CN103954766A - 转铁蛋白受体检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种转铁蛋白受体含量检测试剂盒，所述检测试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：缓冲剂、防腐剂、螯合剂、表面活性剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒、缓冲剂、防腐剂、助悬剂和水；所述包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳颗粒的粒径为120～200nm。还涉及转铁蛋白受体含量检测试剂盒的制备方法，其中包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒采用化学交联法制备；本发明通过选择合适粒径的氨基基团胶乳微球颗粒及使用化学交联法制备胶乳微球颗粒，使制备的转铁蛋白受体检测试剂盒提高了灵敏度和稳定性、延长了货架期和开瓶稳定期。

Description

转铁蛋白受体检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及转铁蛋白受体含量检测领域，尤其涉及一种转铁蛋白受体检测试剂盒及制备方法。 
背景技术
铁以三种不同的方式分布于人体：约80%的铁参与转运氧的血红蛋白和储存氧的肌红蛋白，还有几种存在于细胞氧化和呼吸链的酶中。过剩的铁与铁蛋白和含铁血黄素结合以备使用，因为游离的铁对细胞是有毒性的。只有约0.1%的铁在血液循环中被运输，它们与转铁蛋白结合，从“产地”——与具有生理功能的铁结合的蛋白（例如：在骨髓中合成的血红蛋白）被运往“储存地”（例如：肝中的铁蛋白）。在健康的人体中，每天从食物中摄取大约1mg的铁，并且有等量的铁丢失。红细胞含有大多数的铁，另外有少部分但是必不可少的铁提供给肌肉和酶，使它们进行正常活动。过剩的铁与铁蛋白结合，储存在不同的细胞中。 
参与正常生理活动的铁/生成水平的铁的总量可由可溶性转铁蛋白受体（sTfR）的量来反映。这种可溶性的细胞受体可介导结合了铁的转铁蛋白进入红细胞样细胞前体。循环的可溶性受体与带受体的细胞的密度成一定比例，随着对铁的需求量的增加和红细胞量的增多而增多。 
转铁蛋白受体是一穿膜的糖蛋白，它倾向于结合已经结合了二价铁的转铁蛋白，并且通过受体介导的内吞作用进入细胞。所有的体细胞都在其表面表达转铁蛋白受体，但75～80％的转铁蛋白受体存在于骨髓的红细胞样细胞的前体中。肝和胎盘的组织中转铁蛋白受体的密度也很高。转铁蛋白受体的细胞外部分经剪切后成为可溶性转铁蛋白受体，它与细胞上的受体的浓度成一定的比例。测定可溶性转铁蛋白受体的主要目的是诊断是否 缺铁。由于它是一个极为灵敏的标志物，诊断结果可与慢性疾病引起的贫血相区别。又由于它与红细胞生成的量有关，因此它可作为监测红细胞生成治疗效果的最早的标志物。 
目前转铁蛋白受体的检测产品其方法学多是基于普通的免疫比浊法和酶联免疫法。普通的免疫比浊法是利用反应体系中的抗原抗体反应形成免疫复合物，在一定时间内复合物聚合出现浊度。该检测方法较传统的免疫化学定量方法敏感、快速、简便，但是要求反应时形成的免疫复合物的数量和分子量达到一定高度，否则就难以测出。酶联免疫法是使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定的最后加入酶反应的底物，底物被酶催化变为有色产物，有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，该检测方法由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。但是酶联免疫法检测操作繁琐、自动化程度低、耗时很长，不利于检验科的快速检测，同时由于酶联免疫适合批量检测，因而不适用于单个样本的及时检测。胶乳增强免疫比浊法是近年来出现的一种体液蛋白均相免疫比浊检测方法，它是通过在高分子胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度，该检测方法省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，此法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，能较真实地反映被测物质的含量。但是胶乳增强免疫比浊法检测转铁蛋白受体试剂盒仍存在灵敏度和稳定性有待提高、货架期及开瓶稳定期较短的问题。 
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种转铁蛋白受体检测试剂盒及 制备方法，通过选择合适粒径的氨基基团胶乳微球颗粒及使用化学交联法制备胶乳微球颗粒，使制备的转铁蛋白受体检测试剂盒提高了灵敏度和稳定性、延长了货架期和开瓶稳定期。 
一种转铁蛋白受体含量检测试剂盒，所述检测试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：缓冲剂、防腐剂、螯合剂、表面活性剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒、缓冲剂、防腐剂、助悬剂和水；所述包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳颗粒的粒径为120～200nm。 
在上述技术方案中，所述抗转铁蛋白受体抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 
在上述技术方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述防腐剂为Proclin 300；所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；所述表面活性剂为吐温20；所述助悬剂为乙二醇。 
在上述技术方案中，每1L试剂Ⅰ中各组分的用量为防腐剂：0.05-2mL，螯合剂为0.1-5g，表面活性剂0.1-3mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。 
在上述技术方案中，每1L试剂Ⅰ中各组分的用量为防腐剂：0.1-1mL，螯合剂为1-3g，表面活性剂1-2mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。 
在上述技术方案中，每1L试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被抗转铁蛋白受体抗体胶乳微球颗粒0.1-5g、防腐剂0.05-2mL、助悬剂5-50mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。 
在上述技术方案中，每1L试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被抗转铁蛋白受体抗体胶乳微球颗粒1-3g、防腐剂0.1-1mL、助悬剂10-30mL，余量为磷酸盐缓冲溶液； 
在上述技术方案中，所述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的pH值范围为6.5～8.5。 
在上述技术方案中，包括以下步骤：（1）制备试剂Ⅰ：将防腐剂、螯合剂、表面活性剂溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解，混合均匀，并用磷酸 缓冲液定容，得到试剂Ⅰ；（2）制备试剂Ⅱ：制备包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液；将防腐剂、助悬剂溶解于磷酸缓冲液中；将胶乳微球颗粒溶液与混合溶液混匀，定容，得到试剂Ⅱ。 
在上述技术方案中，所述包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒采用化学交联法制备得到，所述化学交联法制备包被转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒包括以下步骤： 
（1）洗涤胶乳：取适量氨基胶乳微球颗粒溶液用活化缓冲液稀释，震荡混合均匀，再加入表面活性剂，震荡混合均匀，离心弃上清，保留沉淀，沉淀用6mmol/L磷酸缓冲液重悬； 
（2）抗体溶液的配制：取抗体溶液，用6mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取EDC粉末用去离子水配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：将步骤（1）所得胶乳微球颗粒重悬液与步骤（2）所得抗体溶液混合，室温下培育15-30分钟；再加入步骤（3）所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.0-7.0，室温条件下在摇床上反应2-3小时； 
（5）向步骤（4）中反应完成的体系中加入BSA溶液，反应10-15分钟，离心弃上清，并用6mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用6mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
本发明的检测试剂盒通过实验筛选胶乳颗粒粒径及类型，优选直径为120-200nm的氨基基团胶乳微球颗粒作为制备本发明检测试剂盒的原料之一，合适的粒径能有效保证所制备的检测试剂盒的稳定性、灵敏度以及良好的检测线性范围；抗转铁蛋白受体的抗体包被优选粒径的胶乳微球颗粒采用特定的化学交联法，将抗体与胶乳微球颗粒上的基团通过化学键的方式结合到一起的，化学键的稳定性较强，能保证检测试剂盒中包被抗体的 胶乳微球颗粒的稳定性，进而保证了检测试剂盒品质的稳定性，延长了试剂盒的货架期和开瓶稳定期。 
附图说明
图1为本发明实施例1-5制备的转铁蛋白受体含量检测试剂盒标准工作曲线； 
图2为本发明实施例2制备的检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒测定人血清中转铁蛋白受体含量其结果的相关性图； 
图3为本发明实施例4制备的检测试剂盒热稳定性检验结果图； 
图4为本发明实施例提供的检测试剂盒制备过程中抗转铁蛋白受体的抗体包被胶乳微球颗粒原理图。 
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述。 
实施例1 
包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液的制备： 
（1）洗涤胶乳：取0.5mL粒径为120 nm浓度为10%（w/v）的氨基胶乳微球颗粒（购自Poly Microspheres公司）于10 mL离心管中，向离心管中加入4.5 mL 0.12 mol/LpH值为7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5 mL浓度为6 mmol/L pH值为7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒； 
（2）抗体溶液的配制：取一定量的抗体溶液（购自台湾Abnova Corporation），用6mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取10 mg的EDC粉末用10 mL去离子水溶解，配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：取5mL（1）步所得胶乳微球颗粒重悬液与5mL（2）步所得抗体溶液按照1:1混匀，室温下培育25分钟；再加入3mL的（3）步所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.5，室温条件下在摇床上反应2.5小时。 
（5）向（4）步反应完成的体系中加入2 mL 1%（w/v）浓度的BSA 溶液，反应15分钟，离心弃上清，并用6mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用1mL6mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
检测试剂盒的制备： 
1、试剂Ⅰ的制备： 
按所述用量取各组分： 
Procline 300                         0.5mL 
乙二胺四乙酸二钠                     1.5g 
吐温20                               1.2mL 
将上述各组分溶解于900mL pH为7.0浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用pH为7.0浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
2、试剂Ⅱ的制备： 
按所述用量量取各组分： 
Procline300                        0.5mL 
乙二醇                             25mL 
将上述各组分溶解于800mLpH为7.0浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，搅拌、充分溶解后加入35份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，后用pH为7.0浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
实施例2 
包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液的制备： 
（1）洗涤胶乳：取0.6mL粒径为160 nm浓度为10%（w/v）的氨基胶乳微球颗粒（购自Poly Microspheres公司）于10mL离心管中，向离心管中加入4.4mL 0.12mol/L pH值为7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得 胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为5mmol/L pH值为7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒； 
（2）抗体溶液的配制：取一定量的抗体溶液（购自台湾Abnova Corporation），用6mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取10mg的EDC粉末用10mL去离子水溶解，配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：取5mL（1）步所得胶乳微球颗粒重悬液与5mL（2）步所得抗体溶液按照1:1混匀，室温下培育20分钟；再加入4mL的（3）步所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.5，室温条件下在摇床上反应2.5小时； 
（5）向（4）步反应完成的体系中加入3mL 1%（w/v）浓度的BSA溶液，反应20分钟，离心弃上清，并用6mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用1mL5mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
检测试剂盒的制备： 
1、试剂Ⅰ的制备： 
按所述用量取各组分： 
Procline300                        0.25mL 
乙二胺四乙酸二钠                   2g 
吐温20                             1.5mL 
将上述各组分溶解于900mL pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
2、试剂Ⅱ的制备： 
按所述用量量取各组分： 
Procline300                         0.25mL 
乙二醇                             20mL 
将上述各组分溶解于800mL pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，搅拌、充分溶解后加入30份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
实施例3 
包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液的制备： 
（1）洗涤胶乳：取0.8mL粒径为200 nm浓度为10%（w/v）的氨基胶乳微球颗粒（购自Poly Microspheres公司）于10mL离心管中，向离心管中加入4.2mL0.12mol/L pH值为7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为5mmol/L pH值为7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒； 
（2）抗体溶液的配制：取一定量的抗体溶液（购自台湾Abnova Corporation），用6mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取10mg的EDC粉末用10mL去离子水溶解，配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：取5mL（1）步所得胶乳微球颗粒重悬液与5mL（2）步所得抗体溶液按照1:1混匀，室温下培育20分钟；再加入4mL的（3）步所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.5，室温条件下在摇床上反应2.5小时。 
（5）向（4）步反应完成的体系中加入3mL 1%（w/v）浓度的BSA溶液，反应20分钟，离心弃上清，并用6mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用1mL5mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
检测试剂盒的制备： 
1、试剂Ⅰ的制备： 
按所述用量取各组分： 
Procline300                        0.6mL 
乙二胺四乙酸二钠                   1.8g 
吐温20                             1.0mL 
将上述各组分溶解于900mLpH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
2、试剂Ⅱ的制备： 
按所述用量量取各组分： 
Procline300                        0.6mL 
乙二醇                             15mL 
将上述各组分溶解于800mLpH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，搅拌、充分溶解后加入26份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
实施例4 
包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液的制备： 
（1）洗涤胶乳：取0.5mL粒径为140nm浓度为10%（w/v）的氨基胶乳微球颗粒（购自Poly Microspheres公司）于10mL离心管中，向离心管中加入4.5mL 0.12mol/L pH值为7.2的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为5mmol/L pH值为7.2的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒； 
（2）抗体溶液的配制：取一定量的抗体溶液（购自台湾Abnova Corporation），用5mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取10mg的EDC粉末用10mL去离子水溶解，配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：取5mL（1）步所得胶乳微球颗粒重悬液与5mL（2）步所得抗体溶液按照1:1混匀，室温下培育18分钟；再加入2mL的（3）步所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.5，室温条件下在摇床上反应2.5小时。 
（5）向（4）步反应完成的体系中加入4mL 1%（w/v）浓度的BSA溶液，反应20分钟，离心弃上清，并用5mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用1mL 5mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
检测试剂盒的制备： 
1、试剂Ⅰ的制备： 
按所述用量取各组分： 
Procline300                        1.2mL 
乙二胺四乙酸二钠                   3.5g 
吐温20                             2.5mL 
将上述各组分溶解于900mL pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
2、试剂Ⅱ的制备： 
按所述用量量取各组分： 
Procline300                        1.2mL 
乙二醇                             40mL 
将上述各组分溶解于800mL pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，搅拌、充分溶解后加入32份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液 pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
实施例5 
包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液的制备： 
（1）洗涤胶乳：取0.5mL粒径为180nm浓度为10%（w/v）的氨基胶乳微球颗粒（购自Poly Microspheres公司）于10mL离心管中，向离心管中加入4.5mL 0.12mol/L pH值为7.6的磷酸盐（PBS）缓冲液，离心得胶乳微球颗粒，用去离子水重复洗涤两次胶乳微球颗粒，后用5mL浓度为6mmol/L pH值为7.6的磷酸盐（PBS）缓冲液重悬胶乳微球颗粒； 
（2）抗体溶液的配制：取一定量的抗体溶液（购自台湾Abnova Corporation），用6mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取10mg的EDC粉末用10mL去离子水溶解，配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：取5mL（1）步所得胶乳微球颗粒重悬液与5mL（2）步所得抗体溶液按照1:1混匀，室温下培育20分钟；再加入4mL的（3）步所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.5，室温条件下在摇床上反应2.5小时。 
（5）向（4）步反应完成的体系中加入5mL 1%（w/v）浓度的BSA溶液，反应20分钟，离心弃上清，并用6mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用1mL 6mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
检测试剂盒的制备： 
1、试剂Ⅰ的制备： 
按所述用量取各组分： 
Procline300                        2.5mL 
乙二胺四乙酸二钠                   3.0g 
吐温20                             2.2mL 
将上述各组分溶解于900mL pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
2、试剂Ⅱ的制备： 
按所述用量量取各组分： 
Procline300                       2.5mL 
乙二醇                            35mL 
将上述各组分溶解于800mL pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液中，搅拌、充分溶解后加入35份上述制备得到的包被肝型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒溶液，充分混匀之后，用1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.2，后用pH为7.2浓度为0.05mol/L磷酸缓冲液定容至1L，密封4℃保存，备用。 
检测试剂盒分析性能评估 
1、线性范围 
配制浓度为0nmol/mL，10nmol/mL，20nmol/mL，40nmol/mL，80nmol/mL的转铁蛋白受体标准品溶液，用本发明实施例1-5所制备的转铁蛋白受体含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线。 
本发明检测试剂盒检测样本中转铁蛋白受体含量的流程如下：向5uL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品，校准品购自台湾Abnova Corporation公司）中加入150uL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入50uL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长540nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相 对应的浓度值即为测定浓度。 
测定结果见图1。从图1可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒具有良好的线性，另本发明采用最优化的条件制备出的试剂盒（实施例2），其标准工作曲线较其余优选条件制备出的试剂盒线性更优良。 
2、最低检测限 
取本发明实施例2制备的检测试剂盒，以5%人血清白蛋白为空白样本，按照上述测定“线性范围”的实验方法，重复测定20次，计算结果均值为0.0006，标准差S为0.00012，以空白均值加两倍标准差方法计算吸光度变化量为0.00084，用稀释后浓度分别为0.25nmol/mL、0.5nmol/mL和1.0nmol/mL的转铁蛋白受体校准品溶液测定，吸光度变化值分别为0.0002、0.0008和0.0013，其中浓度为0.5nmol/mL转铁蛋白受体校准品溶液ΔA略高于空白均值加两倍标准差方法来计算值，因此，本发明检测试剂盒检测转铁蛋白受体的灵敏度为0.5nmol/mL。 
3、本发明试剂盒与酶联免疫分析试剂盒测值的相关性试验 
3.1供试试剂盒 
本发明实施例2所制备的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，酶联免疫试剂盒（购自美国R&D Systems公司）； 
3.2试验方法及结果 
通过本发明实施例2所制备的转铁蛋白受体含量检测试剂盒与购自美国R&D公司的酶联免疫试剂盒测定尿液样本中转铁蛋白受体含量的测定值进行比较，试验结果如图2所示，并进行回归分析。从图2中可以看出本发明实施例2所制备的转铁蛋白受体检测试剂盒与酶联免疫检测试剂盒在测定样本中转铁蛋白受体含量方面具有良好的相关性。 
4、试剂盒的重复性和准确度试验 
用购自台湾Abnova公司的转铁蛋白受体溶液稀释成浓度为10nmol/mL样本，用本发明实施例1、实施例2、实施例3制备的转铁蛋白受 体含量检测试剂盒测定稀释样本，每个实施例制备的检测试剂盒重复测定10次，分别计算测定均值（M）和标准差（S），以S/M×100%计算变异系数进行重复性考察，以（1—M/样本浓度）×100%计算相对偏差进行准确度考察，实验结果见下表1，由表1的结果可知本发明实施例2采用最优粒径制备的检测试剂盒其准确度及精密度优于采用其他粒径制备的检测试剂盒。 
表1实施例检测试剂盒的重复性及其准确度结果 
测试序号 实施例1 实施例2 实施例3
1 9.9 9.9 9.5
2 9.6 9.8 9.6
3 10.4 9.9 10.5
4 10.2 10.0 10.5
5 9.7 10.1 9.3
6 10.3 10.2 9.9
7 9.5 10.1 9.7
8 10.8 10.2 10.2
9 10.7 9.9 10.1
10 10.0 10.1 10.5
平均值（M） 10.11 10.02 9.98
标准差（S） 0.45 0.14 0.45
变异系数（CV%） 4.45% 1.40% 4.51%
相对偏差（Bias%） 1.10% 0.20% 0.20%
5、本发明检测试剂盒的热稳定性检测试验 
将本发明实施例4制备的检测试剂盒置于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，在不同的处理时间之后分别测定转铁蛋白受体校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线。试验结果见图3。从图3中结果可知本发 明检测试剂盒具有良好的热稳定性，即具有较长货架期和开瓶稳定期。 
本发明检测试剂盒中的缓冲液是为了使反应体系能够维持一定的pH值，各种能使反应体系维持一定pH值的缓冲液均能作为配制本发明检测试剂盒的缓冲液使用，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ优选磷酸缓冲液作为配制试剂的缓冲液。 
本发明检测试剂盒中的防腐剂是为了防止各种微生物的生长导致产品变质，从而对检测结果带来不良影响，因此，能阻止微生物繁殖的物质均能作为本发明试剂盒的防腐剂使用，如：苯甲酸钠、山梨酸钾、叠氮化钠、Proclin 300等中的一种或几种混合物；为了保证试剂盒的各项性能处于最佳状态，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ优选Proclin 300作为防腐剂。 
本发明检测试剂盒试剂Ⅰ中的螯合剂是为了络合检测样本中的金属离子，避免金属离子对检测结果造成不良影响，能络合金属离子的各种螯合剂均能适用于本发明，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸等。本发明优选乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作为螯合剂。 
本发明检测试剂盒试剂Ⅰ中的表面活性剂有利于反应过程中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散，使反应体系处于均相状态，达到减少样本浊度对检测结果的影响的目的，具有增溶性质的物质均能作为本发明的表面活性剂使用，如：吐温系列、曲拉通系列、乙基苯基聚乙二醇等。为了保证试剂盒的性能更优良，本发明优选吐温20作为表面活性剂。 
本发明检测试剂盒试剂Ⅱ中的助悬剂可以帮助胶乳微球颗粒维持良好的分散状态，防止胶乳微球颗粒下沉对检测试剂盒的稳定性及检测结果的可靠性带来不良影响，各种能增加反应体系黏度的物质均能作为本发明的助悬剂，本发明优选乙二醇作为助悬剂。 
本发明的检测试剂盒通过实验筛选胶乳颗粒粒径及类型，优选直径为120-200nm的氨基基团胶乳微球颗粒作为制备本发明检测试剂盒的原料之一，能有效保证所制备的检测试剂盒的稳定性、灵敏度、稳定性以及良好 的检测线性范围；胶乳颗粒粒径太小检测限会比较高，导致试剂盒灵敏度不高，粒径大了稳定性不好，容易沉降。 
本发明的试剂盒制备过程中，抗转铁蛋白受体的抗体包被优选粒径的胶乳微球颗粒采用特定的化学交联法（原理见图4），通过氨基胶乳微球颗粒上的氨基与抗转铁蛋白受体的抗体上的羰基反应，生成比较稳定的碳氮键，能保证检测试剂盒中包被抗体的胶乳微球颗粒的稳定性，进而保证了检测试剂盒品质的稳定性；本发明检测试剂盒制备过程中采用的抗转铁蛋白受体单克隆抗体和多克隆抗体能特异性的识别并结合转铁蛋白受体蛋白，保证了检测试剂盒的特异性，从而保证了检测结果的准确性。本发明检测试剂盒通过优选组分和优化各组分的含量，使采用本专利技术制备出来的检测试剂盒在各方面的性能均处于最佳状态，使其能更好的满足检测的需求。 
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。 

Claims (10)

1.一种转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒由试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：缓冲剂、防腐剂、螯合剂、表面活性剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒、缓冲剂、防腐剂、助悬剂和水；所述包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳颗粒的粒径为120～200nm。 
2.如权利要求1所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：所述抗转铁蛋白受体抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 
3.如权利要求1所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述防腐剂为Proclin 300；所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；所述表面活性剂为吐温20；所述助悬剂为乙二醇。 
4.如权利要求1中所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：每1L试剂Ⅰ中各组分的用量为防腐剂：0.05-2mL，螯合剂为0.1-5g，表面活性剂0.1-3mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。 
5.如权利要求1中所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：每1L试剂Ⅰ中各组分的用量为防腐剂：0.1-1mL，螯合剂为1-3g，表面活性剂1-2mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。 
6.根据权利要求1所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：每1L试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被抗转铁蛋白受体抗体胶乳微球颗粒0.1-5g、防腐剂0.05-2mL、助悬剂5-50mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。 
7.根据权利要求1所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：每1L试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被抗转铁蛋白受体抗体胶乳微球颗粒1-3g、防腐剂0.1-1mL、助悬剂10-30mL，余量为磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的pH值范围为6.5～8.5。 
9.一种权利要求1-8中任一项所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）制备试剂Ⅰ：将防腐剂、螯 合剂、表面活性剂溶解于磷酸缓冲液中，充分溶解，混合均匀，并用磷酸缓冲液定容，得到试剂Ⅰ；（2）制备试剂Ⅱ：制备包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液；将防腐剂、助悬剂溶解于磷酸缓冲液中；将胶乳微球颗粒溶液与混合溶液混匀，定容，得到试剂Ⅱ。 
10.如权利要求9所述的转铁蛋白受体含量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒采用化学交联法制备得到，所述化学交联法制备包被转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒包括以下步骤： 
（1）洗涤胶乳：取适量氨基胶乳微球颗粒溶液用活化缓冲液稀释，震荡混合均匀，再加入表面活性剂，震荡混合均匀，离心弃上清，保留沉淀，沉淀用6mmol/L磷酸缓冲液重悬； 
（2）抗体溶液的配制：取抗体溶液，用6mmol/L磷酸缓冲液稀释，调pH到5.0； 
（3）EDC溶液的配制：取EDC粉末用去离子水配制成浓度为10mg/mL的EDC溶液； 
（4）抗体偶联胶乳微球颗粒的制备：将步骤（1）所得胶乳微球颗粒重悬液与步骤（2）所得抗体溶液混合，室温下培育15-30分钟；再加入步骤（3）所得EDC溶液；用0.1M氢氧化钠溶液调整反应体系的pH至6.0-7.0，室温条件下在摇床上反应2-3小时； 
（5）向步骤（4）中反应完成的体系中加入BSA溶液，反应10-15分钟，离心弃上清，并用6mmol/L磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，后用6mmol/L磷酸缓冲液重悬沉淀，既得包被抗转铁蛋白受体抗体的胶乳微球颗粒溶液。 
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