CN117924417A - 抗鲍曼不动杆菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了三种抗鲍曼不动杆菌肽及其应用,这三种抗鲍曼不动杆菌肽的氨基酸序列分别为:R‑R‑W‑W‑R‑I‑W‑NH2,R‑W‑W‑R‑W‑I‑NH2,R‑R‑W‑I‑R‑W‑I‑T‑NH2。这三种抗鲍曼不动杆菌肽对鲍曼不动杆菌具有强力的杀菌性能,并保证较小的细胞毒性以及溶血性,且实际成本低,可用于制备治疗和/或预防鲍曼不动杆菌等细菌感染的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及三种抗鲍曼不动杆菌肽及其应用。
背景技术
多重耐药鲍曼不动杆菌是院内感染的头号杀手,被称为“重症监护室的噩梦”。因其易产生耐药性、耐化学消毒剂、耐湿热、耐低温、耐干燥、对紫外线具有较强抵抗力,在干燥表面可长时间存活等特性,被世界卫生组织(WHO)列为“CRITICAL”细菌第一位。多粘菌素是用于临床治疗鲍曼不动杆菌的经典药物,但是越来越多的研究发现,鲍曼不动杆菌对多粘菌素逐渐发展出耐药性,因此亟需开发新型抗菌药物,应对鲍曼不动杆菌感染问题。
抗菌肽是一种具有抗菌活性的多肽类物质,对细菌具有极强的杀灭作用。携带正电荷的抗菌肽可以吸附在带负电荷的细菌表面,并在其表面发生自组织,从而裂解细菌细胞膜,大量的研究已经证明,这种杀菌机制不易产生耐药性。因此,抗菌肽也被认为是应对细菌耐药性问题的下一代抗生素理想备选药物。发明人此前已研究发现多种抗菌肽,如抗菌九肽、抗菌八肽、抗菌七肽、抗菌六肽等,具体可参见CN202210794110.4、CN202210794146.2、CN202111458874.8、CN202110696847.8等专利技术。
然而,由于鲍曼不动杆菌难以杀灭,针对该种细菌的抗菌肽发展也极为困难。
发明内容
第一方面,本发明提供了三种抗鲍曼不动杆菌肽,针对鲍曼不动杆菌具有强力的杀菌性能,并保证较小的细胞毒性以及溶血性,且实际成本低。
抗鲍曼不动杆菌肽,所述抗鲍曼不动杆菌肽的氨基酸序列为下述之一:
抗菌肽1:R-R-W-W-R-I-W-NH2(SEQ ID NO:1),
抗菌肽2:R-W-W-R-W-I-NH2(SEQ ID NO:2),
抗菌肽3:R-R-W-I-R-W-I-T-NH2(SEQ ID NO:3)。
上述三种抗鲍曼不动杆菌肽因其独特的氨基酸序列,可表现出对鲍曼不动杆菌显著的杀菌活性,并且在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性,能够应用于治疗因鲍曼不动杆菌等细菌引起的疾病的药物中。
第二方面,本发明提供了第一方面所述的抗鲍曼不动杆菌肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。
进一步的,所述的应用,所述细菌为革兰氏阴性菌。
更进一步的,所述的应用,所述细菌为鲍曼不动杆菌。
第三方面,本发明提供了一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物,所述药物含有第一方面所述的抗鲍曼不动杆菌肽中的至少一种。
进一步的,所述的适用于治疗和/或预防细菌感染的药物,所述细菌为革兰氏阴性菌。
更进一步的,所述的适用于治疗和/或预防细菌感染的药物,所述细菌为鲍曼不动杆菌。
所述的适用于治疗和/或预防细菌感染的药物还可包括药学上可接受的载体。
本发明提供的三种抗鲍曼不动杆菌肽具有对鲍曼不动杆菌等细菌的抗/杀菌普适性,其主要作用机理为破坏鲍曼不动杆菌等细菌细胞膜表面。这三种抗鲍曼不动杆菌肽的净电荷为正,可以吸附到表面带负电的鲍曼不动杆菌等细菌细胞膜。而当吸附在细胞膜表面的抗鲍曼不动杆菌肽达到一定浓度时,两亲性的多肽就会***细胞膜的磷脂层并在其中自组装产生孔洞破坏细菌细胞膜,从而杀死鲍曼不动杆菌等细菌。
本发明与现有技术相比,有益效果有:
1)本发明通过大量研究,意外发现了上述三种特定序列的三种抗鲍曼不动杆菌肽对鲍曼不动杆菌等细菌具有强效的抗/杀菌活性,且细胞毒性以及溶血毒性弱,能够应用于治疗或者预防因鲍曼不动杆菌等细菌引起的疾病的药物中。
2)本发明的三种抗鲍曼不动杆菌肽可人工合成(可采用现有常规技术,如采用固相法合成等),操作方便,肽链短,不论是制备成本还是原料成本、应用成本,都非常低,具有非常好的应用前景。
附图说明
图1为抗菌肽1的高效液相色谱(HPLC)(a)与质谱(b)结果图。
图2为抗菌肽2的HPLC(a)与质谱(b)结果图。
图3为抗菌肽3的HPLC(a)与质谱(b)结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的操作方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
抗菌肽1~抗菌肽3的固相合成:
一、树脂溶涨
称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂,将树脂放入反应管中,加二氯甲烷(DCM)(15mL/g),振荡30分钟。
二、接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂,加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸,再加入10倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIEA),最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解,振荡1小时。用DMF和DCM交替清洗6遍。
三、脱保护
加15mL 20%哌啶DMF溶液(15mL/g),5分钟,去掉再加15mL 20%哌啶DMF溶液(15mL/g),15分钟。
四、检测
抽掉哌啶溶液,取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入茚三酮,KCN,苯酚溶液各一滴,105~110℃加热5分钟,变深蓝色为阳性反应。
五、洗
DMF(10mL/g)两次,甲醇(10mL/g)两次,DMF(10mL/g)两次。
六、缩合
保护氨基酸(Fmoc-L-Gly-OH)三倍过量,O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)三倍过量,均用尽量少DMF溶解,加入反应管,立刻加入N-甲基***啉(NMM)十倍过量。反应30分钟。
七、洗
DMF(10mL/g)一次,甲醇(10mL/g)两次,DMF(10mL/g)两次。
八、重复二至六步操作,从右到左依次连接序列中的氨基酸。
九、最后一个氨基酸连接后,脱保护,按照下列方法洗树脂。
DMF(10mL/g)两次,甲醇(10mL/g)两次,DMF(10mL/g)两次,DCM(10mL/g)两次,抽干10分钟。
十、从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g)TFA 94.5%;水2.5%;EDT 2.5%;TIS1%。
将树脂装入烧瓶或者离心管中,树脂和切割液比例按照10mL/g,恒温震荡,时间:120分钟。
十一、吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干,用***层析出来,再用***洗六次,然后常温挥干。即得粗品肽序。
十二、用HPLC纯化多肽
具体操作步骤:
1,取粗品肽200mg放入器皿中。用2-5mL 50%的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2分钟。
2,用0.45μm滤膜过滤溶解液。
3,分析:取3μL用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈,时间30分钟,梯度洗脱,先将HPLC用起始梯度平衡5分钟然后进样,起始梯度水95%,乙腈5%,结束比例水5%,乙腈95%
4,制备:将溶解好的样品,做进样准备。制备HPLC平衡10分钟,起始梯度水95%,乙腈5%,结束梯度水25%,乙腈75%梯度时间40分钟。收集从检测器出来的样品。
5,鉴定:将收集下来的样品,取样进行纯度和MS的鉴定。
十三、最后将纯化后的溶液冻干,既得到成品。
十四、将白色粉末状的多肽,密封包装,-20℃保存。
图1~图3分别依次为抗菌肽1~3的HPLC(a)与质谱(b)结果图。
实施例2
抗菌肽的抑菌活性检测。
以下的所使用的标准菌株均购于广东省微生物菌种保存中心。
采用96孔板法对实施例1合成的抗菌肽的抑菌活性进行检测,并用经FDA批准的抗菌肽多黏菌素作为革兰氏阴性菌对照,以评价抗菌肽1-3的抑菌活性。
按以下步骤测试抗菌肽的抑菌活性。
一、将鲍曼不动杆菌(A.baumannii)在灭菌的MH培养基平板上培养过夜,挑取单菌落接种于灭菌的MH培养基中37℃,150rpm,18小时过夜培养。
二、将抗菌肽1-3分别用PBS配成1024μg/mL,并按照2倍连续稀释的方式用PBS稀释成1024,512,256,128,64,32,16,8μg/mL并吸取100μL加入96孔板的2-9列孔位并重复6组加入B-G行。将培养后的细菌用MH稀释成5×10^5CFU/mL,并在B2-D9孔中加入100μL稀释后的菌液作为实验组。此时,待测的肽的浓度(μg/mL)如下:
列数 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
浓度 | 512 | 256 | 128 | 64 | 32 | 16 | 8 | 4 |
在E2-G9孔中加入100μL MH溶液作为对照组,并在B10-D10孔中分别加入100μLPBS以及MH作为阴性对照,在E10-G10孔中分别加入100μL PBS以及稀释后的菌液作为阳性对照。将96孔板用封口膜封口后装入自封袋置于37℃,150rpm,12小时过夜培养。用酶标仪分别测B2-D9孔的OD600值,最小的OD600值所对应的最小浓度便为该抗菌肽对应细菌的MIC值。
表1示出了抗菌肽1-3、多黏菌素对鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC,μg/mL,0-32:+,32-512:++)
表1
抗菌肽1 | 抗菌肽2 | 抗菌肽3 | 多粘菌素 | |
A.baumannii | + | + | + | + |
表1中的MIC越小,代表抑菌能力越强。表1显示本发明的三种抗菌肽对鲍曼不动杆菌表现出良好的抑菌能力。
实施例3
抗菌肽1-3的细胞毒性检测。
本实施例用于检测实施例1合成的三种抗鲍曼不动杆菌肽对人体3T3细胞的细胞毒性,并用经FDA批准的短杆菌肽作为对比。
细胞毒性检测步骤:
一、将NIH-3T3细胞以5000/孔的密度接枝于96孔板中培养24小时使其充分贴壁。
二、配制100μg/mL抗菌肽1-3PBS溶液,并用DMEM培养基稀释为50μg/mL。除去96孔板中的培养基后,加入200μL 50μg/mL的含药培养基后继续培养24小时,每个组5个平行样。
三、吸除药物培养基后用PBS清洗3次,并在每孔中加入20μL CCK-8及100μL DMEM培养基,孵育2小时。吸除上清液,使用酶标仪读取OD 490nm吸收值。
细胞毒性计算公式为:
细胞存活率=样品池吸收值/空白池吸收值×100%。
表2示出了抗菌肽1-3细胞毒性检测结果(药物浓度50μg/mL),并以短杆菌肽、PBS作为对照,其中细胞存活率80-100%:+,<80%:++。
表2
抗菌肽1 | 抗菌肽2 | 抗菌肽3 | 短杆菌肽 | 多粘菌素 | PBS | |
细胞存活率 | + | + | + | ++ | + | + |
表2中,细胞存活率越大代表抗菌肽的细胞毒性越小。表2表明,抗菌肽1-3相比于短杆菌肽均表现出了明显更小的细胞毒性,为成药提供了强力的支撑。
实施例4
抗菌肽1-3的体外溶血性检测。
本实施例用于检测实施例1合成的三种抗菌肽对红细胞的溶血性,并用经FDA批准的短杆菌肽作为对比。使用的血样取于无菌小鼠血。
溶血性检测的步骤是:
一、取1mL全血,用1500rpm离心5分钟吸去上清液重复3次,加入20mL PBS配成血细胞溶液。
二、将抗菌肽1-3配成100μg/mL,并取100μL加入96孔板作为实验组,取Triton-X100(1wt%)100μL,PBS100μL加入96孔板分别作为阳性对照以及阴性对照,每个样品重复5组。向加入样品的孔板中分别加入100μL血细胞溶液(此时所有样品的浓度减半,所有实验组的浓度为50μg/mL),孔板封口后装入自封袋,并在37℃下150rpm孵育1小时。
三、孵育完毕后,吸取混合溶液于1.5mL离心管,并在1500rpm离心8分钟后吸取上清液用酶标仪测试OD 570nm值。
溶血率=(Am-An)/(Ap-An)
其中,Am为实验组OD值,Ap为阳性对照OD值,An为阴性对照OD值。
表3示出了抗菌肽1-3溶血性检测结果(药物浓度100μg/mL),并以短杆菌肽、Triton-X100为对照,其中溶血率0-30%:+,>30%:++。
表3
抗菌肽1 | 抗菌肽2 | 抗菌肽3 | 短杆菌肽 | Triton-X100 | PBS | |
溶血率 | + | + | + | ++ | ++ | + |
溶血率越大代表抗菌肽对血细胞的毒性越大。表3表明,抗菌肽1-3相比于短杆菌肽均表现出了明显更小的溶血性,为成药提供了强力的支撑。
此外应理解,在阅读了本发明的上述描述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.抗鲍曼不动杆菌肽,其特征在于,所述抗鲍曼不动杆菌肽的氨基酸序列为下述之一:
抗菌肽1:R-R-W-W-R-I-W-NH2,
抗菌肽2:R-W-W-R-W-I-NH2,
抗菌肽3:R-R-W-I-R-W-I-T-NH2。
2.根据权利要求1所述的抗鲍曼不动杆菌肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述细菌为革兰氏阴性菌。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述细菌为鲍曼不动杆菌。
5.一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物,其特征在于,所述药物含有权利要求1所述的抗鲍曼不动杆菌肽中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的药物,其特征在于,所述细菌为革兰氏阴性菌。
7.根据权利要求5所述的药物,其特征在于,所述细菌为鲍曼不动杆菌。
8.根据权利要求5所述的药物,其特征在于,所述药物还包括药学上可接受的载体。
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