CN113632922A - 一种溶胞物、以及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种溶胞物、以及制备方法与应用，所述制备方法包括：将益生菌接种到发酵燕麦液中进行培养，培养完成后对所述发酵燕麦液离心、取上清液，所述上清液为溶胞物。本发明以发酵燕麦液作为培养基质，取代了传统的具有化学成分的培养基。益生菌是对人体安全有益的菌株，发酵基质均为食品级原料，原料安全性高，因而所制得的溶胞物安全性高，应用广泛；本发明的制备工艺简单，可实现大规模生产；溶胞物成分种类多种多样。产物包含乳酸、醋酸、β‑葡聚糖、多糖、多酚化合物、氨基酸、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、小分子活性肽等。
Description
技术领域
本发明涉及技术溶胞物领域，具体涉及一种溶胞物、以及制备方法与应用。
背景技术
目前，人体在压力、环境污染等情况下，皮肤易处于氧化应激的状态，人们尤其是女性对天然来源且具有抗氧化、抗衰老化妆品的需求在不断提高。近些年来，越来越多的益生菌发酵溶胞物(如二裂酵母溶胞物)添加到化妆品中。如何生产安全且功能突出的益生菌溶胞物原料，成为不断优化的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种溶胞物、以及制备方法与应用，本发明中以发酵燕麦液作为培养基质，接种益生菌进行培养得到溶胞物，溶胞物成分安全，包含多种抗氧化物质，抗氧化功能突出。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种溶胞物的制备方法，所述制备方法包括：将益生菌接种到发酵燕麦液中进行培养，培养完成后对所述发酵燕麦液离心、取上清液，所述上清液为溶胞物。
进一步地，所述益生菌为乳杆菌和/或双歧杆菌；
所述乳杆菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、卷曲乳杆菌中的一种或多种；所述双歧杆菌包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述发酵燕麦液中包括酶解燕麦粉和水；
或所述发酵燕麦液中包括酶解燕麦粉、酵母浸粉和水；
其中，所述发酵燕麦液中所述酶解燕麦粉的含量为6％-15％(w/v)，所述酵母浸粉的含量为0％-5％(w/v)。
进一步地，所述益生菌的接种量为1％-3％。
进一步地，培养时间为18h-24h，培养温度为30-37℃。
进一步地，培养完成后对所述发酵燕麦液进行剪切、均质，然后进行离心、取上清液，所述上清液灭菌后储藏得到所述溶胞物。
进一步地，所述剪切的转速为2500-3000rpm，剪切时间15-20min；所述均质先在100-400bar下均质2-4个循环，再在600-1500bar下均质5-12个循环。
第二方面，本发明提供了由上述制备方法制备得到的溶胞物。
进一步地，所述溶胞物中包括：
抗氧化酶、抗氧化物质、抑菌物质及其他活性物质；
其中，所述抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶中的至少一种；
所述抗氧化物质包括多糖、β-葡聚糖、多酚化合物中的至少一种；
所述抑菌物质包括乳酸、醋酸、小分子多肽中的至少一种；
所述其他活性物质包括氨基酸、脂磷壁酸中的至少一种。
第三方面，本发明提供了上述的溶胞物的应用，所述溶胞物应用于化妆品、食品、药品中。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明提供了一种溶胞物的制备方法，所述制备方法包括：将益生菌接种到发酵燕麦液中进行培养，培养完成后对所述发酵燕麦液离心、取上清液，所述上清液为溶胞物。本发明至少具有以下优势：
(1)本发明以发酵燕麦液作为培养基质，取代了传统的具有化学成分的培养基。益生菌是对人体安全有益的菌株，发酵基质均为食品级原料，原料安全性高，因而所制得的溶胞物安全性高，应用广泛；
(2)本发明的制备工艺包括益生菌发酵、高速剪切、高压均质、高速离心、灭活。发酵工艺简单，可实现大规模生产；
(3)区别于现有技术中取菌体破碎后得到溶胞物，本发明中取上清得到溶胞物具有以下优点：A、功能成分更丰富。溶胞物不仅包含益生菌溶胞物及代谢产物，还包含燕麦有效活性成分，益生菌溶胞物富含抗氧化酶、小分子活性肽、脂磷壁酸等，益生菌的代谢产物有乳酸、醋酸等脂肪酸及小分子活性物质，燕麦中包含丰富的抗氧化抗衰老物质如β-葡聚糖、多糖、多酚类化合物、氨基酸等。区别于传统意义上的二裂酵母溶胞物，仅包含益生菌的胞内有效成分。B、应用范围更广泛。本发明溶胞物是收集的发酵上清液，无明显絮状沉淀，可应用于爽肤水等水状护肤品中。区别于传统意义上的益生菌溶胞物，大多呈絮状沉淀状。C、货架期内稳定性更好。因本发明溶胞物为上清液，极大去除了菌体及碎片，在货架期内不易发生染菌及进一步代谢的可能。
(4)溶胞物功效突出：可调节皮肤微生态平衡，有效清除自由基、提高皮肤抗氧化酶活力、抑制皮肤致病菌、减少皮肤皱纹、延缓衰老。
附图说明
图1为益生菌发酵燕麦溶胞物的制备方法的流程图；
图2为益生菌发酵燕麦溶胞物的清除自由基能力；
图3为益生菌发酵燕麦溶胞物的总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活力；
图4为益生菌发酵燕麦溶胞物对致病菌的抑制性；
图5为长双歧杆菌溶胞物的细胞活力曲线；
图6为婴儿双歧杆菌溶胞物的细胞活力曲线；
图7为副干酪乳杆菌溶胞物的细胞活力曲线；
图8为长双歧杆菌溶胞物作用于细胞形态学检测结果；
图9为婴儿双歧杆菌溶胞物作用于细胞形态学检测结果；
图10为副干酪乳杆菌溶胞物作用于细胞形态学检测结果；
图11为溶胞物活性氧(ROS)含量柱状图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明的限制。
第一方面，本发明提供了一种溶胞物的制备方法，所述制备方法包括：将益生菌接种到发酵燕麦液中进行培养，培养完成后对所述发酵燕麦液离心、取上清液，所述上清液为溶胞物。
具体地，燕麦中富含β-葡聚糖、氨基酸、多糖等物质。益生菌特别是乳杆菌、双歧杆菌的溶胞物中富含抗氧化酶、有机酸、脂磷壁酸、小分子活性肽、多糖等，具有抵抗紫外线损伤，促进皮肤细胞DNA修复，提供皮肤抵抗力的功效，可用于各类乳化、水基及水醇体系的护肤、防晒及晒后护理产品，帮助预防表皮及真皮的光老化。本发明中以发酵燕麦液作为培养基质，区别于现有的培养基，具有食品级的安全性。本发明将益生菌接种到发酵燕麦液中进行培养，培养完成后对所述发酵燕麦液离心、取上清液，所述上清液为溶胞物。本发明中的益生菌是对人体安全有益的菌株，发酵基质具有食品级的安全性，因而所得到的溶胞物安全性高，且同时具有益生菌发酵后的产物以及发酵燕麦液中的小分子物质，溶胞物中的成分多样且功效突出。
根据本发明的一些实施例，所述益生菌为乳杆菌和/或双歧杆菌；所述乳杆菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、卷曲乳杆菌中的一种或多种；所述双歧杆菌包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种。在本发明中，所述益生菌接种到发酵燕麦液中之前要先进行活化，所述活化的方法为：将益生菌以1％-3％的接种量接入种子培养基，37℃培养18h-24h，活化两次，其中乳杆菌在好氧环境中培养，双歧杆菌在厌氧环境中培养。具体地，所述种子培养基包含以下成分：蛋白胨1％，牛肉浸粉0.8％，酵母浸粉0.4％，葡萄糖2％，山梨醇酐单油酸0.1％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸三铵0.2％，三水乙酸钠0.5％，七水硫酸镁0.02％，四水硫酸锰0.005％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，双蒸水95％。
根据本发明的一些实施例，所述发酵燕麦液中包括酶解燕麦粉和水；或所述发酵燕麦液中包括酶解燕麦粉、酵母浸粉和水；其中，所述发酵燕麦液中所述酶解燕麦粉的含量为6％-15％(w/v)，所述酵母浸粉的含量为0％-5％(w/v)。在本发明中的酶解燕麦粉是经燕麦粒浸泡、匀浆、α-淀粉酶、β淀粉酶和普鲁兰酶酶解、酶灭活，喷雾干燥而得。
根据本发明的一些实施例，所述益生菌的接种量为1％-3％。
根据本发明的一些实施例，培养时间为18h-24h，培养温度为30-37℃。在本发明中，将益生菌先进行活化，活化后的益生菌以1％-3％的接种量接种到发酵燕麦液中，恒温箱培养18h-24h，温度30-37℃。
根据本发明的一些实施例，培养完成后对所述发酵燕麦液进行剪切、均质，然后进行离心、取上清液，所述上清液灭菌后储藏得到所述溶胞物。
根据本发明的一些实施例，所述剪切的转速为2500-3000rpm，剪切时间15-20min；所述均质先在100-400bar下均质2-4个循环，再在600-1500bar下均质5-12个循环，其中1个循环是指从液体进入均质机到排出的时间。
根据本发明的一些实施例，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将益生菌以1％-3％的接种量接入种子培养基，37℃培养18h-24h，活化两次，其中，乳杆菌在好氧环境中培养，双歧杆菌在厌氧环境中培养；
(2)将活化的益生菌菌液经生理盐水洗脱三次，重悬后以1％-3％的接种量转接至发酵基质发酵燕麦液中。恒温箱培养18h-24h，温度30-37℃；
(3)将发酵燕麦液经高速剪切机2500rpm-3000rpm，剪切15-20min；
(4)将发酵燕麦液经均质机均质，选择一级压力100-400bar均质2-4循环，600-1500bar均质5-12个循环；
(5)将发酵燕麦均质液经8000rpm-12000rpm离心5min-10min，获得浅黄色、清澈上清液；用10％氢氧化钠溶液调节pH值为4.0-4.5；
(6)上清液经90℃-100℃灭菌10-15min，置于棕色瓶中，冷藏储存。
第二方面，本发明提供了由上述制备方法制备得到的溶胞物。
根据本发明的另一些实施例，所述溶胞物中包括：抗氧化酶、抗氧化物质、抑菌物质及其他活性物质；其中，所述抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶中的至少一种；所述抗氧化物质包括多糖、β-葡聚糖、多酚化合物中的至少一种；所述抑菌物质包括乳酸、醋酸、小分子多肽中的至少一种；所述其他活性物质包括氨基酸、脂磷壁酸中的至少一种。利用本发明中所述制备方法制备得到的溶胞物，成分种类多种多样，溶胞物功效突出，可调节皮肤微生态平衡，有效清除自由基、提高皮肤抗氧化酶活力、抑制皮肤致病菌、减少皮肤皱纹、延缓衰老。
第三方面，本发明提供了上述的溶胞物的应用，所述溶胞物应用于化妆品、食品、药品中。其中，所述食品和保健品不限于果蔬汁、蛋白饮料、含乳饮料、发酵型含乳饮料、植物类饮料；所述化妆品不限于乳霜、爽肤水、眼霜、面膜、精华霜、喷雾剂。所述药品不限于外用药膏、外用喷剂、口服液态型制品。
下面通过一些具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1制备益生菌发酵燕麦溶胞物
益生菌发酵燕麦溶胞物流程如图1所示。
(1)种子活化：将副干酪乳杆菌种子液以1％比例接入MRS液体培养基(OXOID)，37℃好氧静置培养24h；按此步骤活化两次。将活化后的菌液经高速离心机离心10min，转速为8000rpm，获得高活力菌体；用0.9％生理盐水洗脱三次，将菌浓调整至1*109CFU/ml；
(2)发酵培养基配制：称取8g酶解燕麦粉和2g食品级酵母浸粉，用蒸馏水补齐100mL，在磁力搅拌器中50℃搅拌20min，经均质机均质，选择一级压力200bar，均质2个循环，90℃灭菌10min；
(3)益生菌发酵：以1％接种量将副干酪乳杆菌接入发酵培养基中，37℃下静置培养24h；
(4)高速剪切：将培养好的发酵燕麦液经高速剪切机剪切20min，剪切速率为2500rpm；
(5)高压均质：将发酵燕麦液经均质机均质，选择一级压力200bar均质4个循环，850bar均质10个循环；
(6)离心与灭活：将发酵燕麦均质液经高速离心机8500rpm离心5min，获得浅黄色、清澈上清液。用10％氢氧化钠溶液调节pH值为4.2。上清液经灭菌处理，90℃灭菌10分钟。放置于棕色瓶中，4℃储存；
(7)微生物检测：测试上清液中的活菌总数及致病菌。活菌总数小于10CFU/mL，致病菌未检出，符合化妆品卫生标准GB7916-87中化妆品总数小于1000CFU/mL的要求。
对比例1-10是对工艺的摸索和优化，益生菌选择副干酪乳杆菌。
对比例1
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，将步骤(2)中燕麦浓度更换为6％。
对比例2
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，将步骤(2)中燕麦浓度更换为10％。
对比例3
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，将步骤(2)中燕麦浓度更换为12％。
对比例4
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，将步骤(2)中燕麦浓度更换为15％。
对比例5
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，步骤(2)中的酵母浸粉浓度改为0。
对比例6
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，步骤(2)中的酵母浸粉浓度改为5％。
对比例7
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，步骤(5)中的均质步骤改为一级压力200bar均质4个循环，600bar均质10个循环。
对比例8
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，步骤(5)中的均质步骤改为一级压力200bar均质4个循环，1500bar均质10个循环。
对比例9
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，步骤(6)中的离心转速改为3000rpm。
对比例10
一种益生菌发酵燕麦溶胞物，具体步骤如实施例1所示，不同之处在于，步骤(6)中的离心速率改为0。
通过测定副干酪乳杆菌发酵后的pH、菌数和两种抗氧化能力，来对比实施例1以及对比例1～10的工艺。SOD是超氧化物歧化酶，T-AOC是总抗氧化能力。抗氧化指标利用南京建成公司购买的试剂盒，按操作说明书进行测定。
将实施例1与对比例1～10进行发酵情况、抗氧化能力、溶胞物形态对比，结果如表1所示。
表1不同工艺制备的益生菌发酵燕麦溶胞物的对比
实施例1与对比例1-4对比，可发现随着燕麦浓度的提高，益生菌的菌数越高，抗氧化能力越强。当燕麦浓度在8％时，溶胞物的抗氧化能力已达到较高水平。结合工艺用料的性价比、高压均质的有效性及抗氧化性，较优地，选择8％的燕麦浓度。
实施例1与对比例5、6对比，可发现酵母浸粉可促进益生菌的增值，但对比例6所得溶胞物颜色较深，考虑应用的广泛性，最优地，选择2％酵母浸粉。
实施例1与对比例7、8对比，可发现随着均质压力的提升，溶胞物的抗氧化能力有所提高，但无明显差异。鉴于大规模生产时的能耗、机器保养及产品性价比，较优地，均质压力为850bar。
实施例1与对比例9、10对比，可发现溶胞物经均质后，需经过离心的步骤，获得澄清溶液，去除不易吸收利用的大分子物质及菌体破碎物。未离心和3000rpm离心组溶胞物中包含絮状沉淀，考虑应用的广泛性和有效性，最优地，离心转速为8500rpm。
根据实施例1与10个对比例的对比，认为实施例1中的条件较优。
实施例2益生菌发酵燕麦溶胞物的抗氧化性能测定
根据实施例1中所述制备方法，利用四个不同菌种(长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌和植物乳杆菌)分别发酵燕麦基质得到四种溶胞物。其中，长双岐杆菌和婴儿双岐杆菌采用厌氧方式培养。
对四种溶胞物进行抗氧化性能测定，指标包含羟自由基清除测定(·OH)、DPPH自由基清除测定、总抗氧化能力测定(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)。DPPH自由基清除试验采用比色法，其原理是自由基清除剂提供一个电子与DPPH自由基的孤对电子配对，使自身紫色变为黄色，在517nm波长处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除能力越强，吸光度越小。其他指标利用南京建成公司购买的试剂盒，按操作说明书进行测定。
表2益生菌溶胞物抗氧化能力测定
注释：基质裂解物是指燕麦和酵母粉配置的培养基，经相同步骤得到的上清液，并未添加益生菌发酵。产品S为市售溶胞物产品。
结果如表2、图2、图3所示。数据表明，相比于阳性对照(商业产品S和0.05％维生素C)，以四种不同菌种发酵的燕麦溶胞物具有更强的抗氧化能力。本专利中呈现的溶胞物均可有效清除羟自由基和DPPH自由基，清除能力均高于94％；溶胞物具有优秀的总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活力，总抗氧化能力高于17U/mL，超氧化物歧化酶活力超过25U/mL；其中长双歧杆菌溶胞物的超氧化物歧化酶能力最高；植物乳杆菌溶胞物的总抗氧化能力最强。
由此可见，益生菌溶胞物可高效清除自由基，提高抗氧化酶活性，有效缓解皮肤氧化及衰老。
实施例3益生菌发酵燕麦溶胞物的产物分析
本实施例对益生菌发酵燕麦溶胞物中的功能性成分如抗氧化成分和氨基酸成分进行分析。抗氧化成分测定了多酚类化合物和多糖物质；氨基酸检测类型有谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
(1)多酚类化合物检测方法
溶胞物经离心过膜，上清液用90％丙酮提取并沉淀蛋白和糖类等，以焦性没食子酸配制标准曲线，用福林酚试剂氧化标准曲线与样品中的羟基基团使其显蓝色，用紫外分光光度计测定吸光度值来确定含量(以酚羟基摩尔浓度计)。
(2)多糖检测方法
溶胞物经乙醇沉降多糖后再用80％乙醇多次洗涤残渣。用水溶解残渣后经苯酚-硫酸法水解(葡萄糖曲线同步水解，结果以葡萄糖计)，用紫外分光光度计测定吸光度值来确定含量。
(3)氨基酸检测方法
各氨基酸经柱前进样器自动衍生，氨基酸分析柱分离，紫外检测器(和/或荧光检测器)检测，以保留时间定性，以峰面积外标法定量。
表3溶胞物功能性成分分析
检测结果：
本实施例选择的发酵菌种是长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌和植物乳杆菌，按照实施例1中的方法制备溶胞物。以商业产品S作为对照。结果如表3所示。所得溶胞物中具有多酚化合物，多酚具有很强的抗氧化活性；多糖包含燕麦多糖及益生菌代谢产生的多糖类物质。已有研究表明，多糖具有抗氧化功效。四种溶胞物中的多酚及多糖含量均高于产品S。其中，植物乳杆菌溶胞物中的多酚类物质及多糖含量最高。
四种溶胞物具有多种氨基酸，含量均高于产品S。氨基酸具有优秀的抗氧化功能，修复皮肤屏障，维持皮肤健康状态。谷氨酸和组氨酸有助于防止UV损伤，天冬氨酸可构建皮肤DNA；苏氨酸可促进弹性蛋白和胶原蛋白的合成；甲硫氨酸清除自由基，延缓衰老；脯氨酸有助于减少皮肤眼角皱纹；甘氨酸利于皮肤愈合。
实施例4益生菌发酵燕麦溶胞物的抑菌能力分析
本实施例对溶胞物的抑菌成分进行分析，同时测定溶胞物对致病菌的抑制能力。
(1)抑菌成分检测方法
溶胞物经过衍生化后转变为酯类，经过异辛烷萃取，经气相色谱柱分离，以保留时间定性，外标法定量。检测指标为乳酸、乙酸和甲酸。
(2)溶胞物对致病菌的抑制能力测定
致病菌菌液制备：以金黄色葡萄球菌ATCC6538和大肠杆菌ATCC8739为指示菌，将种子液接种于营养肉汤培养基中，37℃震荡培养24h；将活化后的菌液以3％转接至新鲜营养肉汤培养基中震荡培养6h。将致病菌的菌液浓度调整到OD＝0.1，备用。
溶胞物抑菌能力测定：将OD＝0.1的菌液转接至含有10％溶胞物的营养肉汤培养基(样品组)和单纯营养肉汤培养基(空白对照组)中，37℃好氧培养16h，测定各组OD600值及致病菌的菌数。计算溶胞物对致病菌的抑制率。
计算公式＝1-(样品组菌数/空白对照组菌数)*100％。
表4溶胞物抑菌成分分析
表5溶胞物对致病菌的抑制性
抑菌成分分析见表4。溶胞物中乳酸、乙酸、甲酸含量均有区别。四种溶胞物的抑菌成分含量高于基质裂解物和产品S。其中，长双歧杆菌和植物乳杆菌溶胞物的乳酸含量最高，婴儿双歧杆菌溶胞物的乙酸含量最为丰富。
溶胞物对致病菌的抑制能力测定结果见表5及图4。数据显示，本实施例提供的四种益生菌溶胞物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制性，抑制率高达71.96％-79.53％；抑制性高于基质裂解物和产品S。
因此，本实施例中的溶胞物抑菌成分丰富，一方面便于产品储存，防止杂菌污染；另一方面抑制皮肤病原菌及皮肤保湿，强化皮肤表层。
实施例5益生菌发酵燕麦溶胞物在皮肤角质形成细胞毒性检测
选择长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌发酵燕麦溶胞物进行皮肤角质形成细胞毒性检测。
1.细胞毒性检测方法
(1)按1.00E+04个/孔的接种密度接种角质形成细胞至96孔板，培养箱在(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。实验设置空白对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度(0.0078％,0.0156％,0.0313％,0.0625％,0.125％,0.25％，0.5％和1％)，每个浓度梯度下设置3个重复。
(2)待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。空白对照组每孔加入200μL细胞培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度溶胞物的培养液；调零孔无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中培养。
(3)细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
(4)细胞相对活力计算：根据下列公式计算：
细胞相对活力(％)＝(样品孔OD-调零孔OD)/(空白对照孔OD-调零孔OD)×100％。
2.细胞毒性检测结果
每个样品设定8个给药浓度(①～⑧为别为：0.0078％,0.0156％,0.0313％,0.0625％,0.125％,0.25％，0.5％和1％。)，在角质形成细胞上开展细胞毒性检测实验，MTT检测结果见表6，细胞活力变化趋势如附图5-7所示。
表6益生菌溶胞产物MTT检测结果(细胞存活率)
结果显示，在三组样品中，样品浓度等于或低于0.5％时，细胞存活率均高于90％。样品浓度在1％时，细胞存活率约82％。基于MTT实验结果，三种样品均选择以下5个浓度(0.0625％，0.125％，0.25％，0.5％和1％)进行形态学检测。
实施例6益生菌发酵燕麦溶胞物作用于皮肤角质形成细胞形态学检测
选择长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌发酵燕麦溶胞物进行皮肤角质形成细胞形态学检测。
1.形态学检测方法
(1)细胞接种：设立样品组与溶剂对照组，每组设两个复孔。按相应的接种密度接种细胞至24孔板中，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。
(2)配液：根据MTT检测结果，确定检测样品的形态学观察浓度，配制不同浓度(0.0625％，0.125％，0.25％，0.5％和1％)的受试物工作液。
(3)给药：待24孔板细胞铺板率达到40％时，进行给药，样品组加入不同浓度的溶胞物，溶剂对照组加入角质形成细胞培养液，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育24h。
(4)细胞观察：孵育结束后，显微镜下观察细胞形态并拍照。
2.形态学检验结果
形态学检测结果见附图8-10。
长双歧杆菌溶胞物浓度为0.5％时，细胞相对活力值为90.14％，细胞状态与溶剂对照组细胞状态在镜下无明显差异。故根据MTT结果和形态学结果，样品在0.5％的浓度范围内对角质形成细胞未表现出明显的细胞毒性。
婴儿双歧杆菌溶胞物浓度为0.5％时，细胞相对活力值为91.77％，细胞状态与溶剂对照组细胞状态在镜下无明显差异。故根据MTT结果和形态学结果，样品在0.5％的浓度范围内对角质形成细胞未表现出明显的细胞毒性。
副干酪乳杆菌溶胞物浓度为0.5％时，细胞相对活力值为90.13％，细胞状态与溶剂对照组细胞状态在镜下无明显差异。故根据MTT结果和形态学结果，样品在0.5％的浓度范围内对角质形成细胞未表现出明显的细胞毒性。
实施例7益生菌发酵燕麦溶胞物在皮肤角质形成细胞功效评价
选择长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌发酵燕麦溶胞物进行皮肤角质形成细胞功效评价。
1.功效评价方法
功效评价选择活性氧含量(ROS)作为检测指标。方法如下：
(1)细胞接种：以2.8E+05个/孔的细胞接种量接种角质形成细胞至6孔板中，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。
(2)配液：按照实验分组(表7)配置受试物工作液。
表7实验分组
(3)给药：根据表7实验分组设计，待6孔板中细胞的铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔。培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中继续培养24h。
(4)UVB辐照：按实验分组(表7)对需要进行UVB辐照的组别进行UVB辐照(辐照剂量为300mJ/cm2)。
(5)ROS含量检测
a)辐照结束后，直接用PBS清洗每孔细胞3次；
b)流式检测：每孔加1mL浓度为10μM活性氧试剂盒中的DCFH-DA探针，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育30min；弃掉含DCFH-DA的培养液，用PBS清洗3次，胰酶(0.25％)消化细胞后，PBS清洗细胞1次，加入0.5mL新鲜PBS，流式检测；
c)结果分析：汇总各组MFI(平均荧光强度)，进行统计分析。
结果统计分析应用GraphPad Prism Program软件作图，样品组与对照组采用t-test统计分析，p<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2.活性氧(ROS)含量检测结果
基于试验方法，进行ROS含量检测，ROS含量检测结果如表8所示，组间ROS含量变化如图11所示：
表8活性氧(ROS)含量检测结果汇总
注：汇总各样品的MFI(平均荧光强度)值，用t-test方法进行统计分析时，阴性对照组与空白对照组相比，显著性以#表示，p值<0.05表示为#，p值<0.01表示为##；样品组、阳性对照组与阴性对照组相比，显著性以*表示，p值<0.05表示为*，p值<0.01表示为**。
与空白对照组相比，阴性对照组活性氧含量显著上升，说明本次实验UVB刺激条件有效。与阴性对照组相比，阳性对照VE在0.05％的给药浓度下，活性氧含量显著下降，说明本次实验有效。与阴性对照组组相比，三个样品在0.5％的给药浓度下，活性氧含量均极显著下降。说明三个样品(长双歧杆菌溶胞物、婴儿双歧杆菌溶胞物、副干酪乳杆菌溶胞物)对UVB刺激产生的活性氧有显著的抑制作用。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种溶胞物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将益生菌接种到发酵燕麦液中进行培养，培养完成后对所述发酵燕麦液离心、取上清液，所述上清液为溶胞物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌为乳杆菌和/或双歧杆菌；
所述乳杆菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、卷曲乳杆菌中的一种或多种；所述双歧杆菌包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵燕麦液中包括酶解燕麦粉和水；
或所述发酵燕麦液中包括酶解燕麦粉、酵母浸粉和水；
其中，所述发酵燕麦液中所述酶解燕麦粉的含量为6％-15％(w/v)，所述酵母浸粉的含量为0％-5％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述益生菌的接种量为1％-3％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，培养时间为18h-24h，培养温度为30-37℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，培养完成后对所述发酵燕麦液进行剪切、均质，然后进行离心、取上清液，所述上清液灭菌后储藏得到所述溶胞物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述剪切的转速为2500-3000rpm，剪切时间15-20min；所述均质先在100-400bar下均质2-4个循环，再在600-1500bar下均质5-12个循环。
8.一种由权利要求1～7中任一项所述制备方法制备得到的溶胞物。
9.根据权利要求8所述的溶胞物，其特征在于，所述溶胞物中包括：
抗氧化酶、抗氧化物质、抑菌物质及其他活性物质；
其中，所述抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶中的至少一种；
所述抗氧化物质包括多糖、β-葡聚糖、多酚化合物中的至少一种；
所述抑菌物质包括乳酸、醋酸、小分子多肽中的至少一种；
所述其他活性物质包括氨基酸、脂磷壁酸中的至少一种。
10.权利要求8或9中所述的溶胞物的应用，其特征在于，所述溶胞物应用于化妆品、食品、药品中。
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