CN111153966B - 一种胡蜂毒肽反序类似物wvf-ⅱ及其制备方法和应用 - Google Patents

一种胡蜂毒肽反序类似物wvf-ⅱ及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胡蜂毒肽反序类似物WVF‑Ⅱ及其制备方法和应用，属于多肽合成技术领域，所述胡蜂毒肽反序类似物WVF‑Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF‑Ⅱ经体外抗菌活性测定表明，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，并且有着较佳的稳定性，溶血毒性低，具有广谱、高效和安全的特点。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF‑Ⅱ可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。

Description

一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽可以抵御微生物入侵，对革兰氏阴性菌、阳性菌、真菌、病毒、肿瘤和真核生物等有专一或非专一作用。除了具有抗微生物作用，抗菌肽还有其他功能。抗菌肽多以多肽类似物或者多肽衍生物形式应用，这些物质可以通过对天然抗菌肽氨基酸的改造得到。虽然目前已发现大量的天然抗菌肽有望取代传统抗生素的滥用所带来的耐药性的问题，但目前天然抗菌肽还存在着许多缺点，限制了其作为临床药物的应用，特别是在毒性以及酶解稳定性的方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ及其制备方法和应用，该胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ具有较好的抑菌活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ，所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了上述方案所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的制备方法，包括以下步骤：
1)按照所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列在树脂上顺次偶联氨基酸，得到肽树脂；
2)对步骤1)所述肽树脂进行裂解，加入侧链保护基清除剂，沉淀目的多肽，离心，收集沉淀得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ。
优选的，步骤1)中所述树脂包括4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂。
优选的，步骤1)中偶联氨基酸所用的偶联试剂选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、六氟磷酸苯并***-1-氧基三(二甲氨基)磷、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷和1-羟基苯并***中的一种或几种。
优选的，步骤2)中裂解所用的裂解液包括三氟乙酸和/或氢氟酸。
优选的，步骤2)中所述肽树脂的质量和裂解液的体积的比例为1g:5～50mL。
优选的，步骤2)中所述侧链保护基清除剂选自茴香硫醚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇和间甲酚中任意两种或者两种以上的组合。
优选的，步骤2)中所述沉淀目的多肽的试剂包括冰无水***。
优选的，在步骤2)得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ后，还包括对胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ进行纯化。
本发明还提供了上述方案所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ在广谱抑菌中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ，所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的N端带有正电荷，能够与带负电的细胞膜结合，C端的疏水性氨基酸形成α螺旋结构，能够在细胞膜表面穿孔，从而导致细菌死亡。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ经体外抗菌活性测定表明，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，并且有着较佳的稳定性，溶血毒性低，具有广谱、高效和安全的特点。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌三种菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration，MIC)分别为0.5μg·mL-1、1μg·mL-1和0.5μg·mL-1，在抑菌浓度范围内未表现出溶血活性。本发明的胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ具有独特的结构序列、作用机理，更完美的抗菌活性、稳定性和降低溶血活性。
附图说明
图1是胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ对金黄色葡萄球菌(左)、白色念珠菌(中)和大肠杆菌(右)的抗菌实验结果，图中：1表示青霉素钠的抗菌活性；2为阴性对照dd H2O；3为1mg·mL-1的反序肽的抗菌活性。
具体实施方式
本发明提供了一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ，所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：NH2-LLGSILKGIRKKR-COOH。
胡蜂毒肽反向序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：NH2-LLGSGLKGIRKKR-COOH。本发明将上述所述胡蜂毒肽反向序列的第五位G替换为I，即将亲水的极性中性的甘氨酸G替换为一个疏水性氨基酸(异亮氨酸I)从而进一步增加了抗菌肽的细胞选择性、提高了抗菌活性，与此同时，减弱了红细胞的溶血活性。该反序肽分子N端带有正电荷，能够与带负电的细胞膜结合，C端的疏水性氨基酸形成α螺旋结构，能够在细胞膜表面穿孔，从而导致细菌死亡。
本发明还提供了上述方案所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的制备方法，包括以下步骤：
1)按照所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列在树脂上顺次偶联氨基酸，得到肽树脂；
2)对步骤1)所述肽树脂进行裂解，加入侧链保护基清除剂，沉淀目的多肽，离心，收集沉淀得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ。
本发明在按照所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列在树脂上顺次偶联氨基酸之前，优选的还包括洗涤树脂、浸泡树脂、脱除氨基保护基和再次洗涤树脂的过程；所述树脂优选的包括Rink Amide MBHA树脂(4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂)；所述树脂的作用是作为载体。
本发明中，所述洗涤树脂采用的试剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)；所述洗涤的次数优选为5～7次，更优选为6次；所述浸泡树脂采用的溶剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)；所述浸泡过程中树脂的质量和溶剂的体积比优选为0.5g:10mL；所述浸泡的时间优选为20～40min，更优选为30min；所述浸泡过程中优选的还包括通入氮气，使树脂能在溶液中上下翻动；所述脱除氨基保护基的试剂优选为哌啶(PIP)溶液；所述哌啶(PIP)溶液的浓度优选为10％～30％，更优选为20％～25％；所述脱除的时间优选为5～30min，更优选为10～20min；所述哌啶(PIP)溶液的用量优选为2～3倍树脂体积；所述再次洗涤树脂采用的试剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)；所述洗涤的次数优选为2～10次，更优选为6～8次。本发明具体实施过程中，在再次洗涤树脂后，本发明还重复一次脱除氨基保护基和再次洗涤树脂的过程。
经上述处理，本发明按照所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列在树脂上顺次偶联氨基酸，得到肽树脂；偶联氨基酸所用的偶联试剂优选的选自二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并***-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和1-羟基苯并***(HOBt)中的一种或几种，更优选为DIC和HOBt、TBTU和HOBt或HBTU和HOBt的组合，最优选为HBTU和HOBt；顺次偶联氨基酸时，以采用的树脂为0.5g计，每次依序加入相应的氨基酸的用量优选为0.45mmol，所述偶联剂的用量优选为0.45mmol；所述偶联的温度优选为16～30℃，更优选为20～25℃；所述偶联过程中，多肽氨基酸序列从C端向N端逐个偶联；本发明对所述偶联的时间没有特殊限制，所述偶联过程中以茚三酮反应监测多肽的缩合反应确保偶联成功。
得到肽树脂后，本发明优选的还包括对肽树脂脱除氨基保护基和采用DCM、DMF、DCM依次清洗肽树脂；所述脱除氨基保护基的试剂优选为哌啶(PIP)溶液；所述哌啶(PIP)溶液的体积浓度优选为10％～30％，更优选为20％～25％；所述脱除氨基保护基的系数优选为2次，第一次脱除氨基保护基的时间优选为10min，第二次脱除氨基保护基的时间优选为20min。
肽树脂经过清洗后，本发明对清洗后的肽树脂进行裂解，加入侧链保护基清除剂，沉淀目的多肽，离心，收集沉淀得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ；本发明裂解所用的裂解液包括三氟乙酸和/或氢氟酸；所述肽树脂的质量和裂解液的体积的比例优选为1g:5～50mL，更优选为1g:10～20mL；所述裂解过程中通入氮气；所述裂解的时间优选为3～5h，更优选为4h；所述侧链保护基清除剂优选的选自茴香硫醚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇和间甲酚中任意两种或者两种以上的组合，更优选为苯酚、水、苯甲硫醚和1，2-二巯基乙醇；所述苯酚、水、苯甲硫醚和1，2-二巯基乙醇的体积比优选为0.5～2:0.5～3:0.5～1:0.25～1，更优选为1～1.5:1.5～2:0.8:0.55～0.75；所述沉淀目的多肽的试剂优选的包括冰无水***；所述离心的转速优选为3000rpm；所述离心的时间优选为5min。
在得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ后，本发明优选的还包括对胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ进行纯化；所述纯化的方法优选为反相色谱法或离子交换色谱法。
本发明还提供了上述方案所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ在广谱抑菌中的应用；所述应用包括制备抗感染药品、化妆品和饲料；所述广谱抑菌的对象包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌；所述革兰氏阳性菌优选为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌优选为大肠杆菌；所述真菌优选为白色念珠菌。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ多肽的固相化学合成
采用Fmoc(芴甲氧羰酰基)保护的氨基酸进行固相合成，以RinkAmide MBHA树脂(4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂)作载体，1-羟基苯并***和O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐作偶联试剂，肽从树脂上的切割使用裂解液三氟乙酸和侧链保护基清除剂(苯酚/水/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙醇)，于室温反应4～6h，旋转蒸发除去大部分三氟乙酸后，在0℃滴加***得絮状沉淀，离心后得粗肽，用Sephadex G-15柱初步分离，柱用5％醋酸平衡，上样后在流速为1mL·min-1下用5％醋酸洗脱，280nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥。用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰。多肽的纯度通过分析型高效液相色谱和氨基酸分析确定。胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的制备方法的具体操作步骤如下：
1)取料，将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；
2)精确称量RinkAmide MBHA树脂0.5g后，置于合成反应器中，用二甲基甲酰胺冲洗六次，然后加入10mL二甲基甲酰胺浸泡30min，通入氮气使树脂能在溶液中上下翻动；
3)加入2倍体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10min，然后用二甲基甲酰胺冲洗两次；
4)再次加入2倍体积的20％哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20min，然后用DMF冲洗六次；
5)称量0.45mmol的Fmoc保护的氨基酸、等摩尔的偶联剂1-羟基苯并***和O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐进行室温反应，以茚三酮反应监测确保偶联成功，用DMF洗涤树脂7次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成；
6)加入2倍体积的20％哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10min和20min，分别用DCM、DMF、DCM依次清洗树脂(resin)，尽量抽干，即得NH2-KHRPXGFSAPVFLRPPD-resin(肽树脂)，其中X为羟脯氨酸Hrp；
7)将5mL三氟乙酸裂解液和侧链保护基清除剂(苯酚/水/苯甲硫醚/1，2-二巯基乙醇：15:1.5:1:0.8:0.55)加入到合成反应器中，通入氮气反应3h，另将无水***置于-20℃冰箱中冷冻备用；
8)反应完成后，将反应液收集到预先称重的50mL离心管中，再用三氟乙酸清洗合成反应器2次，洗液同样收集到50mL离心管中；
9)将冰箱中的冰无水***取出，选择合适的容器将***倒入其中，按无水***：反应液＝10:1(体积比)的比例将裂解液滴入冰冻的无水***中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
10)将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上，然后用新鲜的冰冻无水***洗涤沉淀至少三次；
11)将所得沉淀物用冻干机冷冻真空干燥，得到粗肽并称重；
12)将粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，并得到WVF-Ⅱ；
13)将纯化并经质谱分析鉴定合格的WVF-Ⅱ反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
实施例2WVF-Ⅱ的反向高效液相色谱纯化及质谱鉴定
在高效液相色谱仪进行纯化，使用Sepax Bio-C18反相柱(10.0×250mm，10μm，
Figure BDA0002362655380000071
)。将氧化后的粗肽样品溶于1mL的超纯水中，10000rpm离心5min，W2998检测器检测，检测波长为215、254、280nm。流动相为四相洗脱***，流速为3mL·min-1。洗脱液分别为0.1％TFA的水溶液(A)和0.1％TFA乙腈溶液(B)，柱温为25℃，反相高效液相色谱洗脱梯度见表1，收集洗脱峰，用Q-TOF质谱分析，鉴定结果见表1，质谱分析的突变体的分子量与理论值相符合，说明成功合成了WVF-Ⅱ。将纯化的样品冻干后储存备用。粗肽的纯度通过高效液相色谱和氨基酸分析确定。
表1反相高效液相色谱洗脱梯度
Figure BDA0002362655380000072
表2WVF-Ⅱ单一成分的相对分子质量
Figure BDA0002362655380000081
实施例3胡蜂毒肽的反序类似物WVF-Ⅱ的抗菌活性检测
(1)WVF-Ⅱ的抗菌活性测定
琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50℃，用无菌操作法吸取60μL的菌悬液，加入20mL琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9cm的无菌平面皿内，厚度约为1.5mm，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2.7mm的圆孔，分别在孔中加入已纯化的胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ样品各10μL，用无菌水做阴性对照，用青霉素钠做阳性对照。加样后将平皿放入4℃冰箱中，待样品充分扩散到琼脂后，将平皿倒置于37℃培养过夜，观察结果如图1所示。(图1是胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ对金黄色葡萄球菌(左)、白色念珠菌(中)和大肠杆菌(右)的抗菌实验结果，图中：1表示青霉素钠的抗菌活性；2为阴性对照dd H2O；3为1mg·mL-1的胡蜂毒肽反序类似物的抗菌活性。由图1可以看出WVF-Ⅱ样品(3号抑菌圈)有着较好的抑菌效果。
(2)WVF-Ⅱ的最小抑菌浓度(MIC)的测定
MIC：将测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为约5×106CFU·mL-1，加入96孔板培养板中，测试孔每孔加入菌液90μL，然后加入倍比稀释的不同浓度的反序肽溶液，10μL/孔。阳性对照为100μL/孔的菌液，阴性对照为相应的100μL培养基。然后于37℃慢摇培养约16h，用酶标仪测OD630。抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果见表3。
表3WVF-Ⅱ的反序类似物的MIC
Figure BDA0002362655380000082
Figure BDA0002362655380000091
(3)溶血活性实验
将人血红细胞用PBS缓冲液(35mM磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl，pH＝7.4)洗4次后悬浮在PBS缓冲液中，得血红细胞悬浮液(体积分数2.5％)。将反序肽溶解在PBS缓冲液中，配成储备液，取不同体积的多肽储备液于0.5mL 2.5％血红细胞悬浮液中，补加PBS缓冲液至终体积1mL，摇匀，于414nm然后再37℃恒温培养箱孵育1h，然后用1200rpm，离心15min，取上清在414nm下比色，以血红细胞悬浮在PBS缓冲液中为空白，以血红细胞悬浮在TritonX100中为100％溶血。经试验检测，制备的反序肽无明显溶血活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 大理大学
<120> 一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Leu Gly Ser Ile Leu Lys Gly Ile Arg Lys Lys Arg
1               5                   10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Leu Gly Ser Gly Leu Lys Gly Ile Arg Lys Lys Arg
1               5                   10

Claims (10)

1.一种胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ，所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的制备方法，包括以下步骤：
1)按照所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ的氨基酸序列在树脂上顺次偶联氨基酸，得到肽树脂；
2)对步骤1)所述肽树脂进行裂解，加入侧链保护基清除剂，沉淀目的多肽，离心，收集沉淀得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述树脂包括4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中偶联氨基酸所用的偶联试剂选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺、2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、O-苯并***-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐、六氟磷酸苯并***-1-氧基三(二甲氨基)磷、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷和1-羟基苯并***中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中裂解所用的裂解液包括三氟乙酸和/或氢氟酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述肽树脂的质量和裂解液的体积的比例为1g:5～50mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述侧链保护基清除剂选自茴香硫醚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇和间甲酚中任意两种或者两种以上的组合。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述沉淀目的多肽的试剂包括冰无水***。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)得到胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ后，还包括对胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ进行纯化。
10.权利要求1所述胡蜂毒肽反序类似物WVF-Ⅱ在制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的药物中的应用。
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