CN113499288B - 可用于化妆品的刺梨发酵物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种可用于化妆品的刺梨发酵物的制备方法，其特征在于，包括：将刺梨干果粉与适量的水混合经灭菌处理、冷却后得到发酵底物；往所述发酵底物接种乳酸菌进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到刺梨发酵液。本公开采用乳酸菌对刺梨果进行发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失，同时确保产品对人体的安全性，制得的刺梨发酵液化妆品中富含的VC、刺梨多糖等，具有清除自由基的功效物质，对皮肤具有较强的抗衰老功能。

Description

可用于化妆品的刺梨发酵物及其制备方法

技术领域

本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及一种可用于化妆品的刺梨发酵物及其制备方法。

背景技术

刺梨(学名：Rosa roxburghii Tratt.)系蔷薇科落叶灌木植物，别名缫丝花、刺梨子、木梨子、刺梨蔷薇等，主要分布在我国西南部的贵州、四川、云南等地，其果实富含维生素B、P及C，味甜酸，含大量维生素，可供食用及药用，生食或制蜜饯、酿酒，药用能解暑消食，还可作为熬糖酿酒的原料。

从刺梨果实中提取获得刺梨提取物，含有单宁、维生素C等功能性成分，可用于化妆品中，其对蛋白酶活性促进作用，说明具有抗氧化、抗衰老的作用；刺梨提取物对多种微生物具有抗菌的作用，也用作抗菌剂、抗炎剂。目前市场上含有刺梨成分的化妆品，都是在化妆品基础配方内添加一定比例的刺梨提取物，其添加量较低，同时受提取条件限制，提取物中所含物质成分有限，不能充分发挥刺梨的功效。

天然活性物质提取方法有水提取法、有机溶剂提取、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法和微生物发酵法等。面对如此众多的提取方法，如何筛选出更利于活性物质提取的方法，仍是本领域研发人员面临的技术难题。发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程，在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用。对采用发酵技术提取营养物质已多有报道，但是根据发酵底物和发酵工艺条件的不同，提取效果差别很大。有赖于研究人员继续探索更多发酵底物组合及发酵方法制备出更多、更优功效的产品以满足消费者需求。

发明内容

在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

鉴于现有技术的上述缺陷，本公开的目的是提供一种可用于化妆品的刺梨发酵物及其制备方法，利用乳酸菌对刺梨果进行发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了传统提取方法造成的活性成分流失，得到的发酵产品具有良好的安全性和抗氧化功效。

根据本公开的第一个方面，提供了一种可用于化妆品的刺梨发酵物的制备方法，包括：

将刺梨干果粉与适量的水混合经灭菌处理、冷却后得到发酵底物；

往所述发酵底物接种乳酸菌进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到刺梨发酵液。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述刺梨干果粉和水的用量比为1:10-1:40g/ml(比如1:15g/ml、1:20g/ml、1:25g/ml、1:30g/ml、1:35g/ml等)。如果如用水量太多制备的发酵液可能活性成分浓度太低，如用水量过少则发酵前水溶液中会某些物质比如酸类浓度太高，影响菌的生长，对发酵不利。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述乳酸菌为植物乳杆菌，其他乳酸菌亦可，但效果不及植物乳杆菌。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述刺梨干果粉是通过对刺梨鲜果干燥、粉粹处理，并过50目筛而得。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，用于接种的乳酸菌菌液通过将乳酸菌种依次活化、纯化、扩培所得，其OD值为0.5-1.0，所述乳酸菌菌液和所述发酵底物的体积比为1:5-1:20(比如1:6、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18等)。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵处理的温度为37-45℃(比如38℃、40℃、42℃、44℃等)，时间为6-16h(比如7h、8h、10h、12h、14h、15h等)；更优选地，所述发酵处理在摇床中进行，设定转速为150r/min-180r/min(比如155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、175r/min)。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理的压力为0.2-0.4Mpa，温度为100-121℃(比如102℃、105℃、110℃、115℃、118℃等)，时间为15-30min(比如18min、20min、22min、25min、28min等)。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min(比如4600r/min、4800r/min、5000r/min、5200r/min、5400r/min等)，离心时间为20min-40min(比如25min、30min、35min等)。

上述刺梨发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，还包括：对所述刺梨发酵液进行干燥处理，最终得到刺梨发酵干粉；更优选地，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥等。

根据本公开的第二方面，还提供了一种采用上述方法制备的发酵产品，包括发酵液、发酵干粉等。

根据本公开的第三方面，还提供了上述发酵产品在制备化妆品中的应用；优选地，所述化妆品可以是面膜、精华液、爽肤水、乳液等。

按照本公开的方法制得的刺梨发酵物含有刺梨多糖、VC等活性物质，可清除多余活性氧及自由基，保护及修复紫外的损伤，提高内源性抗氧化酶的活性从而达到抗氧化的作用，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，制备包括但不限于：面膜、精华液、爽肤水、乳液等化妆品中。

本公开与相比现有技术具有如下有益效果：

(1)本公开采用乳酸菌对刺梨果进行发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。

(2)本公开所采用的发酵法，在对刺梨有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性。

(3)本公开提供的刺梨发酵原浆pH4.3-4.5，适合人体皮肤，对人体的安全性高，可直接用作化妆品。

(4)本公开提供的刺梨发酵物中富含的VC、刺梨多糖等具有清除自由基的功效物质，用于化妆品，对皮肤具有较强的抗衰老功能，同时还具有良好的人体安全性。

附图说明

图1为实施例1中最佳条件制得的刺梨发酵液清除DPPH自由基实验结果示意图；

图2为实施例1中最佳条件制得的刺梨发酵液进行鸡胚绒毛***试验所得照片；

图3为实施例1中最佳条件制得的刺梨发酵液进行红细胞溶血实验所得溶血曲线。

具体实施方式

在下文中将结合示范性实施例对本公开的技术方案进行描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的刺梨干果粉，采用购自于市面的刺梨果，干燥粉碎后经过筛分(过50目筛)去除了尺寸较大的颗粒所得。

下述实施例中的乳酸菌为植物乳杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC20261；所用培养基为MRS培养基；乳酸菌活化、纯化、扩培的培养温度30-37℃。

实施例1

本实施例的刺梨发酵物的具体制备步骤如下：

(1)菌种活化：从保藏的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，使保持更高的生活力。

(2)菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。

(3)菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在适宜温度的摇床中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度。

(4)发酵底物制备：将刺梨干果粉与水按1g:20ml-1g:40ml的比例配制成刺梨干果粉培养基，即发酵底物；

(5)接菌和摇菌：把扩培培养基里的菌液接种到刺梨干果粉培养基中，菌液与发酵底物的体积比为1:5-1:20，并且在摇床中发酵，转速为180r/min，发酵温度为45℃，发酵时间为6-16h，具体参见表1。

(5)灭菌：将发酵后刺梨果乳酸菌培养液高压灭菌，使菌失活。

(6)离心：离心处理发酵液，4800r/min离心30min，保留上清，得到一系列刺梨果发酵液，具体参见下表1，从表中可以看出，最佳制备条件为料液比(发酵底物中刺梨果粉与水的用量比，g/mL)1：20、接菌量(菌液体积与发酵底物的用量比，mL/mL)1：10、发酵时间15h、发酵温度45℃，以该条件制得的刺梨发酵液进行后续的性能检测。

表1实施例1发酵工艺条件

实施例2

对实施例1最佳条件(编号1-1)制得的刺梨发酵液的主要成分，包括蛋白质、粗多糖、总黄酮、总酚进行检测；同时对其清除自由基进行分析，对其抗氧化进行评价；另外，对该刺梨发酵液化妆品进行体外刺激性实验，以证明其安全性，还通过人体贴斑实验验证了刺梨发酵原液的人体安全性。

一、发酵液理化性质分析

对实施例1制备所得的刺梨发酵液进行理化性质分析。其外观为粘稠液体、颜色为淡粉色至棕红色；pH值4.3-4.5，粘度160-180cP，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以刺梨发酵液符合化妆品质量要求。

对实施例1制得的刺梨发酵液进行成分分析，按照最佳条件制备所得刺梨发酵液中含蛋白质7.1g/L、粗多糖4.9g/L、总黄酮3.5g/L(以芦丁计)、总酚3.4g/L、VC 1.4g/L。

二、人体斑贴实验

人体斑贴试验(以下简称“斑试”)主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。对实施例1中最佳条件制得的刺梨发酵液(刺梨发酵原浆)进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1.空白对照：空白滤纸对照。

2.阴性对照：去离子水。

3.受试者：共30人，男女不限，年龄20至28岁，符合受试者志愿入选标准。

4.斑试方法：选用合格的斑试器材，以封闭性斑贴试验方法，将受试物0.020mL～0.025mL(液体)置于斑试器内，外用低致敏胶带贴敷于受试者背部，24小时后去除受试物，于去除后0.5(待压痕消失后),24,48小时观察皮肤反应，按表2所示《化妆品卫生规范》皮肤反应分级标准记录其结果。

表2皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

表3人体斑贴实验结果汇总

人体皮肤斑贴试验结果如表3显示，刺梨果发酵液在30人中未出现皮肤不良反应，根据《化妆品卫生规范》中规定，30例受试者中出现1级皮肤不良反应的多于5例或2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何一例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有明显不良反应。通过实验结果可得出刺梨果发酵液未引起人体不良反应，具有较好的安全性和耐受性。

三、发酵液的抗氧化性能检测

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

本实施例中实验步骤如下：

样品制备：使用水倍比稀释实施例1中最佳条件制得的刺梨发酵液稀释6个浓度梯度，体积分数分别为3％、1.5％、0.75％、0.38％、0.19％、0.1％。样品加液要求参见表4。在所有试管中(T、T₀、C、C₀)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用95％乙醇，补足3mL，混匀。在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL，样品本底(T₀)和溶剂本底(C₀)用95％乙醇代替，轻轻摇匀，室温下静置5min。将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。

表4样品加液要求

	T-样品管	T<sub>0</sub>-样品本底	C-DPPH管	C<sub>0</sub>-溶剂本底
					样品溶液(mL)	1	1	-	-
水或95％乙醇溶剂(mL)	2	2	3	3
					DPPH乙醇溶液(mL)	1	-	1	-
95％乙醇(mL)	-	1	-	1
					平行次数	3/样	1/样	3/试验	1/试验

按照下式计算DPPH自由基清除率：

通过对DPPH自由基清除实验，做出实施例1制得的刺梨发酵液对DPPH自由基清除作用曲线，见图1。从图1中可以看出，刺梨发酵液对DPPH清除作用的IC50＝0.97％，说明刺梨发酵液具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。

四、刺梨发酵液的安全性评价

1.鸡胚绒毛***试验(HET-CAM)

鸡胚绒毛***试验(HET-CAM)是一种经典的眼刺激性体外评估方法，适用于对化妆品产品或原料的评价。绒毛***(CAM)是位于鸡胚周围的呼吸膜。本试验利用孵化中期的CAM血管膜***完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与CAM接触，作用一段时间之后通过观察绒毛***毒性效应指标(如：出血、凝血和血管融解)的变化，组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。这些指标反映了血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及绒毛***蛋白质变性等现象及其受损程度。

采用终点评价法进行的试验，应计算终点评分(ES)。根据鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度；每个样品做六组平行试验，并将各血管反应分值相加，以总分值最高的血管反应得分作为最终分值以该组中评分最高的值作为反应ES值。根据ES数值按表5对受试物眼刺激性进行分类。

表5 HET-CAM终点评估法的眼刺激性预测模型

受试物包括：阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和实施例1中最佳条件制得的刺梨果发酵液(6个平行)。鸡胚绒毛***试验结果见图2，图中编号1#、2#、3#、4#、5#、6#分别为样品的平行。从图中可以看出，样品作用其前后均无出血现象，再根据评分可知刺梨果发酵液无眼刺激性。

对阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和刺梨果发酵液加样前后的CAM进行形态学观察和打分，得到表6如下，其中编号1、2、3、4、5、6分别为样品的平行。

表6刺梨果发酵液实验记录

2.红细胞溶血实验

红细胞溶血实验(Red blood cell test，RBC)，是兔眼刺激实验(Draize test)的替代方法之一。红细胞被认为是研究生物膜效应最好的生物来源，操作性强且同质性好。RBC实验的基本原理是通过检测红细胞中血红蛋白的漏出量及蛋白质的变性程度来评价化学品对眼组织的刺激性。国际上也广泛地将RBC实验用于化妆品产品及原料等化学品的眼刺激性研究。

本实验的具体步骤如下：

1.RBC的前处理

(1)血液的获取和运输

屠宰场取新鲜兔血盛装于聚乙烯塑料容器中，按1：9加入抗凝剂柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21-22℃。30分钟内运于实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1小时。

(2)RBC的分离

1)分装稀释：收集新鲜血液(已用柠檬酸抗凝剂处理)用PBS溶液稀释(血液：PBS＝4：10体积比)；

2)离心去杂：在室温下，用1500×g离心上述稀释液10min，离心后的上清液和淡黄色的白细胞层小心地吸掉，然后添加PBS重复上述洗涤离心步骤2-3次(第2次离心时打开酶标仪预热15min)。

3)RBC悬液配制：最后一次离心后，将沉淀的细胞用PBS稀释至浓度约为2％红细胞悬液(约2mL沉淀+98mL PBS)，轻轻摇晃均匀。

4)RBC浓度校准：取0.5mL上述细胞悬液于10mL EP管中，加入蒸馏水稀释至5mL，混匀反应1分钟，用酶标仪在541nm处测量(PBS为空白对照，用红细胞悬液调吸光度)，理想的吸光值应为0.5(±5％)。将处理好的RBC悬液密封于4℃储存。

2.溶血曲线的测定

(1)将实施例1最佳制备条件制得的刺梨发酵液加水稀释而成体积浓度为20％、40％、60％、80％、100％的样品溶液，然后将各浓度梯度样品溶液与RBC悬液按3：1的比例添加(750μL样品+250μL RBC)，混匀。

(2)将受试物RBC混合液在室温下摇床孵育60min。

(3)将各EP管置于离心机中，10000rpm/min速度离心1分钟，终止孵育。

(4)取上清液测量其在540nm处的吸光度值。每个浓度做三个平行，结果取平均值。

(5)同时测定对照组：

阴性对照(零溶血)：750μL PBS+250μL RBC，设阴性对照的溶血率为0％；

阳性对照：750μl 0.1％SDS水+250μL RBC；

完全溶血对照：750μL水+250μL RBC，设完全溶血对照的溶血率为100％。

3.数据处理

将各组在560nm波长下测得的吸光度OD值与浓度梯度曲线，取线性区作回归线，并将560nm***性对照与阳性对照OD值的差值带入回归线方程，得到H₅₀(以在测试体系中的浓度表示)。

计算公式如下：

红细胞溶血实验结果如下。

溶血曲线见图3，由图3可以得知实施例1制得的刺梨发酵液的溶血率低于水提液(水提液为发酵液的样品对照，制备步骤同发酵液，其中不接入乳酸菌)。

实施例3

在确定了最佳工艺条件后，选用不同的乳酸菌种对刺梨果进行发酵，菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌名称分别为：CICC20241-类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，CICC20261-高加索酸奶乳菌(Lactobacillus kefiri)，CICC20243-瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，发酵工艺与例1相同，通过检测发酵液中的活性物质含量对菌种进行筛选，通过表7可知，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.Plantarum)相比其他三种菌发酵产物的VC、多糖、多酚含量，黄酮较优。

表7不同乳酸菌发酵活性物质含量

对比例1

在确定了最佳工艺条件后，又使用酵母菌对刺梨果进行发酵，酵母选用酿酒酵母，分离于黄酒小麦，已于中国医学细菌菌种保藏管理中心(CMCC)保藏，保藏号为CMCC17452，发酵工艺与实施例1确定的最佳工艺条件相同，最终实验结果刺梨多糖为3.9g/L、蛋白质6.1g/L、总黄酮1.5g/L(以芦丁计)、总酚3.1g/L、VC含量为1.114g/L，活性物质含量低于乳酸菌发酵液。

对比例2

在确定了最佳工艺条件后，又使用植物乳杆菌对刺梨果原浆进行发酵，刺梨果产自于贵州，刺梨果原浆使用榨汁机获取，发酵工艺与实施例1确定的最佳工艺条件相同，最终实验结果刺梨多糖为3.7g/L、蛋白质3.1g/L、总黄酮1.3g/L(以芦丁计)、总酚2.1g/L、VC含量为1.243g/L，活性物质含量低于刺梨干果粉发酵液。

最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种用于化妆品的刺梨发酵物的制备方法，其特征在于，包括：

将刺梨干果粉与适量的水混合经灭菌处理、冷却后得到发酵底物，所述刺梨干果粉和水的用量比为1:20-1:30 g/ml；

往所述发酵底物接种乳酸菌进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到刺梨发酵液；所述乳酸菌为植物乳杆菌；用于接种的乳酸菌菌液通过将所述乳酸菌菌种依次活化、纯化、扩培所得，所述乳酸菌菌液的OD值为0.5-1.0，所述乳酸菌菌液和所述发酵底物的体积比为1:10-1:20；

所述发酵处理的温度为37-45℃，时间为6-16h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述刺梨干果粉是通过对刺梨鲜果干燥、粉粹处理，并过50目筛而得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵处理在摇床中进行，设定转速为150 r/min-180r/min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的压力为0.2-0.4Mpa，温度为100-121℃，时间为15-30min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离处理采用离心方法。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为4500r/min -5500r/min，所述离心的时间为20min-40min。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括：对所述刺梨发酵液进行干燥处理，最终得到刺梨发酵干粉。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述干燥处理是喷雾干燥或真空冷冻干燥。

9.一种刺梨发酵物，采用如权利要求1-8中任一项所述的方法制备而成。

10.一种化妆品，包括适量的如权利要求9所述的刺梨发酵物。

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