CN107643282A - 一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法。由抗体包被板、尿转铁蛋白酶标抗体、包被缓冲液、封闭液、尿转铁蛋白标准品和标准品稀释液、洗涤液和样本稀释液以及化学发光底物液组成。是基于化学发光酶免疫分析法检测人UTF浓度水平的试剂盒,采用化学发光底物催化酶HRP结合抗‑UTF抗体,然后与样品或抗原反应形成免疫复合物,再加入化学发光底物液,测量化学发光反应的相对光单位,标准品/样本中UTF抗原的含量和光学***所测量出的相对光单位成正比关系,通过标准曲线拟合,从而对可对尿液标本中UTF的含量进行测定。本发明试剂盒具有较高灵敏度、特异性强、操作简便及成本低廉等显著优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测尿转铁蛋白(UTF)含量的试剂盒及其制备方法,涉及化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CLEIA)法检测人UTF浓度水平的试剂盒的制备工艺。
背景技术
慢性肾病(CKD)及糖尿病肾病(DN)往往存在发现不及时的特点,很容易引起患者的慢性肾衰竭或***,是死亡的主要原因。尤其DN,尽管治疗水平已较以往有很大提高,但其仍然是终末期肾病最主要的原因,约占全部终末期肾病病例的44%,因此,早期发现CKD及DN出现的肾损伤,做出早期诊断显得尤为重要。
传统的肾损伤早期诊断方法在各方面都存在一些不足之处,如传统的血肌酐判断肾脏疾病的方法,漏诊率较高,且其结果呈现异常时,肾功往往已经进入失代偿期。尿液的检查因其无痛,无创伤性而有利于临床检验和科学研究。但目前仅常规测量几种尿液参数,例如,肌酐,尿素,白蛋白,血细胞(红细胞、白细胞以及细胞管型等),细菌,糖,***原,胆红素和PH值。这些分析对于诊断肾损伤是十分有限的,而且上述指标在其他疾病状态时也会有所改变,缺乏足够的灵敏度和选择性,特别是在肾损伤早期,一些指标的变化并不明显。
目前通过尿液检测早期肾损伤的方法是定期检测尿中白蛋白及β2-微球蛋白,但有研究及临床观察发现,在肾损伤早期,患者UTF的变化升高比尿微量白蛋白和β2-微球蛋白的升高更为明显,是观察早期肾损伤的更理想的指标。
转铁蛋白是血浆中的一种含铁蛋白质,分子量7.65KDa,在肝脏中形成,和白蛋白相似,均为带负电荷的小分子循环蛋白,但转铁蛋白的等电点较白蛋白高,带有更多的负电荷,而肾小球滤过膜富含的硫酸肝素糖蛋白、唾液酸糖蛋白带有大量负电荷,当转铁蛋白通过滤过膜时,受到的电荷排斥力较白蛋白小,故它较后者容易漏出,因而也更能敏感地反映肾小球电荷屏障的受损。研究证实,UTF在肾病患者中的增高具有显著的相关性,能更敏感地反映肾小球的损伤,其增高程度与肾脏病变的严重程度相关联。
目前市场中检测UTF的方法有胶体金法、酶免法(EIA)、免疫比浊法和放免法(RIA)。其中胶体金法灵敏度较低,易出现假阳性,其结果易受主观因素的影响;免疫比浊法特异性较差;酶联免疫检测法灵敏度低。
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光免疫分析技术包含两个部分,即免疫反应技术和化学发光分析。化学发光分析是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应技术将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。本发明是采用化学发光法中的化学发光酶免疫分析(CLEIA)法检测人UTF的含量。
CLEIA法以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP),它们有各自的发光底物。
辣根过氧化物酶(HRP)标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺(luminol),或其衍生物如异鲁米诺,是一类重要的发光试剂。鲁米诺及与其配套使用的HRP价格便宜、来源方便是其一大优点,但存在发光效率低的缺点,因此本发明利用增强剂来增加发光信号的强度,延长发光时间,在考虑低成本、便利性的同时提高反应的灵敏度和稳定性。本发明发光底物反应体系采用鲁米诺/H2O2/HRP/对碘苯酚***。
发明内容
本发明试剂盒采用的化学发光酶免疫分析法,首先用HRP标记抗UTF抗体,包被于抗体包被板后与添加的UTF抗原反应形成免疫复合物,再加入化学发光底物液,即可测量化学发光反应的相对光单位(RLU);标准品/样本中UTF的含量和光学***所测量出的相对光单位(RLU)成正比关系,通过标准曲线拟合,从而对可对尿液标本中UTF含量进行定量测定。
本发明试剂盒主要由抗体包被板及各反应试剂组成,所有反应均在抗体包被板的微孔中进行。
本发明试剂盒中的反应试剂配方如下:
1)HRP标记的UTF抗体,储存于0.15mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4)中,缓冲液中含20~40%甘油的保护剂和0.5~2%质量体积比的BSA的稳定剂;
2)包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6);
3)封闭液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含2.5%~5%质量体积比的BSA和0.03~0.05%的硫柳汞;
4)标准品为600μg/ml的尿转铁蛋白抗原,贮存于0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含0.05~0.1%质量体积比的叠氮钠及0.5~1%质量体积比的海藻糖;
5)标准品稀释液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含0.5~2%质量体积比的BSA;用时将600μg/ml的尿转铁蛋白抗原标准品稀释为0,50,200,600,2000,6000ng/ml浓度。
6)洗涤液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含0.01~0.05%质量体积比的Tween-20;
7)样本稀释液为0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(Ph6.5),含0.5~2%质量体积比的BSA;
8)化学发光底物液:由A液和B液组成,A液:0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(PH8.5),含4mg/ml鲁米诺和0.5mg/ml对碘苯酚;B液:0.1mol/L柠檬酸缓冲液(Ph4.6),含200mg/ml过氧化氢;使用时将A、B两液等体积混合。
应用本发明的试剂盒进行UTF检测,具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽、无放射性污染等优点。
附图说明
图1.本发明试剂盒检测剂量-反应标准曲线图。
图2.本发明试剂盒UTF发光强度随时间变化曲线。
图3.本发明试剂盒UTF发光强度随免疫时间变化图。
图4.本发明试剂盒UTF发光强度随化学发光反应时间变化图。
图5.本发明试剂盒检测100例尿液标本UTF含量图。
图6.本发明试剂盒(UTF-CLEIA)与市售乳胶凝集免疫比浊法试剂盒(UTF-LEIT)检测尿液样本的相关性图。
具体实施方式
实施例1.UTF抗体的酶标记方法:
将HRP标记于UTF采用简易过碘酸钠法,以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。
简易过碘酸钠法的标记原理为:HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH 4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
简易过碘酸钠法的标记步骤如下:
1)称取HRP 5mg溶解于1ml去离子水中;
2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;
3)将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;
4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入1mg UTF抗体,在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;
5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再于4℃静置2小时;
6)将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜;
7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,于4℃静置1小时;
8)3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于10ml的0.15M PH7.4的PBS中;
9)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入50%体积比的甘油作为保护剂和2%质量体积比的BSA作为稳定剂分装后,冰冻保存,浓度为500μg/ml。
实施例2.应用本发明试剂盒的检测方法及标准曲线的确立:
1)将100μl的酶标抗体用包被液稀释至10μg/ml后包被在抗体包被板的微孔中,37℃温育10分钟;
2)将标准品用标准品稀释液稀释为0,50,200,600,2000,6000ng/ml浓度,将不同浓度的标准品分别加入到包被有酶标抗体的微孔中,温育45分钟;
3)用洗涤液洗涤4~5次,拍干;
4)每个微孔中再分别加入化学发光底物液A液50μl和B液50μl,混匀后37℃避光温育10分钟;
5)抗体包被板置于BHP-9504型微孔发光板分析仪进行发光分析,以抗原浓度为横坐标,以相对光单位为纵坐标,绘制工作曲线(如图1所示)。
实施例3.应用本发明试剂盒化学发光底物液检测UTF时发光强度随时间的变化:
在HRP/H2O2/鲁米诺/对碘苯酚增强体系中,通过加入对碘苯酚这个增强剂,可使发光强度增加并延长发光时间。使用10μg/ml酶标抗体抗体包被,检测200ng/ml浓度标准品,加入化学发光底物液A液50μl和B液50μl后测量不同时间下的相对光单位,可见加入化学发光底物液10分钟后的相对光单位达到峰值,而后呈缓慢下降的平台期,平台期在较高的相对光单位值可维持40分钟以上(如图2所示)。
实施例4.免疫反应时间的选取:
37℃温育条件下在不同的免疫时间15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟下,检测各浓度标准品的相对光单位,如图3所示,在45分钟后,免疫达到一个平衡,各个浓度点的发光值变化较小,因此,为提高检测效率,将本发明试剂盒免疫时间设定为45分钟。
实施例5.化学发光反应时间的选取:
再加入化学发光底物液后马上进行检测,然后每5分钟间隔测定一次,持续80分钟,如图4所示,发光值在0~30分钟时间段内处于上升期,在30~70分钟时间段内达到一个平台期;由于在37℃避光温育10分钟的条件下发光值较高,因此将本发明试剂盒化学发光底物液加入后的化学发光反应时间设定为45分钟。
实施例6.本发明试剂盒临床标本检测分析:
100例临床患者尿液检测结果如图5和表1所示:50例健康对照组尿液的UTF浓度为28.66±10.93ng/ml;50例慢性肾损伤患者尿液的UTF浓度为544.84±172.88ng/ml;慢性肾损伤患者尿液的UTF浓度明显高于健康对照组尿液的UTF浓度,和健康对照组P=0.009<0.05,有显著差异。
表1 100例尿液标本UTF含量统计分析:
实施例7.本发明试剂盒(UTF-CLEIA)与市售乳胶凝集免疫比浊法试剂盒(UTF-LEIT)检测尿液样本的UTF检测值比较:
将本发明试剂盒与临床使用的乳胶凝集免疫比浊法检测UTF的试剂同时对100例临床尿液样本进行检测。这100例样本的相关性分析如图6所示,x轴表示市售乳胶凝集免疫比浊法试剂盒(UTF-LEIT)检测得到的UTF浓度,y轴表示本发明试剂盒(UTF-CLEIA)检测得到的UTF浓度。可见两种方法有良好的相关性,相关方程为Y=0.9631X+0.9716,相关系数为0.9591。表明两种检测方法的一致性相当可靠,具有很好的临床检测性能相仿性。
实施例8.本发明试剂盒的精密度:
将三种不同浓度的标准品单次测定平行10孔得出批内差异,重复操作三次,得出批间差异,结果如表2所示,批内差异和批间差异均小于14.6%。
表2本发明试剂盒的批内差异和批间差异
实施例9.本发明试剂盒的特异性:
用本方法检测尿样本中UTF浓度时的交叉反应物尿微量白蛋白、α1-微球蛋白、肝细胞生长因子、β2-微球蛋白,计算交叉反应率,结果分别为0.099%、0.027%、0.046%和0.083%,无交叉反应。
实施例10.本发明试剂盒的稳定性:
对本发明试剂盒进行37℃3天、6~8℃6个月跟踪检测,标准曲线等各项功能指标均符合质量控制要求,本发明试剂盒的有效使用期可达半年以上。
Claims (4)
1.一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法。其特征在于:试剂盒主要由抗体包被板、尿转铁蛋白酶标抗体、包被缓冲液、封闭液、尿转铁蛋白标准品和标准品稀释液、洗涤液和样本稀释液以及化学发光底物液组成。
2.根据权利要求1所述的化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒,其特征在于:各种试剂的组成成分如下:
1)尿转铁蛋白酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的尿转铁蛋白抗体,贮存于0.15mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4)中,缓冲液中含20~40%甘油的保护剂和0.5~2%质量体积比的BSA的稳定剂;
2)包被缓冲液:0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6);
3)封闭液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含2.5%~5%质量体积比的BSA和0.03~0.05%的硫柳汞;
4)标准品:600μg/ml尿转铁蛋白抗原,贮存于0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含0.05~0.1%质量体积比的叠氮钠及0.5~1%质量体积比的海藻糖;
5)标准品稀释液:0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含0.5~2%质量体积比的BSA;用时将600μg/ml的尿转铁蛋白抗原标准品稀释为0,50,200,600,2000,6000ng/ml浓度。
6)洗涤液:0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4),含0.01~0.05%质量体积比的Tween-20;
7)样本稀释液:0.1mol/LTris-HCl缓冲液(Ph6.5),含0.5~2%质量体积比的BSA;
8)化学发光底物液:由A液和B液组成,A液:0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(PH8.5),含4mg/ml鲁米诺和0.5mg/ml对碘苯酚;B液:0.1mol/L柠檬酸缓冲液(Ph4.6),含200mg/ml过氧化氢;使用时将A、B两液等体积混合。
3.根据权利要求1所述的化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒,其特征还在于该试剂盒的抗体包被板适用于BHP-9504型微孔发光板分析仪。
4.根据权利要求2所述的尿转铁蛋白酶标抗体,其特征在于酶与抗体的交联方法采用过碘酸钠法。
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