CN118165078A - 一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽ndyt-8及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT‑8及其应用。本发明通过枯草芽孢杆菌发酵代谢产物质谱鉴定、基因组数据挖掘、数据库预测及合成验证最终得到枯草芽孢杆菌源抗菌肽抗菌肽NDYT‑8，其氨基酸序列为PRKILLMVKA，分子量为1168.551道尔顿，可以形成双亲性α螺旋结构；本发明提供的抗菌肽NDYT‑8对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种食源性致病菌具有明显的抑制作用，可以靶向破坏细菌细胞膜，同时溶血作用较低；本发明提供的抗菌肽NDYT‑8氨基酸均为L构型，合成成本较低，因此有望替代抗生素及化学防腐剂，在生物医药、食品和农产品防腐保鲜等领域有重大挖掘潜力和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8及其应用。
背景技术
食源性致病菌是指以食物为载体导致人体患病的一类微生物，典型的食源性致病菌包括沙门氏菌、致泻性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌等，食源性致病菌的防控是保障食品安全的刚性需求。目前，防控食源性致病菌常用的方法是添加化学防腐剂，然而，越来越多的研究表明使用化学防腐剂存在极大的安全隐患，开发绿色、安全、高效的天然防腐剂越来越迫切，在食品行业中研究最为深入的天然防腐剂是乳酸链球菌素(Nisin)，Nisin已被美国食品药品监管局批准用作食品添加剂，也是我国批准使用的天然食品防腐剂之一，但Nisin仅能抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性；Nisin的抗菌活性也不稳定，只适用于酸性环境；这些均大大限制了Nisin在食品工业中的应用。因此，开发广谱天然防腐剂，增进其抑菌稳定性和适用范围是当今亟待解决的问题。
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有较强阳离子特征的小分子多肽，也被称为阳离子宿主防御肽，广泛存在于细菌、动物、植物体内，序列仅由几个到几十个氨基酸组成，作为新兴崛起的一类天然生物防腐剂，抗菌肽具有独特的膜破坏机制：大多数抗菌肽都同时具有阳离子及疏水氨基酸残基，从而使其在极性生物体环境下具有两亲性，进而可以与细菌细胞膜上的负电荷通过静电作用快速的裂解细菌，也正因为它独特的作用机制，受到细菌耐药性影响概率极小。并且，与细菌带负电细胞膜不同，哺乳动物的正常细胞表面主要由带中性电荷的磷脂组成，所以抗菌肽只会选择性杀伤细菌而不会损害正常细胞。因此抗菌肽因其广谱抑菌性、强生物相容性等特点而被认为是具有极大挖掘潜力的天然防腐剂。
纳豆芽孢杆菌是从纳豆中分离出来的菌种，学科名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis natto)，被FDA认证为一般认为安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)类微生物。研究表明部分纳豆芽孢杆菌菌株具有良好的产抗菌肽类物质的能力，有望成为替代防腐剂/抗生素的安全绿色产品，极具开发前景。
发明内容
为了克服现有技术的不足之处，提供一种全新抗菌肽，本发明的首要目的在于提供一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8。
本发明的第二目的在于提供一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的应用。
本发明的首要目的通过如下技术方案可以实现：
一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8，其氨基酸序列如下：Pro-Arg-Lys-Ile-Leu-Leu-Met-Val-Lys-Ala，氨基酸序列的单字母缩写序列为PRKILLMVKA；
所述抗菌肽NDYT-8的分子量为1168.551Da，疏水率60％，所带正电荷+3，分子式C54H101N15O11S1，平均亲水性0.61，等电点11.63，通过APD3预测该抗菌肽NDYT-8可形成α螺旋。
优选地，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8包含用于编码抗菌肽NDYT-8的核酸片段。
优选地，所述用于编码抗菌肽NDYT-8的核酸序列片段如下：
ATTGAAGAATTTGTCCAATCCTTGGAAACA
CCGCGCAAAATCTTATTAATGGTTAAAGCG
GGAACTGCAACAGATGCGACAATTCAATCT
CTTCTTCCTCATCTAGAGAAGGATGATATT(SEQ ID NO:2)。
优选地，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的制备方法，包括如下步骤：
采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过三氟乙酸切割后，得到抗菌肽NDYT-8；经过反相高效液相色谱纯化后，即完成枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的制备。
优选地，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的制备方法，具体步骤如下：
(1)、称取2-氯三苯甲基氯树脂(2-CTC resin)，于反应器中用二氯甲烷溶胀半小时，抽干，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)清洗3次；
(2)、取1eq的Fmoc-Ala-OH(N-芴甲氧羰基-丙氨酸)，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)做溶剂，1.5eq的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)催化反应到树脂上，抽掉反应液，DMF清洗6次；
(3)、甲醇+DIEA将树脂封头1h，DMF清洗6次；
(4)、20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc(氨基酸保护基团)，DMF清洗8次；
(5)、3eq的Fmoc-Lys(Boc)-OH(叔丁氧羰基-芴甲氧羰基-赖氨酸)，DMF做溶剂，3eqDIC+HoBT(N,N'-二异丙基碳二亚胺+1-羟基苯并三氮唑)与树脂反应，抽干，清洗；
(6)、20％哌啶的DMF溶液脱除氨基酸保护基团，清洗；
(7)、按照氨基酸顺序，重复步骤5-6，直到接完N端的Pro，并脱除N端的Fmoc；
(8)、将反应结束的树脂清洗后，抽干；
(9)、95％TFA+2％Tis(三异丙基氯硅烷)+2％EDT(1,2-乙二硫醇)+1％H2O切割裂解树脂，***沉降洗涤，得到粗品；
(10)、高效液相色谱纯化分离粗品，得到纯品；
(11)、冻干，检测。
本发明的第二目的通过如下技术方案可以实现：
一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8在抗菌药物或食品防腐剂中的应用。
具体地，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8在抑制和/或杀灭大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌中的一种或多种抗菌药物中的应用。
具体地，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8在抑制和/或杀灭大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌中的一种或多种食品防腐剂中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明所述抗菌肽NDYT-8针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种食源性致病菌具有明显的抑制作用，且具有低溶血性、高稳定性等优势，该抗菌肽筛选自FDA认证“一般认为安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)”类微生物，安全性有保证，此外本发明提供的抗菌肽NDYT-8氨基酸均为L构型，合成成本较低，因此有望替代抗生素及化学防腐剂，在生物医药和食品、农产品防腐保鲜等领域具有重大挖掘潜力和应用价值。本发明抗菌肽NDYT-8可被制成抗菌药物或食品防腐剂用于防控大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为抗菌肽NDYT-8helical wheel图；
图2为固相合成抗菌肽NDYT-8的高效液相色谱图；
图3为固相合成抗菌肽NDYT-8的电喷雾电离质谱(ESI-MS)图；
图4为抗菌肽NDYT-8对大肠杆菌ATCC25922的抑菌效果图；
图5为抗菌肽NDYT-8对大肠杆菌ATCC25922杀菌曲线图；
图6为抗菌肽NDYT-8对小鼠红细胞的溶血作用实验结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：抗菌肽NDYT-8的筛选
结合枯草芽孢杆菌纳豆亚种ND107105的全基因组序列(CP121266.1)及其抗菌代谢产物的质谱鉴定，通过抗菌肽预测网站APD3(https://aps.unmc.edu/)和DRAMPDatabase(http://dramp.cpu-bioinfor.org/)筛选抗菌活性概率高于99％及具备α-螺旋结构且氨基酸个数在15以内的阳离子短肽，进一步通过DBAASP数据库(https://dbaasp.org/tools？page＝linear-amp-prediction)基于“聚类”方法和AI学习方法筛选对金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922抑菌活性呈阳性的肽段。通过此方法获取包括抗菌肽NDYT-8在内的数条短肽序列，化学合成纯度高于95％的该短肽。
本发明所述抗菌肽NDYT-8为源于枯草芽孢杆菌纳豆亚种的天然抗菌肽。结合代谢产物质谱鉴定和抗菌肽数据库分析预测，从枯草芽孢杆菌纳豆亚种天然基因组中筛选出了高效、广谱的新型抗菌肽NDYT-8。本发明提供的抗菌肽NDYT-8有10个氨基酸残基，其氨基酸序列具体为：Pro-Arg-Lys-Ile-Leu-Leu-Met-Val-Lys-Ala，氨基酸序列的单字母缩写序列为PRKILLMVKA，抗菌肽NDYT-8的分子量为1168.551Da，疏水率60％，总静电荷+3，分子式C54H101N15O11S1，平均亲水性0.61，等电点11.63。本发明所述抗菌肽NDYT-8针对革兰氏阳性菌致病菌和革兰氏阴性致病菌均具有显著的抑菌活性，且具有低溶血性、高稳定性且高效等优势，该抗菌肽筛选自FDA认证“一般认为安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)”类微生物，安全性有保证，有望替代抗生素及化学防腐剂，在生物医药和食品、农产品防腐保鲜等领域具有重大挖掘潜力和应用价值。
实施例2：实施例1所述抗菌肽NDYT-8的制备方法
采用固相化学合成法合成抗菌肽NDYT-8：抗菌肽NDYT-8的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成，具体步骤如下：
(1)、称取2-CTC树脂，于反应器中用DCM溶胀0.5h，抽干，DMF清洗3次；
(2)、取1eq的Fmoc-Ala-OH，DMF做溶剂，1.5eq的DIEA催化反应到树脂上，抽掉反应液，DMF清洗6次；
(3)、甲醇+DIEA将树脂封头1h，DMF清洗6次；
(4)、20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，DMF清洗8次；
(5)、3eq的Fmoc-Lys(Boc)-OH，DMF做溶剂，3eq(DIC+HoBT)与树脂反应，抽干，清洗；
(6)、20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，清洗；
(7)、按照氨基酸P-R-K-I-L-L-M-V-K-A顺序，重复步骤(5)-(6)从C端合成到N端，直到接完N端的Pro，并脱除N端的Fmoc；得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
(8)、将反应结束的树脂清洗后，抽干；
(9)、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，95％TFA(三氟乙酸)+2％Tis(三异丙基氯硅烷)+2％EDT+1％H2O切割裂解树脂，***沉降洗涤，得到多肽粗品；
(10)、用15％ACN溶液溶解多肽，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为10％～70％，洗脱时间为30min，检测波长为220nm，流速为1mL/min，收集主峰，冻干；得到纯化抗菌肽NDYT-8(如图2所示)；
(11)、抗菌肽NDYT-8的鉴定：将上述得到的抗菌肽NDYT-8经过电喷雾质谱法分析，理论分子量与实测分子量基本一致，抗菌肽NDYT-8的纯度大于95％(如图3所示)。
实施例3：抗菌肽NDYT-8抑菌活性测定
通过微量二倍稀释法对抗菌肽NDYT-8的抑菌活性进行检测。测定最小抑菌浓度，即能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。本实施例中所涉及到的菌株包括革兰氏阳性致病菌金黄色葡萄球菌ATCC 29213、单核增生李斯特菌ATCC 19115；革兰氏阴性致病菌大肠杆菌ATCC 25922、肠炎沙门氏菌ATCC 14028、副溶血性弧菌ATCC 17802；
用LB培养基将指示菌培养至指数生长期，用MH培养基稀释菌液，调整浓度为107CFU/mL，分装90μL菌液/孔至96孔板中；
使用DMSO溶解抗菌肽NDYT-8(4mg/mL)，用MH培养基梯度稀释菌肽NDYT-8至(2-1000μg/mL)，根据浓度梯度依次加入90μL至含有待测菌液的96孔培养板中，每个浓度设置三个孔重复；90μL无菌PBS+90μL MH培养基作为阴性空白对照，90μL MH培养基+90μL细菌悬液为阳性空白对照。
将96孔板置于37℃，160rpm恒温培养摇床中培养24h；
使用酶标仪检测菌液在600nm处的光吸收值，以检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度的平均值作为作为最小抑菌浓度(MIC)。
经三次重复实验验证抗菌肽NDYT-8对多种食源性致病菌的抑菌活性如下表所示，其MIC值在16～128μg/mL。抗菌肽NDYT-8对革兰氏阴性菌的抑菌活性相对较强，其MIC值小于40μg/mL。
实施例4：抗菌肽NDYT-8抑制细菌生长曲线测定
本实施例中所涉及到的菌株为革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus subsp.Aureus)ATCC 29213和革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922。
将待测细菌置于LB培养基，37℃，220rpm条件下培养12h；1:100转接于MH培养基中，37℃，220rpm继续培养2.5h，；MH培养基稀释菌液至OD600＝0.1；
取150μL MH培养基于96孔板中，每孔分别加入10μL待测菌液，依次加入终浓度为0MIC，1MIC，3MIC，5MIC的抗菌肽NDYT-8，混匀，至于酶标仪中，37℃培养，每2h测量OD600读数，测量至10h；绘制生长曲线。
结果如图5所示，三次重复实验显示随着抗菌肽NDYT-8浓度的增加，细菌生长被抑制，当抗菌肽浓度增加至3MIC(50-200μg/mL)时，大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长被显著抑制。
实施例5：抗菌肽NDYT-8对新鲜小鼠红细胞的溶血活性
取新鲜小鼠血液，于离心管中以1000rpm离心10min，然后去上清液取下层红细胞沉淀，加入PBS洗涤两次，再次以1000rpm离心10min去上清液，最后在离心管中加入生理盐水制备含有6％(v/v)红细胞的细胞悬液，分装100μL/孔至96孔板中；
用PBS缓冲液(pH 7.4)配备不同浓度梯度的抗菌肽(0μg/mL，40μg/mL，100μg/mL，200μg/mL)；其中以PBS溶液作为阴性对照组，以多粘菌素(200μg/mL)作为阳性对照。
加入100μL抗菌肽和阳性对照至含有小鼠血液的96孔板中；37℃培养60min；
取出96孔板，离心(3000×g，5min，4℃)，转移上清液100μL至新的96孔板，使用酶标仪通过测量540nm处的吸光度来评估上清液中的血红蛋白释放。
如图6所示，三次重复实验显示抗菌肽溶液与小鼠红细胞悬浮液经孵育，OD540检测结果表明，与对照组相比，抗菌肽NDYT-8在浓度达到200μg/mL时未造成红细胞发生明显溶血现象，安全性较高。
综上所述，本发明提供了一种抗菌肽NDYT-8，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为PRKILLMVKA。
本发明提供的抗菌肽NDYT-8是可以形成双亲性α螺旋结构的短序列，包含10个氨基酸，分子量为1168.551道尔顿，为直链多肽，所有氨基酸均为L型。体外抑菌实验表明，抗菌肽NDYT-8具有广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌的标准菌株均表现较好的抗菌作用，最小抑菌浓度(MIC)值为16μg/mL；同时溶血作用较低。
在本发明中，所述抗菌肽NDYT-8的制备方法为多肽固相合成法。本发明对所述多肽固相合成法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8，其特征在于，其氨基酸序列如下：
Pro-Arg-Lys-Ile-Leu-Leu-Met-Val-Lys-Ala，氨基酸序列的单字母缩写序列为PRKILLMVKA；
所述抗菌肽NDYT-8的分子量为1168.551Da，疏水率60％，所带正电荷+3，分子式C54H101N15O11S1，平均亲水性0.61，等电点11.63，通过APD3预测该肽可形成α螺旋。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8包含用于编码抗菌肽NDYT-8的核酸片段。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8，其特征在于，所述用于编码抗菌肽NDYT-8的核酸序列片段如下：
ATTGAAGAATTTGTCCAATCCTTGGAAACA
CCGCGCAAAATCTTATTAATGGTTAAAGCG
GGAACTGCAACAGATGCGACAATTCAATCT
CTTCTTCCTCATCTAGAGAAGGATGATATT(SEQ ID NO:2)。
4.根据权利要求1至3任一项所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的制备方法，包括如下步骤：
采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽NDYT-8；经过反相高效液相色谱纯化后，即完成枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的制备。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的制备方法，具体步骤如下：
(1)、称取2-CTC树脂，于反应器中用DCM溶胀半小时，抽干，DMF清洗3次；
(2)、取1eq的Fmoc-Ala-OH，DMF做溶剂，1.5eq的DIEA催化反应到树脂上，抽掉反应液，DMF清洗6次；
(3)、甲醇+DIEA将树脂封头1h，DMF清洗6次；
(4)、20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，DMF清洗8次；
(5)、3eq的Fmoc-Lys(Boc)-OH，DMF做溶剂，3eq(DIC+HoBT)与树脂反应，抽干，清洗；
(6)、20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，清洗；
(7)、按照氨基酸顺序，重复步骤5-6，直到接完N端的Pro，并脱除N端的Fmoc；
(8)、将反应结束的树脂清洗后，抽干；
(9)、95％TFA+2％Tis+2％EDT+1％H2O切割裂解树脂，***沉降洗涤，得到粗品；
(10)、高效液相色谱纯化分离粗品，得到纯品；
(11)、冻干，检测。
6.一种根据权利要求1至5任一项所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的应用。
7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8在抑制和/或杀灭大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌中的一种或多种抗菌药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌源抗菌肽NDYT-8在抑制和/或杀灭大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌中的一种或多种食品防腐剂中的应用。
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