CN113999285B

CN113999285B - 抗菌七肽及其应用

Info

Publication number: CN113999285B
Application number: CN202111458874.8A
Authority: CN
Inventors: 计剑; 张鹏; 黄俊杰; 薛云帆; 赵俊博
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2023-02-14
Anticipated expiration: 2041-12-02
Also published as: CN113999285A

Abstract

本发明公开了五种抗菌七肽及其应用。这五种抗菌七肽的氨基酸序列分别为：R‑I‑W‑R‑W‑F‑F‑NH₂，R‑I‑W‑R‑W‑F‑W‑NH₂，R‑I‑W‑R‑W‑L‑F‑NH₂，R‑W‑W‑R‑F‑F‑F‑NH₂，R‑W‑W‑R‑W‑F‑F‑NH₂。这五种抗菌七肽具有强力的杀菌性能，且实际成本低，可用于制备治疗和/或预防细菌感染的药物。

Description

抗菌七肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及五种抗菌七肽及其应用。

背景技术

抗生素的滥用导致了细菌耐药性的产生，从而使细菌感染再一次成为一项威胁人类健康的重大安全问题。

如今，由耐药菌引起的疾病已经越来越多，更为严重的是，多重耐药菌甚至超级细菌的出现，意味着目前的抗生素治疗体系濒临崩溃。

为了应对这一问题，急需开发新型抗菌药物用于细菌感染的治疗。

细菌的耐药性作用主要有4类：

1、产生灭活酶分解进入细菌内部的抗生素；

2、改变细菌细胞膜通透性阻止抗生素的进入；

3、形成外排泵排除抗生素；

4、改变药物靶点使抗生素失效。

抗菌肽是一种具有特定氨基酸序列的抗菌生物分子，抗菌肽一般携带正电荷并且具有σ-螺旋或者β折叠等二级结构。

抗菌肽的正电性使得其更易吸附并聚集于带负电的细菌细胞膜表面，而二级结构则使得抗菌肽可以***细菌细胞膜的磷脂双分子层并自组装形成孔洞结构杀死细菌。

所以，抗菌肽的杀菌机理是破坏细菌细胞膜，与上述提到的细菌获得耐药性的4个方面毫无关联，因此抗菌肽不易产生耐药性，并被认为是下一代抗生素的替代物。

目前，抗菌肽大多包含10-60个氨基酸或以上序列(如公开号为CN 111892646 A、CN 109180794 A的专利技术等)。

然而，抗菌肽的序列过长一方面容易产生较大的生物毒性，另一方面也增加了工业生产成本，这限制了抗菌肽的应用。但是，抗菌肽序列长度缩短容易导致抗菌肽的抗菌活性降低。

发明内容

针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了五种抗菌七肽，具有强力的杀菌性能，并保证较小的细胞毒性以及溶血性，且实际成本低。

五种抗菌七肽的氨基酸序列分别为下述之一：

抗菌肽1：R-I-W-R-W-F-F-NH₂(SEQ ID NO：1)，

抗菌肽2：R-I-W-R-W-F-W-NH₂(SEQ ID NO：2)，

抗菌肽3：R-I-W-R-W-L-F-NH₂(SEQ ID NO：3)，

抗菌肽4：R-W-W-R-F-F-F-NH₂(SEQ ID NO：4)，

抗菌肽5：R-W-W-R-W-F-F-NH₂(SEQ ID NO：5)。

上述五种抗菌七肽因其独特的氨基酸序列，可表现出显著的杀菌活性，并且在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性，能够应用于治疗因细菌引起的肺炎、败血症等疾病的药物中。

本发明还提供了所述的五种抗菌七肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。

本发明还提供了一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物，所述药物含有所述的五种抗菌七肽中的至少一种。

本发明提供的五种抗菌七肽具有对细菌的抗/杀菌普适性，其主要作用机理为破坏细菌细胞膜。这五种抗菌七肽的净电荷为正，可以吸附到表面带负电的细菌细胞膜。而当吸附在细胞膜表面的这五种抗菌七肽达到一定浓度时，两亲性的多肽就会***细胞膜的磷脂层并在其中自组装产生孔洞破坏细菌细胞膜，从而杀死细菌。因此本发明五种抗菌七肽具有抗菌广谱性，对多种细菌均具有杀灭作用。

所述细菌可为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌，具体可为金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌等。

所述治疗和/或预防细菌感染的药物还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：

1)本发明通过大量研究，发现了上述五种特定序列的抗菌七肽具有强效抗/杀菌活性，能够应用于治疗或者预防因细菌引起的疾病的药物中。

2)本发明的抗菌七肽可人工合成(可采用现有常规技术，如采用固相法合成等)，操作方便，肽链短，不论是制备成本还是原料成本、应用成本，都非常低，具有非常好的应用前景。

附图说明

图1为抗菌肽1的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

图2为抗菌肽2的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

图3为抗菌肽3的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

图4为抗菌肽4的HPLC(a)与质谱(b)结果图；

图5为抗菌肽5的HPLC(a)与质谱(b)结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

抗菌肽1-5的固相合成：

一、树脂溶胀

称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)(15mL/g)，振荡30分钟.

二、接第一个氨基酸

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1小时。用DMF和DCM交替清洗6遍。

三、脱保护

加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，5分钟，去掉再加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，15分钟。

四、检测

抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。

五、洗

DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

六、缩合

保护氨基酸(Fmoc-L-Gly-OH)三倍过量，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入N-甲基***啉(NMM)十倍过量。反应30分钟。

七、洗

DMF(10mL/g)一次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

八、重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

九、最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂。

DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，抽干10分钟。

十、从树脂上切割多肽

配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％。

将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10mL/g，恒温震荡，时间：120分钟。

十一、吹干洗涤

将裂解液用氮气尽量吹干，用***层析出来，再用***洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。

十二、用HPLC纯化多肽

具体操作步骤：

1，取粗品肽200mg放入器皿中。用2-5mL 50％的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2分钟。

2，用0.45μm滤膜过滤溶解液。

3，分析：取3μL用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30分钟，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5分钟然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％

4，制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10分钟，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40分钟。收集从检测器出来的样品。

5，鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。

十三、最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。

十四、将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。

图1-5分别依次为抗菌肽1-5的HPLC(a)与质谱(b)结果图。

实施例2

抗菌肽的抗菌活性检测。

以下的所使用的标准菌株均购于广东省微生物菌种保存中心。

采用96孔板法对实施例1合成的抗菌七肽的抗菌活性进行检测，以评价抗菌肽1-5的抗菌活性。

按以下步骤测试抗菌肽的抗菌活性。

一、将金黄色葡萄球菌(S.aureus)在灭菌的TSA培养基平板上培养过夜，挑取单菌落接种于灭菌的TSB培养基中37℃，150rpm，18小时过夜培养。

二、将抗菌肽1-5分别用PBS配成1024μg/mL，并按照2倍连续稀释的方式用PBS稀释成1024，512，256，128，64，32，16，8，4μg/mL并吸取100μL加入96孔板的2-9列孔位并重复6组加入B-G行。将培养后的细菌用TSB稀释成5×10^5CFU/mL，并在B2-D9孔中加入100μL稀释后的菌液作为实验组。此时，待测的肽的浓度(μg/mL)如下：

列数	2	3	4	5	6	7	8	9
									浓度	512	256	128	64	32	16	8	4

在E2-G9孔中加入100μL TSB溶液作为对照组，并在B10-D10孔中分别加入100μLPBS以及TSB作为阴性对照，在E10-G10孔中分别加入100μL PBS以及稀释后的菌液作为阳性对照。将96孔板用封口膜封口后装入自封袋置于37℃，150rpm，18小时过夜培养。用酶标仪分别测B2-D9孔的OD600值，最小的OD600值所对应的最小浓度便为该抗菌肽对应细菌的MIC值。

表1示出了本发明的抗菌七肽1-5与公开号为CN113292636A的专利说明书中的部分抗菌六肽的最低抑菌浓度(MIC，μg/mL)对比。

表1

抗菌七肽	RIWRWFF-NH<sub>2</sub>	RIWRWFW-NH<sub>2</sub>	RIWRWLF-NH<sub>2</sub>	RWWRFFF-NH<sub>2</sub>	RWWRWFF-NH<sub>2</sub>
						S.aureus	8	16	4	8	8
抗菌六肽	RWWRWF-NH<sub>2</sub>	RWWRFF-NH<sub>2</sub>
						S.aureus	8	32

表1中的MIC越小，代表抑菌能力越强。表1显示本发明的五种抗菌肽对革兰氏阳性菌表现出良好的抑菌能力，具有强效性。其中抗菌七肽3(RIWRWLF-NH₂)表现出比抗菌六肽至少一倍的抗菌活性。而其他抗菌七肽也表现出不弱于抗菌六肽的抗菌活性。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 抗菌七肽及其应用

<140> 2021114588748

<141> 2021-12-02

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ile Trp Arg Trp Phe Phe

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Ile Trp Arg Trp Phe Trp

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Ile Trp Arg Trp Leu Phe

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Trp Trp Arg Phe Phe Phe

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Trp Trp Arg Trp Phe Phe

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Trp Trp Arg Trp Phe

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Trp Trp Arg Phe Phe

1 5

Claims

1.抗菌七肽，其特征在于，所述抗菌七肽的氨基酸序列为下述之一：

抗菌肽1：R-I-W-R-W-F-F-NH₂，

抗菌肽2：R-I-W-R-W-F-W-NH₂，

抗菌肽3：R-I-W-R-W-L-F-NH₂，

抗菌肽4：R-W-W-R-F-F-F-NH₂，

抗菌肽5：R-W-W-R-W-F-F-NH₂。

2.根据权利要求1所述的抗菌七肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

6.一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的抗菌七肽中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。