CN113292636A

CN113292636A - 抗菌六肽及其应用

Info

Publication number: CN113292636A
Application number: CN202110696847.8A
Authority: CN
Inventors: 计剑; 张鹏; 黄俊杰; 薛云帆; 赵俊博
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113292636B

Abstract

本发明公开了八种抗菌六肽及其应用，这八种抗菌六肽的氨基酸序列分别为：R‑W‑W‑R‑W‑W‑NH₂，R‑W‑W‑R‑W‑F‑NH₂，R‑W‑W‑R‑F‑W‑NH₂，R‑W‑W‑R‑L‑F‑NH₂，R‑W‑W‑R‑F‑F‑NH₂，W‑L‑R‑W‑F‑R‑NH₂，W‑W‑L‑F‑R‑R‑NH₂，R‑W‑W‑R‑I‑W‑NH₂。这八种抗菌六肽具有强力的杀菌性能，并保证较小的细胞毒性以及溶血性，且实际成本低，可用于制备治疗和/或预防细菌感染的药物。

Description

抗菌六肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及八种抗菌六肽及其应用。

背景技术

抗生素的滥用导致了细菌耐药性的产生，从而使细菌感染再一次成为一项威胁人类健康的重大安全问题。如今，由耐药菌引起的疾病已经越来越多，更为严重的是，多重耐药菌甚至超级细菌的出现，意味着目前的抗生素治疗体系濒临崩溃。为了应对这一问题，急需开发新型抗菌药物用于细菌感染的治疗。

细菌的耐药性作用主要有4类：

1、产生灭活酶分解进入细菌内部的抗生素；

2、改变细菌细胞膜通透性阻止抗生素的进入；

3、形成外排泵排除抗生素；

4、改变药物靶点使抗生素失效。

抗菌肽是一种具有特定氨基酸序列的抗菌生物分子，抗菌肽一般携带正电荷并且具有σ-螺旋或者β折叠等二级结构。抗菌肽的正电性使得其更易吸附并聚集于带负电的细菌细胞膜表面，而二级结构则使得抗菌肽可以***细菌细胞膜的磷脂双分子层并自组装形成孔洞结构杀死细菌。所以，抗菌肽的杀菌机理是破坏细菌细胞膜，与上述提到的细菌获得耐药性的4个方面毫无关联，因此抗菌肽不易产生耐药性，并被认为是下一代抗生素的替代物。

目前，抗菌肽大多包含10-60个氨基酸或以上序列(如公开号为CN 111892646 A、CN 109180794 A的专利技术等)。然而，抗菌肽的序列过长一方面容易产生较大的生物毒性，另一方面也增加了工业生产成本，这限制了抗菌肽的应用。但是，抗菌肽序列长度缩短容易导致抗菌肽的抗菌活性降低。

发明内容

针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了八种抗菌六肽，具有强力的杀菌性能，并保证较小的细胞毒性以及溶血性，且实际成本低。

八种抗菌六肽的氨基酸序列分别为下述之一：

抗菌肽1：R-W-W-R-W-W-NH₂，

抗菌肽2：R-W-W-R-W-F-NH₂，

抗菌肽3：R-W-W-R-F-W-NH₂，

抗菌肽4：R-W-W-R-L-F-NH₂，

抗菌肽5：R-W-W-R-F-F-NH₂，

抗菌肽6：W-L-R-W-F-R-NH₂，

抗菌肽7：W-W-L-F-R-R-NH₂，

抗菌肽8：R-W-W-R-I-W-NH₂。

上述八种抗菌六肽因其独特的氨基酸序列，可表现出显著的杀菌活性，并且在高浓度下表现出较低的细胞毒性以及溶血性，能够应用于治疗因细菌引起的肺炎、败血症等疾病的药物中。

本发明还提供了所述的八种抗菌六肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。

本发明还提供了一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物，所述药物含有所述的八种抗菌六肽中的至少一种。

本发明提供的八种抗菌六肽具有对细菌的抗/杀菌普适性，其主要作用机理为破坏细菌细胞膜。这八种抗菌六肽的净电荷为正，可以吸附到表面带负电的细菌细胞膜。而当吸附在细胞膜表面的这八种抗菌六肽达到一定浓度时，两亲性的多肽就会***细胞膜的磷脂层并在其中自组装产生孔洞破坏细菌细胞膜，从而杀死细菌。因此本发明八种抗菌六肽具有抗菌广谱性，对多种细菌均具有杀灭作用。

所述细菌可为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌，具体可为金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌等。

所述治疗和/或预防细菌感染的药物还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：

1)本发明通过大量研究，发现了上述八种特定序列的抗菌六肽具有强效、广谱的抗/杀菌活性，且细胞毒性以及溶血毒性弱，能够应用于治疗或者预防因细菌引起的疾病的药物中。

2)本发明的抗菌六肽可人工合成(可采用现有常规技术，如采用固相法合成等)，操作方便，肽链短，不论是制备成本还是原料成本、应用成本，都非常低，具有非常好的应用前景。

附图说明

图1-8分别依次为抗菌肽1-8的HPLC(a)与质谱(b)结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

抗菌肽1-8的固相合成：

一、树脂溶涨

称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)(15mL/g)，振荡30分钟.

二、接第一个氨基酸

通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1小时。用DMF和DCM交替清洗6遍。

三、脱保护

加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，5分钟，去掉再加15mL 20％哌啶DMF溶液(15mL/g)，15分钟。

四、检测

抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。

五、洗

DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

六、缩合

保护氨基酸(Fmoc-L-Gly-OH)三倍过量，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入N-甲基***啉(NMM)十倍过量。反应30分钟.

七、洗

DMF(10mL/g)一次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次。

八、重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

九、最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂。

DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次，DCM(10mL/g)两次，抽干10分钟。

十、从树脂上切割多肽

配制切割液(10/g)TFA94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％。

将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10mL/g，恒温震荡，时间：120分钟。

十一、吹干洗涤

将裂解液用氮气尽量吹干，用***层析出来，再用***洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。

十二、用HPLC纯化多肽

具体操作步骤：

1，取粗品肽200mg放入器皿中。用2-5mL 50％的乙腈水溶液溶清。可以稍微超声2分钟。

2，用0.45μm滤膜过滤溶解液。

3，分析：取3μL用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30分钟，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5分钟然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％,结束比例水5％，乙腈95％

4，制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10分钟，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40分钟。收集从检测器出来的样品。

5，鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。

十三、最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。

十四、将白色粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。

图1-8分别依次为抗菌肽1-8的HPLC(a)与质谱(b)结果图。

实施例2

抗菌肽的抗菌活性检测。

以下的所使用的标准菌株均购于广东省微生物菌种保存中心。

采用96孔板法对实施例1合成的抗菌六肽的抗菌活性进行检测，并用经FDA批准的抗菌肽短杆菌肽、多黏菌素作为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌对照，以评价抗菌肽1-8的抗菌活性。

按以下步骤测试抗菌肽的抗菌活性。

一、将金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)在灭菌的TSA培养基平板上培养过夜，挑取单菌落接种于灭菌的TSB培养基中37℃，150rpm，18小时过夜培养。

二、将抗菌肽1-8分别用PBS配成1024μg/mL，并按照2倍连续稀释的方式用PBS稀释成1024，512，256，128，64，32，16，8，4μg/mL并吸取100μL加入96孔板的2-9列孔位并重复6组加入B-G行。将培养后的细菌用TSB稀释成5×10^5CFU/mL，并在B2-D9孔中加入100μL稀释后的菌液作为实验组。此时，待测的肽的浓度(μg/mL)如下：

列数	2	3	4	5	6	7	8	9
									浓度	512	256	128	64	32	16	8	4

在E2-G9孔中加入100μL TSB溶液作为对照组，并在B10-D10孔中分别加入100μLPBS以及TSB作为阴性对照，在E10-G10孔中分别加入100μL PBS以及稀释后的菌液作为阳性对照。将96孔板用封口膜封口后装入自封袋置于37℃，150rpm，18小时过夜培养。用酶标仪分别测B2-D9孔的OD600值，最小的OD600值所对应的最小浓度便为该抗菌肽对应细菌的MIC值。

表1示出了抗菌肽1-8、短杆菌素、多黏菌素对不同细菌的最低抑菌浓度(MIC，μg/mL，0-32：+，32-512：++)

表1

	抗菌肽1	抗菌肽2	抗菌肽3	抗菌肽4	抗菌肽5
						S.aureus	+	+	+	+	+
E.coli	++	++	+	++	++
							抗菌肽6	抗菌肽7	抗菌肽8	短杆菌肽	多黏菌素
S.aureus	++	+	+	+	N/A
						E.coli	++	++	++	N/A	+

表1中的MIC越小，代表抑菌能力越强。表1显示本发明的八种抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均可表现出良好的抑菌能力，具有强效性、广谱性。

实施例3

抗菌肽1-8的细胞毒性检测。

本实施例用于检测实施例1合成的八种抗菌多肽对人体3T3细胞的细胞毒性，并用经FDA批准的短杆菌肽作为对比。

细胞毒性检测步骤：

一、将NIH-3T3细胞以5000/孔的密度接枝于96孔板中培养24小时使其充分贴壁。

二、配制200μg/mL抗菌肽1-8PBS溶液，并用DMEM培养基稀释为100μg/mL。除去96孔板中的培养基后，加入200μL 100μg/mL的含药培养基后继续培养24小时，每个组5个平行样。

三、吸除药物培养基后用PBS清洗3次，并在每孔中加入20μL噻唑蓝(MTT)溶液及100μL DMEM培养基，孵育4小时。吸除上清液，加入150μL DMSO充分溶解紫色甲瓒结晶。使用酶标仪读取OD 490nm吸收值。

细胞毒性计算公式为：

细胞存活率＝样品池吸收值/PBS池吸收值×100％。

表2示出了抗菌肽1-8细胞毒性检测结果(药物浓度100μg/mL)，并以短杆菌肽、PBS作为对照，其中细胞存活率80-100％：+，<80％：++。

表2

抗菌肽1	抗菌肽2	抗菌肽3	抗菌肽4	抗菌肽5
					细胞存活率	+	+	+	+	+
抗菌肽6	抗菌肽7	抗菌肽8	短杆菌肽	PBS
					细胞存活率	+	+	+	++	+

表2中，细胞存活率越大代表抗菌肽的细胞毒性越小。表2表明，抗菌肽1-8相比于短杆菌肽均表现出了明显更小的细胞毒性，为成药提供了强力的支撑。

实施例4

抗菌肽1-8的体外溶血性检测。

本实施例用于检测实施例1合成的八种抗菌六肽对红细胞的溶血性，并用经FDA批准的短杆菌肽作为对比。使用的血样取于无菌兔子血。

溶血性检测的步骤是：

一、取1mL全血，用1500rpm离心5分钟吸去上清液重复3次，加入20mL PBS配成血细胞溶液。

二、将抗菌肽1-8配成200μg/mL，并取100μL加入96孔板作为实验组，取Triton-X100(1wt％)100μL，PBS 100μL加入96孔板分别作为阳性对照以及阴性对照，每个样品重复5组。向加入样品的孔板中分别加入100μL血细胞溶液(此时所有样品的浓度减半，所有实验组的浓度为100μg/mL)，孔板封口后装入自封袋，并在37℃下150rpm孵育1小时。

三、孵育完毕后，吸取混合溶液于1.5mL离心管，并在1500rpm离心8分钟后吸取上清液用酶标仪测试OD 570nm值。

溶血率＝(A_m-A_n)/(A_p-A_n)

其中，A_m为实验组OD值，A_p为阳性对照OD值，A_n为阴性对照OD值。

表3示出了抗菌肽1-8溶血性检测结果(药物浓度100μg/mL)，并以短杆菌肽、Triton-X100为对照，其中溶血率0-30％：+，>30％：++。

表3

抗菌肽1	抗菌肽2	抗菌肽3	抗菌肽4	抗菌肽5
					溶血率	+	+	+	+	+
抗菌肽6	抗菌肽7	抗菌肽8	短杆菌肽	Triton-X100
					溶血率	+	+	+	++	++

溶血率越大代表抗菌肽对血细胞的毒性越大。表3表明，抗菌肽1-8相比于短杆菌肽均表现出了明显更小的溶血性，为成药提供了强力的支撑。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 抗菌六肽及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Trp Trp Arg Trp Trp

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Trp Trp Arg Trp Phe

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Trp Trp Arg Phe Trp

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Trp Trp Arg Leu Phe

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Trp Trp Arg Phe Phe

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Leu Arg Trp Phe Arg

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Trp Leu Phe Arg Arg

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Arg Trp Trp Arg Ile Trp

1 5

Claims

1.抗菌六肽，其特征在于，所述抗菌六肽的氨基酸序列为下述之一：

抗菌肽1：R-W-W-R-W-W-NH₂，

抗菌肽2：R-W-W-R-W-F-NH₂，

抗菌肽3：R-W-W-R-F-W-NH₂，

抗菌肽4：R-W-W-R-L-F-NH₂，

抗菌肽5：R-W-W-R-F-F-NH₂，

抗菌肽6：W-L-R-W-F-R-NH₂，

抗菌肽7：W-W-L-F-R-R-NH₂，

抗菌肽8：R-W-W-R-I-W-NH₂。

2.根据权利要求1所述的抗菌六肽在制备治疗和/或预防细菌感染的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

6.一种适用于治疗和/或预防细菌感染的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的抗菌六肽中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。