.编码抗PD-L1纳米抗体的基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:19。
4.重组载体，其特征在于，所述重组载体中包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:19序列。
5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:19序列。
6.权利要求1或2所述抗PD-L1纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建抗PD-L1纳米抗体噬菌体文库；
(2)选择与PD-L1具有特异结合的纳米抗体噬菌体；
(3)培养包含编码抗PD-L1纳米抗体核酸的载体的宿主；
(4)从宿主细胞中纯化获得抗PD-L1纳米抗体。
7.根据权利要求6所述的抗PD-L1纳米抗体的制备方法，其特征在于，采用巢式PCR方法构建抗PD-L1纳米抗体的文库，其中第一轮扩增反应引物序列为SEQ ID NO:28-29，第二轮扩增反应引物序列为SEQ ID NO:30-31。
8.免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有抗PD-L1纳米抗体的VHH链或抗PD-L1纳米抗体；和wasabi蛋白。
9.权利要求1或2所述的抗PD-L1纳米抗体在(a)制备检测PD-L1的试剂盒；(b)制备***药物中的应用。
10.权利要求8所述的免疫偶联物在(a)制备检测PD-L1的试剂盒；(b)制备***药物中的应用。
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