CN117886884A - 一种抗菌多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开一种抗菌多肽及其应用。所述抗菌多肽具体为如下多肽中任一种：抗菌六肽：氨基酸序列为W‑L‑R‑F‑W‑R‑NH2；抗菌七肽：氨基酸序列为V‑R‑W‑I‑K‑F‑W‑NH2；抗菌八肽：氨基酸序列为F‑K‑I‑L‑L‑R‑W‑F‑NH2。本发明的抗菌多肽具有优异杀菌活性的抗菌多肽，该多肽在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性，能够应用于治疗因细菌引起的肺炎、败血症等疾病的药物中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗菌多肽及其应用。
背景技术
抗生素、抗菌药物的大量滥用导致了细菌的耐药性越来越强，甚至产生了大量“超级细菌”，“超级细菌”使细菌产生了耐药性。为了应对日益严重的细菌耐药问题，避免无效的抗菌药物，急需开发新型的抗菌药物分子。
抗菌肽是由特定氨基酸序列组成的多肽小分子，具有分子量小、无免疫原性、两亲性、带正电荷的特点。抗菌肽的正电性使得其更易吸附并聚集于带负电的细菌细胞膜表面，两亲性的抗菌肽可以***细菌细胞膜的磷脂双分子层并自组装形成孔洞结构杀死细菌，这种抗菌机理使得抗菌肽具有广谱抗菌性，不易产生耐药性，多肽的氨基酸序列短、结构简单、合成方便，有利于工业生产。
CN110305194 A公开了一种抗菌多肽及应用。该多肽的氨基酸序列为：Gly–Lys–Ile–Lys–Ile–Gly–Ile–Asn–Gly–Phe–Gly–Arg–Ile–Gly–Arg–Leu–Val–Ala–Arg–Val，如SEQID NO:1所示。该发明的抗牙龈卟啉单胞菌及具核酸杆菌多肽适宜制成牙龈卟啉单胞菌及具核酸杆菌感染性疾病药物、漱口水及牙膏添加剂。该多肽对牙龈卟啉单胞菌及具核酸杆菌具有较强的杀灭作用，且对人血红细胞毒性极小。
CN 115433258 A公开了一种筛选自发酵核桃粕的抗菌多肽及其应用。本发明采用复合益生菌发酵核桃粕以提高对刺梨腐败优势菌的抗菌活性，探究发酵核桃粕中具有抗菌活性的多肽的变化，并从中筛选具有抗菌活性的多肽FGGDSTHP，ALGGGY，YVVPW，PLLRW。进一步分析抗菌多肽与酚类化合物之间的互作机理，并获得最优的抗菌组合YVVPW-SA，提高二者对P.victoriae的协同抗菌活性。但上述多肽对细菌具有一定的选择性，即对特定的细菌展现出优异的抗菌特性。因此继续进行抗菌多肽的研发和探究仍具有重要意义。
发明内容
本发明针对抗菌药物导致细菌的耐药性提高，现有抗菌肽氨基酸序列太长等问题，提供一种具有优异杀菌活性的抗菌多肽，该多肽在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性，能够应用于治疗因细菌引起的肺炎、败血症等疾病的药物中。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种抗菌多肽，所述抗菌多肽具体为如下多肽中任一种：
抗菌六肽：氨基酸序列为W-L-R-F-W-R-NH2；
抗菌七肽：氨基酸序列为V-R-W-I-K-F-W-NH2；
抗菌八肽：氨基酸序列为F-K-I-L-L-R-W-F-NH2。
上述抗菌多肽的氨基酸序列显示出正电荷与细菌生物膜上磷脂分子的负电荷通过静电吸引相结合，穿透膜表面破坏膜内结构从而实现杀死细菌。并且在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性，能够应用于治疗因细菌引起的肺炎、败血症等疾病的药物中。因此本发明的抗菌多肽对细菌具有较强的杀灭作用。
本发明还提供所述的抗菌多肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物的应用。
所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。优选包括金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌等。
在本发明中，所述抗菌多肽的制备方法优选包括多肽固相合成法。本发明对所述多肽固相合成法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。
所述抗菌六肽的对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为16μg/mL。
所述抗菌七肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。
所述抗菌八肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。
与抗菌肽短杆菌肽对比，本发明的七肽、八肽能达到相同的最低抑菌浓度，六肽稍大，但也能保持较低的抑菌浓度。
所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
本发明还提供一种用于治疗和/或预防细菌感染的药物，包括权利要求1所述的抗菌多肽。
本发明还提供一种抑菌添加剂，所述抑菌添加剂包括权利要求1所述的抗菌多肽。
所述抑菌添加剂作为添加剂添加到生活用品中使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明研究的三种抗菌多肽具有强效的杀菌活性，特别对革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌表现出优异抑菌性，能达到与抗菌肽短杆菌肽同等的抑菌效果，最低抑菌浓度达到8μg/mL，且本发明的多肽序列短，细胞毒性低，采用普通的固相合成法即可，成本低，利于广泛性推广使用。
附图说明
图1为实施例1制备的抗菌多肽溶血率对照图。
图2为实施例1制备的抗菌多肽细胞毒性对照图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
以下具体实施方式中所采用的标准菌株均购于广东省微生物菌种保存中心。
实施例1抗菌多肽的合成
一、树脂溶涨
称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)(15mL/g)，振荡30分钟.
二、接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1小时。用DMF和DCM交替清洗6遍。
三、脱保护
加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，5分钟，去掉再加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，15分钟。
四、检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
五、洗
DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。
六、缩合
保护氨基酸(Fmoc-L-Gly-OH)三倍过量，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入N-甲基***啉(NMM)十倍过量。反应30分钟.
七、洗
DMF(10mL/g)一次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。
八、重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
九、最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂。
DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，抽干10分钟。
十、从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS1％。
将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10mL/g，恒温震荡，时间：120分钟。
十一、吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用***层析出来，再用***洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。
十二、用HPLC纯化多肽
具体操作步骤：
1，取粗品肽200mg放入器皿中。用2-5mL 50％的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2分钟。
2，用0.45μm滤膜过滤溶解液。
3，分析：取3μL用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30分钟，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5分钟然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％
4，制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10分钟，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40分钟。收集从检测器出来的样品。
十三、最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
十四、将白色粉末状的抗菌六肽、抗菌七肽和抗菌八肽，密封包装，-20℃保存。
性能测试
一、抗菌多肽的体外溶血性检测。
本实施例用于检测抗菌多肽对红细胞的溶血性，使用的血样取于无菌兔血，溶血性检测的步骤是：
1、取1mL全血，用1500rpm离心5分钟吸去上清液重复3次，加入20mL PBS配成血细胞溶液。
2、将抗菌多肽配成200μg/mL，并取100μL加入96孔板作为实验组，取Triton-X100(1wt％)100μL，PBS100μL加入96孔板分别作为阳性对照以及阴性对照，每个样品重复5组。向加入样品的孔板中分别加入100μL血细胞溶液，此时实验组的浓度为100μg/mL。孔板封口后装入自封袋，并在37℃下150rpm孵育1小时。
3、孵育完毕后，吸取混合溶液于1.5mL离心管，并在1500rpm离心8分钟后吸取上清液用酶标仪测试OD 570nm值。
溶血率＝(Am-An)/(Ap-An)
其中，Am为实验组OD值，Ap为阳性对照OD值，An为阴性对照OD值。
结果如图1所示，表明抗菌多肽在浓度100μg/mL时，溶血率＜5％，说明其具有极低的溶血性，安全性较高。
二、细胞毒性实验
本实施例用于检测合成的抗菌多肽对人体3T3细胞的细胞毒性。细胞毒性检测步骤：
1、将小鼠胚胎成纤维细胞以5000/孔的密度接枝于96孔板中培养24小时使其充分贴壁。
2、配制200μg/mL抗菌多肽PBS溶液，并用DMEM培养基稀释为100μg/mL。除去96孔板中的培养基后，加入200μL 100μg/mL的含药培养基后继续培养24小时。
3、吸除药物培养基后用PBS清洗3次，并在每孔中加入20μL噻唑蓝(MTT)溶液及100μL DMEM培养基，孵育4小时。吸除上清液，加入150μL DMSO充分溶解紫色甲瓒结晶。使用酶标仪读取OD 490nm吸收值，以不加多肽溶液的完全培养基为空白对照。
细胞毒性计算公式为：细胞存活率＝样品吸光度/空白组吸光度×100％。
测试结果如图2所示，可见抗菌多肽对小鼠胚胎成纤维的存活率分别为96.69％(抗菌六肽)、95.87％(抗菌七肽)、97.32％(抗菌八肽)。说明本发明多肽对小鼠胚胎成纤维细胞的存活率没有显著影响。
三、抗菌肽的抗菌活性检测
采用96孔板法对合成的抗菌多肽的抗菌活性进行检测，并用经FDA批准的抗菌肽短杆菌肽作为革兰氏阳性菌对照，以评价抗菌肽的抗菌活性。按以下步骤测试抗菌肽的抗菌活性：
1、将金黄色葡萄球菌(S.aureus)在灭菌的TSA培养基平板上培养过夜，挑取单菌落接种于灭菌的TSB培养基中37℃，150rpm，18小时过夜培养。
2、将抗菌肽分别用PBS配成1024μg/mL，并按照2倍连续稀释的方式用PBS稀释成1024，512，256，128，64，32，16，8，4μg/mL并吸取100μL加入96孔板的2-9列孔位并重复6组加入B-G行。将培养后的细菌用TSB稀释成5×10^5CFU/mL，并在B2-D9孔中加入100μL稀释后的菌液作为实验组。此时，待测的肽的浓度(μg/mL)如表1所示：
表1待测多肽浓度(μg/mL)
| 列数 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 浓度 | 512 | 256 | 128 | 64 | 32 | 16 | 8 | 4 |
在E2-G9孔中加入100μL TSB溶液作为对照组，并在B10-D10孔中分别加入100μLPBS以及TSB作为阴性对照，在E10-G10孔中分别加入100μLPBS以及稀释后的菌液作为阳性对照。将96孔板用封口膜封口后装入自封袋置于37℃，150rpm，18小时过夜培养。用酶标仪分别测B2-D9孔的OD600值，最小的OD600值所对应的最小浓度便为该抗菌肽对应细菌的MIC值，结果如表2所示。表2中的MIC越小，代表抑菌能力越强。可见本发明的抗菌多肽对革兰氏阳性菌表现出良好的抑菌能力，具有强效性。
表2抗菌多肽肽和短杆菌肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(μg/mL)
| 多肽种类 | 抗菌六肽 | 抗菌七肽 | 抗菌八肽 | 短杆菌肽 |
| S.aureus | 16 | 8 | 8 | 8 |
Claims (10)
1.一种抗菌多肽，其特征在于，所述抗菌多肽具体为如下多肽中任一种：
抗菌六肽：氨基酸序列为W-L-R-F-W-R-NH2；
抗菌七肽：氨基酸序列为V-R-W-I-K-F-W-NH2；
抗菌八肽：氨基酸序列为F-K-I-L-L-R-W-F-NH2。
2.根据权利要求1所述的抗菌多肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌六肽的对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为16μg/mL。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌七肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌八肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
8.一种用于治疗和/或预防细菌感染的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的抗菌多肽。
9.一种抑菌添加剂，其特征在于，所述抑菌添加剂包括权利要求1所述的抗菌多肽。
10.根据权利要求9所述的抑菌添加剂，其特征在于，所述抑菌添加剂作为添加剂添加到生活用品中使用。
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