CN108752433B - 抗微生物肽cramp及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗微生物肽CRAMP及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将首尾环化，获得环肽CRAMP，经研究发现抗微生物肽CRAMP及其环肽对铜绿假单胞菌成熟生物膜有明显的清除作用，本研究对成熟的铜绿假单胞菌生物膜的消除策略及其机制的深入研究有着十分重要的科学意义和医学临床价值。

Description

抗微生物肽CRAMP及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中 的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及抗微生物肽CRAMP和环肽，以及抗微生物肽CRAMP和环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用。

背景技术

细菌生物膜(biofilm，BF)是多个细菌黏附于非生物或生物表面，分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，并将自身包裹其中形成的一种有组织的细菌集团，包含多糖、蛋白质、胞外DNA和脂质等，是一个具有三维立体空间结构的生态系。生物膜形式的细菌有了EPS的保护，可以逃避机体免疫***的攻击以及抗菌药物的杀伤，耐药性增强，同时生物膜还能持续释放细菌，造成感染反复发作并且久治不愈。据报道，形成生物膜的细菌可以呈现出比浮游菌高达1000倍的抗生素耐药，使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染,严重威胁人类和动物健康。因此，急需寻找一种对细菌生物膜作用，尤其是对成熟生物膜的作用的生物活性物质。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用；本发明的目的之二在于提供抗微生物肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用；本发明的目的之三在于提供抗微生物环肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用；本发明的目的之四在于提供抗微生物环肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述细菌为铜绿假单胞菌。

2.抗微生物肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用，所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.抗微生物环肽CRAMP在制备细菌生物膜清除细菌生物膜的药物中的应用，所述抗微生物环肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述细菌为铜绿假单胞菌。

更优选的，所述抗微生物环肽CRAMP的有效剂量浓度大于5μM。

4.抗微生物环肽CRAMP在制备囊性纤维化肺炎的药物中的应用，所述抗微生物环肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

发明的有益效果在于：本发明合成了抗微生物肽CRAMP及环肽，首次发现对铜绿假单胞菌成熟生物膜有明显的清除作用和抑制形成，且明显优于对照LL-37。由于医学临床中致死率很高的囊性纤维化(Cystic fibrosis，CF)肺炎，根本原因就是铜绿假单胞菌成熟生物膜难以清除，所以该研究对囊性纤维化肺炎治疗及铜绿假单胞菌生物膜的消除策略和机制的深入研究有着十分重要的科学意义和医学临床价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为CRAMP和LL-37活菌数和生物膜量结果(A：LL-37；B：CRAMP；折线：生物膜活菌数；柱状图：生物膜量)。

图2为环肽CRAMP对铜绿假单胞菌的野生标准株PAO1生物膜的清除作用(折线：生物膜活菌数；柱状图：生物膜量)。

图3为不同蛋白酶对CRAMP抗E.coli活性的影响(抑菌圈直径，

N＝6)(Neutral protease：中性蛋白酶、Pepsase：胃蛋白酶、Trypsase：胰蛋白酶)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)是一种常见的条件致病菌，是囊性纤维化(Cystic fibrosis，CF)等肺部慢性感染的主要致病菌，也是引起免疫力低下机体慢性反复感染的常见病原体。该菌对多种常见抗生素耐药，感染易反复发作,难以清除，究其原因主要是极易形成BF，并能在动植物中引起广泛的感染，是目前所知种类最多，具有明显生态意义的细菌之一。因此本发明实施例以铜绿假单胞菌为例研究对BF具有生物活性的物质。

实施例1、CRAMP抗细菌生物膜研究

另据报道，LL-37在体外具有明显的抑制P.aeruginosa生物膜形成的作用，同时也观察到LL-37对已经形成的成熟P.aeruginosa生物膜也有一定作用，但是抑制效果有限，所以急需一种对细菌生物膜具有更有效地生物活性物质。CRAMP(Cathelicidin RelatedAntimicrobial Peptide)是存在于脊椎动物小鼠的睾丸，脾脏，胃，小肠等器官的生物活性多肽。是哺乳动物AMPs(Antimicrobial peptides)主要两个家族成员之一的Cathelicidin中的一种，结构以α-螺旋为主，氨基酸序列为：GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ(SEQID NO.1)。但目前关于CRAMP对细菌生物膜的作用，尤其是对成熟生物膜的作用还未见报道。

因此以本发明选择CRAMP和LL-37对P.aeruginosa进行生物膜抑制实验，通过结晶紫染色法和活菌计数，观察生物膜内的活菌数和生物膜量，结果如图1所示。结果显示，CRAMP对成熟生物膜具有明显的清除作用，且明显优于对照LL-37。

本实施例中合成CRAMP方法如下：

具体合成方法如下：

合成原料：树脂为取代度为1.03mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin(天津市南开合成科技有限公司)，氨基酸为Fmoc-Phe-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Arg(pbf)-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Ala-OH(成都诚诺，>99％)等。

合成试剂：DMF(原产地韩国)，DCM(原产地韩国)，MEOH(原产地日本)，DIEA(新德化工，99％)，HBTU(昊帆生物科技，99％)。

脱保护试剂：哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)。

检测试剂：苯酚试剂，吡啶试剂，茚三酮试剂。

裂解试剂：95％切割液：TFA(J.T.Baker，99％)，TIS(上海达瑞精细化工，98％)，EDT(上海达瑞精细化工，98％)，无水***(上海实验，实测99.7％)。

氮气：(新联气体)。

仪器：十二通道半自动多肽合成仪(上海强耀生物科技有限公司的半自动多肽合成仪)；SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.Sevial System，厂商：SHIMADZU)；LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)；离心机(上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B)

多肽合成步骤如下：以多肽04010029962为例，合成顺序：从C端到N端。

(1)树脂溶涨

将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；

(2)接第一个氨基酸

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Phe-OH氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min，用甲醇封闭；

(3)脱保护

去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。

(4)检测

抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；

(5)洗脱

用DMF(10ml/g)洗脱两次，DCM(10ml/g)洗脱两次，DMF(10ml/g)洗脱两次；

(6)缩合

保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min；

(7)检测

取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min，无色为阴性反应；

(8)洗脱

用DMF(10ml/g)洗一次，DCM(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次；

(9)重复三至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；

(10)抽干，按照下列方法洗树脂

DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min；

(11)从树脂上切割多肽

配制切割液(10/g)，TFA95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％，切割时间：120min；

(12)吹干洗涤

将裂解液用氮气尽量吹干，用***洗六次，然后常温挥干；

(13)分析提纯：

用高效液相色谱将粗品提纯；

(14)冻干

收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

实施例2、CRAMP环化处理

由于线性CRAMP存在副作用大，且稳定性差的问题，本实施例研究环化处理CRAMP的抗细菌生物膜活性和稳定性。

首先将GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ(SEQ ID NO.1)序列的首尾分别接上Cys(半胱氨酸)，获得的序列为：CGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQC(SEQ IDNO.2)，采用DMSO氧化法进行环化，缓冲盐pH＝8，10％的DMSO作为助溶剂，磁力搅拌反应10h，得到环肽CRAMP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3、验证环肽CRAMP的生物膜的清除作用

将实施例1合成的环肽CRAMP对野生标准株PAO1进行抗P.a生物膜研究，具体为：在96孔细胞培养板中，每次平行做2排，预先形成48h成熟PAO1生物膜，PBS液清洗后再加入浓度为0μM、0.62μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM和20μM的环肽CRAMP作用1h后，采用结晶紫法检测生物膜的量(biofilm mass)，另一排采用TSA平板测试生物膜活菌数，独立重复3次以上，结果如图2所示。结果显示，随着环肽CRAMP浓度增高PAO1活菌数逐渐减少(折线)，生物膜量在浓度高于1.25μM时，随着浓度升高生物膜量也逐渐减少(柱状图)，浓度大于5μM时生物膜量减少明显。表明环肽CRAMP对成熟生物膜具有明显的清除作用，且浓度大于5μM浓度时，环肽CRAMP对PAO1生物膜有显著的清除作用。

实施例4、验证环肽CRAMP对酶的稳定性考察

稳定性考察方法为在37℃水浴条件下，用反应浓度均为1mg/mL的中性蛋白酶(Neutral protease)、胃蛋白酶(Pepsase)、胰蛋白酶(Trypsase)分别处理CRAMP和环肽CRAMP30min，以不加酶处理的为对照。然后，再观察对E.coli的抑菌作用，结果如图3所示。结果发现，CRAMP对胃蛋白酶、胰蛋白酶不稳定，而环化处理后，稳定性显著提高。因此，使用环化CRAMP处理不但具有生物膜的清除作用，并且稳定性得到显著提高。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 抗微生物肽CRAMP及其环肽在制备清除细菌生物膜的药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys

1 5 10 15

Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val Pro Gln Pro

20 25 30

Glu Gln

<210> 2

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys

1 5 10 15

Lys Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val Pro Gln

20 25 30

Pro Glu Gln Cys

35

Claims (4)

1.抗微生物肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细菌为铜绿假单胞菌；所述抗微生物肽CRAMP的有效剂量浓度大于5μM。

2.抗微生物肽CRAMP在制备治疗囊性纤维化肺炎的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗微生物肽CRAMP的有效剂量浓度大于5μM。

3.抗微生物环肽CRAMP在制备清除细菌生物膜的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物环肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述细菌为铜绿假单胞菌，所述抗微生物环肽CRAMP的有效剂量浓度大于5μM；所述抗微生物环肽CRAMP由氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的抗微生物肽CRAMP采用DMSO氧化法进行环化，缓冲盐pH=8，10%的DMSO作为助溶剂，磁力搅拌反应10h得到。

4. 抗微生物环肽CRAMP在制备治疗囊性纤维化肺炎的药物中的应用，其特征在于：所述抗微生物环肽CRAMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗微生物环肽CRAMP的有效剂量浓度大于5μM；所述抗微生物环肽CRAMP由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗微生物肽CRAMP采用DMSO氧化法进行环化，缓冲盐pH=8，10%的DMSO作为助溶剂，磁力搅拌反应10h得到。

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