CN115678805A - 一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，包括如下步骤：S1，将酿酒酵母接种于装有YPD液体培养基的器具中；S2，通入空气并密封后，振荡过夜培养后得到酿酒酵母种子液；S3，将松茸子实体制成松茸粉；S4，将松茸细粉加入酿酒酵母种子液中；S5，对发酵后发酵原液进行纯化处理；本发明提供的松茸酵母发酵液制备方法工艺简单，能够有效利用酵母菌对松茸原料进行发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和；制成的松茸酵母发酵液，能够有效利用酵母菌对松茸原料进行发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和，化妆品中添加该成分能给予皮肤再生活力；该松茸酵母发酵液为纯天然物质发酵制得，无添加、安全、无刺激。

Description

一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法及其 应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法及其应用。

背景技术

近年来随着化妆品消费量的快速提升，消费者使用不当或使用不合格产品的频次增加，再加上近年来气候变暖、环境污染、工作生活压力增大等多种因素，致使很多消费者皮肤角质层纷纷受损，皮肤屏障功能遭到破坏，轻则发展成为经常干痒、刺痛、红肿、泛红的敏感性皮肤，重则有可能难以治愈，使用“绿色”、“安全”、且具有抗炎、抗氧化、抗刺激、抗衰等多种功效的纯天然化妆品原料是有效缓解这些皮肤问题的首要选择。

松茸，又名黑松茸、姬松茸、松口蘑等，是一种珍稀的纯天然食用菌，营养丰富，含有多种蛋白质、氨基酸、核苷酸、不饱和脂肪酸、多糖以及维生素等成分，有研究表明其具有非常好的清除自由基、抗辐射、抗炎抗刺激、抗氧化抗衰以及抗癌等功效。当前市场上已有一些含有松茸提取物的化妆品，但由于这些松茸提取物普遍采用传统的高温蒸煮水提、有机溶剂萃取等工艺，不仅会严重损害松茸的有效活性成分，而且会导致大量的有机溶剂残留；并且由于松茸价格昂贵，所以大部分松茸提取物产品的添加量极少，很难发挥其真正的功效；少部分添加量较多的产品则价格高昂，大多数普通消费者难以承受，因而其应用的普及和保质期都受到限制。

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法及其应用及其在化妆品中的应用实例，能够有效利用酿酒酵母对松茸原料进行发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和，不需要额外添加化学试剂，松茸原料中的多种天然活性成分能得到最大限度的保留，而且酵母发酵过程中产生大量的酵母特有的β-葡聚糖、蛋白质等活性物质，会显著增强松茸原料的功效性；化妆品中添加适量的松茸酵母发酵液可有效缓解泛红、干痒、刺痛、红肿等敏感性肌肤问题，修护皮肤的屏障功能，使皮肤恢复健康状态。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是提供一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将酿酒酵母接种于装有YPD液体培养基的器具中，所述酿酒酵母为中国工业微生物菌种保藏管理中心酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC 1001)，所述器具包括试管、摇瓶及发酵罐等；

S2，通入空气并密封后，在28～32℃温度下，200～250rpm摇床震荡培养1～2天，振荡过夜培养后得到酿酒酵母种子液；

S3，将松茸子实体清洗干净，切片干燥后，过50目滤网，并且粉碎过筛的次数大于或等于两次，打成细粉，制成松茸粉；

S4，待种子菌培养至对数增长期中后期后，将松茸细粉加入酿酒酵母种子液中，30℃搅拌发酵3-7天；

S5，对发酵后发酵原液进行发酵原液进行过滤、离心或超声波离心处理，得到松茸酵母发酵液；

过滤处理：则采用纱布过滤以及400目筛网过滤收集滤液，得到松茸粉含量较高的发酵液；

离心处理：则采用0～10℃，8000～10000rpm高速离心20～30min 留取上清，得到松茸粉含量较少的发酵液；

超声波处理：则先进行超声波处理、再进行过滤以及高速离心处理后留取上清，得到松茸粉含量较少的发酵液。

作为优选，在步骤S1中，所述YDPA液体培养基的配制方法具体为：

S11、YPD培养基配方及配制：称取20.0g Peptone，10.0g Yeast Extract，加入约800mL ddH2O中，搅拌均匀；

S12、向步骤S11得到的1.0L 20％YPD培养基中分别加入20.0g 葡萄糖、3.0gKH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)，搅拌均匀；

S13、用ddH2O定容至1000mL，调节至pH 5.8-6.0，110～130℃高压灭菌15～30min，冷却至室温即得构成YPD液体培养基。

作为优选，所述的酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母、深红酵母、假丝酵母、巴氏酵母或鲁氏结合酵母中的至少一种，所述液体培养基为 YPD液体培养基，所述酵母菌与所述液体培养基的体积比为1-5：100，所述酵母菌在无菌条件下接种于所述液体培养基。

作为优选，所述松茸粉按质量百分比包括：10～30％的松茸粉。

作为优选，所述松茸粉应在酵母菌培养至对数增长期、中后期后，方可加入酿酒酵母种子液中。

作为优选，所述液体培养基为YPD液体培养基，并且所述液体培养基还包括果糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)和琼脂中的至少一种。

作为优选，所述液体培养基在加入器具之前，需经过110～130℃高压灭菌15～25min，并冷却至室温或经过0.22微米滤膜过滤。

作为优选，在步骤S4中，所述通气密封培养具体为：通气密封后，在28～32℃温度下，摇床震荡的转速为100～250rpm，震荡培养 7～15天。

作为优选，所述松茸酵母发酵液的获得须经过滤、离心或超声波离心处理两次或两次以上，并经脱色除臭处理后制得。

作为优选，一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液可作敷用化妆品精华液、乳液、爽肤水、面霜、面膜的添加物的任意一种。

本发明技术效果主要体现：(1)、该松茸酵母发酵液的制备方法工艺简单，能够有效利用酵母菌对松茸原料进行发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和，不需要额外添加化学试剂，松茸原料中的多种天然活性成分可以得到最大限度的保留，而且酵母发酵过程中产生大量的酵母特有的β-葡聚糖、蛋白质等活性物质，会显著增强松茸原料的功效性，技术难度小，节能省工、生产效率高；

(2)、该松茸酵母发酵液蛋白含量高，活性强，具有显著的抗氧化和抗炎效果，化妆品中添加该成分能给皮肤再生活力予以保障，并且该成分有良好的亲水性和亲油性，使用后会增添皮肤光泽，高效抗氧化，延缓衰老，阻止年龄相关的肌肤弹性损失，修饰及改善面部轮廓，以及阻止或改善橘皮紋的岀现，具有抗菌性，对雄性激素偏高引起的粉刺有防治效果，可调理油性肌肤，帮助受损的组织愈合及紧实肌肤，既能促进表皮与真皮之间的密切连接；

(3)、该松茸酵母发酵液为纯天然物质发酵制得，无添加、安全、无刺激。

附图说明

图1是本发明实施例1中松茸酵母发酵液的制备方法的流程图；

图2是本发明实施例1中酿酒酵母生长曲线；

图3是本发明实施例1-3及对比例1-3所制得的松茸酵母发酵液的DPPH自由基清除率；

图4是本发明实施例1-3及对比例1-3所制得的松茸酵母发酵液与HaCaT细胞增殖的关系图；

图5是本发明实施例1-3及对比例1-3所制得的松茸酵母发酵液与COX-2基因相对表达量的关系图；

图6是本发明实施例1-3及对比例1-3所制得的松茸酵母发酵液与IL-1α基因相对表达量的关系图；

图7是本发明实施例1-3及对比例1-3所制得的松茸酵母发酵液与NF-kB基因相对表达量的关系图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步详述，以使本发明技术方案更易于理解和掌握。

在本实施例中，需要理解的是，术语“中间”、“上”、“下”、“顶部”、“右侧”、“左端”、“上方”、“背面”、“中部”、等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

另，在本具体实施方式中如未特别说明部件之间的连接或固定方式，其连接或固定方式均可为通过现有技术中常用的螺栓固定或钉销固定，或销轴连接等方式，因此，在本实施例中不在详述。

实施例1

参考图1，本实施例提供了一种松茸酵母发酵液的制备方法，包括如下步骤：

S1，将酿酒酵母接种于装有YPD液体培养基的器具中，所述酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、深红酵母、假丝酵母、巴氏酵母或鲁氏结合酵母中的至少一种，所述器具包括试管、摇瓶及发酵罐等；

具体地，酵母菌优选为中国工业微生物菌种保藏管理中心酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC 1001)，YPD液体培养基与酵母菌的接种量体积比优选为100：1-5。酿酒酵母在无菌条件下接种于YPD液体培养基中，避免接种过程中引入其他菌种以及添加额外的其他化学试剂，从而利于保证松茸酵母发酵液中营养成分来源清晰，有据可查。

S2，通入空气并密封后，在28～32℃温度下，200～250rpm摇床震荡培养1～2天，振荡过夜培养后得到酿酒酵母种子液；

具体地，通入空气并密封后，在30℃温度下，230rpm摇床震荡培养1天，以使酿酒酵母快速增殖，每隔2个小时取样1mL菌液，适当稀释后测定其在600nm处的吸光值，然后以酵母菌细胞吸光值为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制生长曲线。

S3，将松茸子实体清洗干净，切片干燥后，过50目滤网，并且粉碎过筛的次数大于或等于两次，打成细粉，制成松茸粉；

具体地，将松茸子实体烘干、除杂、粉碎成粉，然后过50目滤网，并且粉碎过筛的次数大于或等于两次，以使松茸粉碎更均匀，大大提升胞内营养物质的利用率，从而实现增大胞外活性成分含量，有效提升活性物质的产量。

S4，待酿酒酵母种子菌培养至对数增长期中后期后，按10～30％的添加量将松茸细粉加入酿酒酵母种子液中，28～32℃，200～250rpm 搅拌发酵3-7天；

具体地，根据S2所绘生长曲线，选取培养至对数增长期中后期的酿酒酵母种子液，称取20％的松茸粉加入其中，30℃搅拌发酵3-7 天；

S5，对发酵后发酵原液进行处理，得到松茸酵母发酵液。

具体地，对发酵后的发酵原液进行过滤、离心或超声波离心处理。若进行过滤处理，则采用纱布过滤以及400目筛网过滤收集滤液，得到松茸粉含量较高的发酵液。若进行离心处理，采用0～10℃，8000～10000rpm高速离心20～30min留取上清，得到松茸粉含量较少的发酵液。若先进行超声波处理，再进行过滤以及高速离心处理后留取上清，则得到松茸粉含量较少的发酵液。此外，还可根据化妆品厂商的不同需求，添加活性炭或大孔树脂除色除臭等步骤。

可见，本实施例松茸酵母发酵液的制备方法，通过利用酿酒酵母和松茸粉协同发酵，并且依次经过多次高压均质、超声破碎、高速离心、除色除臭等处理步骤，得到松茸酵母发酵液，相比于采用传统的高温蒸煮水提、有机溶剂萃取等工艺，本发明松茸酵母发酵液中活性物质的产率高，并且生产成本低。此外，本发明松茸酵母发酵液具有显著的抗氧化和抗炎效果，能够促进HaCaT细胞增殖与HaCaT细胞自噬，对HaCaT细胞和Raw264.7细胞的毒性极低或不毒性。

进一步地，YDP液体培养基包括常见的蛋白胨以及酵母粉外，并且还包括葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)和琼脂中的至少一种。

本实施例中，YDPA液体培养基的配制方法如下：

(1)YPD培养基配方及配制：称取20.0g Peptone，10.0g Yeast Extract，加入约800mL ddH2O中，搅拌均匀；

(2)向步骤(1)得到的1.0L 20％YPD培养基中分别加入20.0 g葡萄糖、3.0gKH2PO4、1.5g MgSO4·7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)，搅拌均匀；

(3)用ddH2O定容至1000mL，调节至pH 5.8-6.0，110～130℃高压灭菌15～30min，冷却至室温即得构成YPD液体培养基。由此，通过110～130℃高压灭菌15～30min，防止液体培养基中的杂菌干扰酵母菌的发酵。

进一步地，本实施例还提供了一种化妆品，该化妆品应用如上所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法。

实施例2

本实施例与实施例1的不同点在于，S3中，待酿酒酵母种子菌培养至对数增长期中后期后，按10％的添加量将松茸细粉加入酿酒酵母种子液中，其它部分均于实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1的不同点在于，S3中，待酿酒酵母种子菌培养至对数增长期中后期后，按30％的添加量将松茸细粉加入酿酒酵母种子液中，其它部分均于实施例1相同。

对比例1

本对比例与实施例1的不同点在于，省去步骤S3，其它部分均于实施例1相同。

对比例2

本对比例与实施例1的不同点在于，省去步骤S4，其它部分均于实施例1相同。

对比例3

本对比例与实施例1的不同点在于，对松茸酵母发酵液加热煮沸 15～25min，其它部分均于实施例1相同。

阳性对照组

250μg/mL维生素C

对实施例1-3、对比例1-3中菌菇发酵液进行如下性能测试：

(1)蛋白含量检测

试验方法：采用BCA方法检测蛋白含量，检测条件为：碧云天 BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)。

A.蛋白标准品的准备

a.取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL。例如取20μL25mg/mL蛋白标准，加入980μL稀释液即可配制成0.5mg/mL 蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％ NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/mL蛋白标准可以-20℃长期保存。

B.BCA工作液配制

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1) 配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mL BCA试剂A加100μL BCA 试剂B，混匀，配制成5.1mL BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

C.蛋白浓度测定

a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，需加标准品稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。

c.各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30分钟。

d.用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。

e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

试验结果见表1。

表1受检样品的蛋白含量(mg/mL，mean±SD)

	蛋白含量
		实施例1	21.094±3.136
实施例2	10.167±2.231
		实施例3	22.356±3.004
对比例1	0.318±3.136
		对比例2	1.105±1.142
对比例3	8.613±3.136

由表1可知，实施例1-3中蛋白含量明显高于对比例1-3。对比例1省略了松茸粉，但其发酵液中蛋白含量与实施例1相比有明显的下降，表明松茸粉的引入，能够显著提高发酵液中蛋白含量。对比例 2省去酵母菌发酵，但发酵液中蛋白产量明显下降，说明酿酒酵母的引入，可以提高发酵液的蛋白生物合成量。对比例3通过加热煮沸 15～25min，其发酵液中蛋白含量明显低于实施例1，表明本发明所得的松茸酵母发酵液中富含多种生物活性物质，加热煮沸会导致蛋白变性，显著降低发酵液中活性物质的产率。

(2)DPPH自由基清除能力实验

试验方法：将上述实施例1-3、对比例1-3制得的松茸酵母发酵液以及阳性对照VC用无水乙醇稀释，得到50％(v/v)浓度的松茸酵母发酵液溶液，作为受试样品。分别取400μL于1.5ml离心管中，加入1200μL 10μM DPPH溶液，室温下避光反应30min；每管取出200μL转移至96孔板中，检测515nm处的反应吸光值，记为 As。空白对照组用同等体积的无水乙醇代替上述受试样品，结果记为 A0，阳性对照组用同等体积的100μg/mL VC溶液代替样品；阴性对照组用同等体积的无水乙醇代替DPPH溶液，As0作为阴性对照组结果。具体测试结果见图3。

式中：样品组的吸光度为A_S；阴性对照组的吸光度为A_S0；空白组的吸光度为A₀。

由图2可知，实施例1-3和对比例1-3制得的松茸酵母发酵产物相比空白组对DPPH自由基均具有显著的清除作用。实施例2松茸含量相比实施例1由20％降至10％，清除DPPH自由基的能力下降20％左右；实施例3松茸含量由20％升至30％，清除DPPH自由基的能力并没有随之升高，说明松茸含量在20％以下会随着浓度的升高而升高，20％左右达到最大值。对比例1省略了松茸粉，其发酵液对DPPH自由基清除能力与实施例1相比有明显的下降，说明松茸粉的引入，能够显著提高菌菇发酵液的抗氧化能力。对比例2省去酵母菌发酵，其发酵液对DPPH自由基清除能力与实施例1相比有明显的下降，说明酿酒酵母的引入，能够显著提高发酵液的抗氧化能力。对比例3对发酵液煮沸加热，其发酵液对DPPH自由基清除能力与实施例1相比有明显的下降，说明发酵液中含有多种活性成分，可以显著提高菌菇发酵液的抗氧化能力，一旦加热则导致活性丢失。

(3)HaCaT细胞毒性试验

试验方法：取对数生长期HaCaT细胞，用胰酶消化，离心(1000 rpm，5min)，计数，以3×103cells/孔密度接种于96孔板，每孔 100μL细胞悬液。铺板24h后，加入含有不同浓度实施例1所制得的松茸酵母发酵产物的DMEM完全培养基，以DMEM完全培养基作为空白对照，每个浓度设置3个复孔，48h后每孔加入10μL CCK8，孵育2h后，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果，具体试验结果见表2。

式中：样品组的吸光度为A_S,450nm-A_S,630nm；空白组的吸光度为 A_0,450nm-A_0,630nm。

表2不同浓度试验样品对HaCaT细胞毒性的影响对比(mean， n＝3)

注：*表示与空白组相比具有显著差异。

由表2可知，本发明实施例1-3和对比例1-3制得的松茸酵母发酵液在所测定的体积分数浓度下(5-20％)，对HaCaT细胞活率均有促进作用；10％体积分数浓度下促进作用最强，在20％体积分数浓度下，对HaCaT细胞活率促进作用略有下降。根据欧盟国家实验室化妆品毒性的判定标准，本发明发酵液在所测定的浓度范围内均对HaCaT细胞的毒性极小或无毒性。

(4)HaCaT细胞增殖试验

试验方法：分别取上述实施例1-3及对比例1-3制得的菌菇发酵液用DMEM基础培养基稀释至10％(v/v)，作为受检溶液。将对数生长期的HaCaT细胞以5×104cells/mL，100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃在5％的CO2培养箱中培养24h；弃去旧的培养基，用PBS溶液清洗一遍，然后向每孔细胞溶液中分别加入受检溶液100 μL，阳性对照组加入胎牛血清(20％FBS)空白组加入等体积DMEM基础培养基，置于37℃恒温中培养48h；每孔加入10μLCCK8溶液，于37℃恒温避光孵育2h；以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果，具体试验结果见图3。

式中：样品组的吸光度为A_S,450nm-A_S,630nm；空白组的吸光度为A_0,450nm-A_0,630nm。

由图3可知，10％浓度的实施例1-3和对比例1-3制得的松茸酵母发酵液均对HaCaT细胞无毒；对HaCaT细胞增殖具有显著的促进作用，且实施例1松茸酵母发酵产物的促增殖效果最为显著，比阳性对照组20％胎牛血清稍好。

(5)Raw264.7细胞毒性试验

试验材料：实施例1-3及对比例1-3制得的菌菇发酵液，DMEM 完全培养基(DMEM培养基：FBS：青霉素/链霉素溶液＝89：10：1， v/v/v)，胰酶。

试验对象：Raw264.7细胞

试验方法：除了将细胞更换为Raw264.7细胞，及铺板密度更换为1*106cells/mL外，其它同HaCaT细胞毒性试验，具体试验结果见表3。

表3不同浓度试验样品对Raw264.7细胞毒性的影响对比(mean， n＝3)

注：*表示与空白组相比具有显著差异。

由表3可知，本发明实施例1-3及对比例1-3制得的菌菇发酵液在所测定的体积分数浓度下(5-20％)，对HaCaT细胞活率均有促进作用；10％体积分数浓度下促进作用最强，在20％体积分数浓度下，对 HaCaT细胞活率促进作用略有下降。根据欧盟国家实验室化妆品毒性的判定标准，本发明发酵液在所测定的浓度范围内对Raw264.7细胞的毒性极小或无毒性。

(6)抗炎相关基因表达检测

试验材料：实施例1-3及对比例1-3制得的松茸酵母发酵液；DMEM 基础培养基(DMEM培养基：青霉素/链霉素溶液＝99：1，v：v)、胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25％，含EDTA)、PBS溶液、DMEM完全培养基(DMEM培养基：FBS：青霉素/链霉素溶液＝89：10：1，v/v/v)、ELISA试剂盒(COX-2，IL-1α，NF-kB)；

试验方法：分别取上述松茸酵母发酵液用DMEM基础培养基稀释至10％(v/v)作为受检溶液；然后进行如下操作：

①铺板与加样：取生长状态良好的RAW264.7细胞以1×106 cells/mL的密度，2mL/孔铺6孔板培养16h后，更换为同体积含不同浓度受检样品的培养基，1h后加入LPS诱导6h；以DMEM完全培养基作为空白对照，80μM***作为阳性对照。

②提取RNA：同试验例5；

③合成cDNA并进行PCR扩增：同试验例5；

④将cDNA用于Real-Time PCR定量检测：除了将引物更换为：

COX-2:

上游引物：ATTCCAAACCAGCAGACTCATA，下游引物：

CTTGAGTTTGAAGTGGTAACCG；

IL-1α:

上游引物：CGCTTGAGTCGGCAAAGAAAT，下游引物： AGATGGTCAATGGCAGAACTGT；

NF-kB:

上游引物：TCTCAGCTGCGACCCCG，下游引物：TGGGCTGCTCAATGATCTCC；

内参基因GAPDH:

上游引物：TGCACCACCAACTGCTTAGC，下游引物： GGCATGGACTGTGGTCATGAG；

其它同HaCaT细胞毒性试验；

⑤采用2^-ΔΔCT法进行数据处理，具体试验结果参见图4-6。

由图4-6可知，10％浓度的本发明实施例1-3及对比例1-3制得的菌菇发酵液抑制了炎症相关基因(COX-2，IL-1α，NF-kB)的表达，且实施例1菌菇发酵液的抗炎效果最为显著。可见，本发明松茸酵母发酵液能够抑制炎症相关基因的表达，进而发挥抗炎功效。

本发明技术效果主要体现：

(1)、该松茸酵母发酵液的制备方法工艺简单，能够有效利用酵母菌对松茸原料进行发酵和生物活性成分的再加工，反应条件温和，不需要额外添加化学试剂，松茸原料中的多种天然活性成分可以得到最大限度的保留，而且酵母发酵过程中产生大量的酵母特有的β-葡聚糖、蛋白质等活性物质，会显著增强松茸原料的功效性，技术难度小，节能省工、生产效率高；

(2)、该松茸酵母发酵液蛋白含量高，活性强，具有显著的抗氧化和抗炎效果，化妆品中添加该成分能给皮肤再生活力予以保障，并且该成分有良好的亲水性和亲油性，使用后会增添皮肤光泽，高效抗氧化，延缓衰老，阻止年龄相关的肌肤弹性损失，修饰及改善面部轮廓，以及阻止或改善橘皮紋的岀现，具有抗菌性，对雄性激素偏高引起的粉刺有防治效果，可调理油性肌肤，帮助受损的组织愈合及紧实肌肤，既能促进表皮与真皮之间的密切连接；

(3)、该松茸酵母发酵液为纯天然物质发酵制得，无添加、安全、无刺激。

当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将酿酒酵母接种于装有YPD液体培养基的器具中，所述酿酒酵母为中国工业微生物菌种保藏管理中心酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC1001)，所述器具包括试管、摇瓶及发酵罐等；

S2，通入空气并密封后，在28～32℃温度下，200～250rpm摇床震荡培养1～2天，振荡过夜培养后得到酿酒酵母种子液；

S3，将松茸子实体清洗干净，切片干燥后，过50目滤网，并且粉碎过筛的次数大于或等于两次，打成细粉，制成松茸粉；

S4，待种子菌培养至对数增长期中后期后，将松茸细粉加入酿酒酵母种子液中，30℃搅拌发酵3-7天；

S5，对发酵后发酵原液进行发酵原液进行过滤、离心或超声波离心处理，得到松茸酵母发酵液；

过滤处理：则采用纱布过滤以及400目筛网过滤收集滤液，得到松茸粉含量较高的发酵液；

离心处理：则采用0～10℃，8000～10000rpm高速离心20～30min留取上清，得到松茸粉含量较少的发酵液；

超声波处理：则先进行超声波处理、再进行过滤以及高速离心处理后留取上清，得到松茸粉含量较少的发酵液。

2.根据权利要求1所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，在步骤S1中，所述YDPA液体培养基的配制方法具体为：

S11、YPD培养基配方及配制：称取20.0g Peptone，10.0g Yeast Extract，加入约800mLddH2O中，搅拌均匀；

S12、向步骤S11得到的1.0L 20％YPD培养基中分别加入20.0g葡萄糖、3.0g KH2PO4、1.5g MgSO4 7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)，搅拌均匀；

S13、用ddH2O定容至1000mL，调节至pH 5.8-6.0，110～130℃高压灭菌15～30min，冷却至室温即得构成YPD液体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，所述的酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母、深红酵母、假丝酵母、巴氏酵母或鲁氏结合酵母中的至少一种，所述液体培养基为YPD液体培养基，所述酵母菌与所述液体培养基的体积比为1-5：100，所述酵母菌在无菌条件下接种于所述液体培养基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，所述松茸粉按质量百分比包括：10～30％的松茸粉。

5.根据权利要求4所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，所述松茸粉应在酵母菌培养至对数增长期中后期后，方可加入酿酒酵母种子液中。

6.根据权利要求1-3任一项所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，所述液体培养基为YPD液体培养基，并且所述液体培养基还包括果糖、KH2PO4、MgSO4 7H2O、微量硫胺素(Vit.B1)和琼脂中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，所述液体培养基在加入器具之前，需经过110～130℃高压灭菌15～25min，并冷却至室温或经过0.22微米滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述通气密封培养具体为：通气密封后，在28～32℃温度下，摇床震荡的转速为100～250rpm，震荡培养7～15天。

9.根据权利要求1所述的一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的制备方法，其特征在于，所述松茸酵母发酵液的获得须经过滤、离心或超声波离心处理两次或两次以上，并经脱色除臭处理后制得。

10.根据权利要求1-9中任一项所述一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液的应用，其特征在于,一种具有修复抗衰功效的松茸酵母发酵液可作敷用化妆品精华液、乳液、爽肤水、面霜、面膜的添加物的任意一种。

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