CN113475672A - 一种大米发酵物、大米发酵抗氧化肽及制备方法 - Google Patents

一种大米发酵物、大米发酵抗氧化肽及制备方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种大米发酵物及其制备方法，包括：将大米粉与水按比例调配后，进行灭菌处理，冷却后制得大米发酵底物；将植物乳杆菌接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到大米发酵液；以及一种大米发酵抗氧化肽及其制备方法，对上述大米发酵液中加入乙醇，醇沉蛋白，提取粗多肽；然后采用离子交换法进一步从所述粗多肽中分离得到大米发酵抗氧化肽。上述制备方法提高了活性物质提取率，而且增强了活性物质的活性，所得大米发酵物人体安全性高，大米发酵抗氧化肽可清除体内多余的自由基，对皮肤具有较强的抗氧化功能，优于现有的抗氧化大米多肽。

Description

一种大米发酵物、大米发酵抗氧化肽及制备方法
技术领域
本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及一种大米发酵物、大米发酵抗氧化肽及制备方法。
背景技术
天然的抗氧化活性肽一般是由生物体自身分泌的，或者由生物体降解蛋白质产生的小分子多肽，可以清除细胞内产生的自由基或其他大分子的过氧化物，其拥有化学抗氧化剂不一样的优势，主要是安全性高而且抗氧化能力强，但是存在着价格高、易失活、颜色差异性大等缺点。
目前对天然抗氧化剂的研究主要集中在从各种廉价易于获得蛋白质如动物和植物通过各种生物、化学和物理的方法来分离制备安全、经济、高效的天然抗氧化活性肽。根据肽的来源，可以大致分为植物源抗氧化活性肽和动物源抗氧化活性肽。
中国植物资源丰富，研究人员从各种植物中获得了不同的植物源活性肽，根据植物来源不同可以分为不同的植物多肽。这些多肽又分为具有抗氧化能力的多肽、降血压的多肽、抑制细菌繁殖的多肽和调节机体免疫力的多肽。其中，植物来源的抗氧化活性肽不但具有较强的抗氧化活性，而且安全性极高。
对大米活性肽的研究表明，大米活性肽分为四类：大米抗氧化肽、大米风味调节肽、大米免疫力调节肽、大米降压肽。然而，这些具有不同活性的大米多肽的各种功能、作用机理，及它们的结构与氨基酸组成的关系有待进一步研究。大米原料来源广、安全性高，因此大米抗氧化肽近几年来受到研究人员的广泛关注，特别是在食品及医药领域具有广泛的应用前景。目前，制备大米抗氧化活性肽主要是采用酶解的方法。大米蛋白被酶降解后，大分子的蛋白质被裂解成了小分子的多肽类物质，易溶于水，进而被提取出来。使用酶消化裂解大米蛋白制备的大米多肽，溶解度好而且安全性高，在乳化性方面也要优于化学方法。并且，酶解法操作简单、条件温和，对蛋白的破坏性更低。酶解法使用的酶主要是植物蛋白酶、动物蛋白酶和微生物酶等来制备大米抗氧化肽。
目前，国内外对抗氧化肽的研究主要是通过控制水解酶的参数来酶解蛋白获得抗氧化多肽。同时，还有一些研究是采用发酵的方法来获得抗氧化多肽。发酵法制备大米抗氧化肽可以将酶的产生和裂解蛋白质的过程合二为一，生产流程简单，成本较低。同时，微生物发酵法制备抗氧化多肽的过程中，会产生端肽酶，对小分子多肽的末端进行修饰，制备的多肽稳定性更佳，抗氧化功效更强，同时具有微生物天然发酵的芳香味。利用微生物生长过程产生的蛋白酶分解蛋白质制备抗氧化肽已经成为了研究的热点。乳杆菌是发酵工业中使用较多的一类微生物，现在已经证明乳杆菌发酵物中具有清除超氧阴离子自由基和过氧化物的能力，比如用保加利亚乳杆菌发酵牛奶后，可从发酵液中分离出κ-酪蛋白肽，是一种抗氧化活性很强的多肽。
但是，根据发酵菌种、发酵底物和发酵工艺条件的不同，提取效果差别很大，如何筛选出更利于活性物质提取的方法，仍是本领域研发人员面临的技术难题。有赖于研究人员继续探索比如筛选出更多发酵底物组合、发酵菌种及发酵方法制备出更多、更优功效的产品以满足消费者需求。
发明内容
在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
为解决上述技术问题，本公开提供的技术方案是：
第一方面，本公开提供一种大米发酵物的制备方法，包括：
大米发酵底物制备步骤：将大米粉与水按比例调配后，进行灭菌处理，冷却后制得大米发酵底物；
发酵步骤：将植物乳杆菌接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到大米发酵液。
进一步地，上述大米发酵物的制备方法中，大米发酵底物制备步骤中，所述大米粉和水的质量比为1:1-1:20(比如1:2、1:3、1:5、1:8、1:12、1:15、1:18等)。
进一步地，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)。
进一步地，上述大米发酵物的制备方法中，用于接种的菌液的制备方法包括：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)接种于合适的培养基进行活化、纯化、扩大培养所得，所述菌液的OD值为0.5-1.0；所述菌液的体积和所述发酵底物的质量比为1mL/g:1-1:5mL/g(比如1:1.5mL/g、1:2mL/g、1:2.5mL/g、1:3mL/g、1:3.5mL/g、1:4mL/g、1:4.5mL/g等)。
进一步地，上述大米发酵物的制备方法中，所述大米粉的制备方法包括，首先将大米烘干至恒重，然后用粉碎机粉碎后过100目筛；优选地，烘烤温度不超过60℃。
进一步地，上述大米发酵物的制备方法中，所述发酵步骤中，所述发酵处理的温度为37-45℃(比如38℃、40℃、42℃、44℃等)，时间为6-36h(比如8h、10h、15h、20h、25h、30h、34h等)；优选地，发酵处理在摇床中进行，转速为150r/min-180r/min(比如155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、175r/min)。
进一步地，上述大米发酵物的制备方法中，所述灭菌处理的压力为0.2-0.4Mpa，温度为100-121℃(比如102℃、105℃、110℃、115℃、118℃等)，时间为15-30min(比如18min、20min、22min、25min、28min等)。
进一步地，上述大米发酵物的制备方法中，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min(比如4600r/min、4800r/min、5000r/min、5200r/min、5400r/min等)，离心时间为20min-40min(比如25min、30min、35min等)。
第二方面，本公开提供一种采用上述方法制备的大米发酵物，包括大米发酵液、大米发酵干粉等。
第三方面，本公开提供一种大米发酵抗氧化肽的制备方法，包括：
醇沉步骤：在上述大米发酵液中加入一定体积分数的乙醇，醇沉蛋白，提取粗多肽；
分离步骤：采用离子交换剂SP Sepharose Fast Flow作为分离介质，进一步从所述粗多肽中分离得到大米发酵抗氧化肽。
进一步地，上述大米发酵抗氧化肽的制备方法中，所用乙醇的体积分数为30-80％(比如35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％等)。
进一步地，上述大米发酵抗氧化肽的制备方法中，所述分离步骤包括：
将活化的SP Sepharose Fast Flow凝胶湿法装柱，自然沉降，沉降完成后用去离子水平衡12-24h，备用；
取醇沉后得到的粗多肽(即脱多糖处理后的大米发酵多肽)配制多肽溶液，过滤除去不溶物，上样后分别用去离子水、NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液。
第四方面，本公开提供一种大米发酵抗氧化肽，采用上述制备方法制成。
上述大米发酵抗氧化肽，优选地，为10氨基酸以下的小分子肽；更优选地，为5氨基酸以下的小分子肽。
本公开的有益效果包括但不限于：
1、本公开使用合适的菌种植物乳杆菌特别是其中的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC20261，对大米进行发酵，微生物在代谢过程中会产生各种各样的酶，而这些酶可以对植物中的活性成分进行提取与修饰，不但提高了活性物质提取率，而且增强了活性物质的活性；
2、本公开所采用的大米发酵物制备方法，在对大米有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，保持植物的天然活性；
3、本公开提供的大米发酵物人体安全性高；
4、本公开提供的纯化后的大米发酵抗氧化肽可清除体内多余的自由基，对皮肤具有较强的抗氧化功能，优于现有的抗氧化大米多肽。
附图说明
图1为实施例2制得的大米发酵液多肽纯化曲线示意图；
图2为实施例2制得的大米多肽的高效液相色谱图谱，其中，A为分子量检测结果示意图，B为以洗脱出峰时间为横坐标，以相对分子质量的对数值为纵坐标做标准曲线；
图3为实施例3制得的RFP，RFP I两个组分进行RP-HPLC分析所得洗脱曲线，其中，A为RFP的洗脱曲线，B为RFP I的洗脱曲线；
图4为实施例2制得的大米多肽的总抗氧化能力检测结果示意图；
图5为实施例2制得的大米多肽的羟自由基清除能力检测结果示意图；
图6为实施例2制得的大米多肽的超氧阴离子清除能力检测结果示意图。
具体实施方式
在下文中将结合示范性实施例对本公开的技术方案进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大米粉，采用购自于市面的大米，经干燥(60℃)、粉碎后筛分去除了尺寸较大的颗粒(过100目筛)所得。
下述实施例中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为No.CICC20261；所用培养基为MRS培养基；活化、纯化、扩培的培养温度30-37℃。
实施例1植物乳杆菌大米发酵实验。
使用植物乳杆菌菌种对大米进行液体发酵，包括如下步骤：
1、菌种活化：从保藏的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，使保持更高的生活力。
2、菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。
3、菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在适宜温度的摇床中培养，至其OD值＝0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度。
4、接菌和摇菌：把扩培培养基里的菌液接种到大米培养基(即大米发酵底物，即将大米粉与水按质量比为1:1-20混合、灭菌、冷却后所得)中，菌液体积与大米培养基质量的比为1:1-5ml/g，并且在摇床180r/min进行发酵处理，发酵温度为45℃，发酵时间为12-36h。
5、灭菌：将发酵后的培养液高压灭菌，使菌失活。
6、离心：离心处理培养液，4800r/min离心30min，保留上清液，由此制得一系列大米发酵液，具体参见下表1。
表1实施例1发酵工艺条件和产品性能
Figure BDA0003154904480000061
对本实施例制备所得的大米发酵液进行理化性质分析。其外观为粘稠液体、颜色为白色；pH值4.3-4.5，粘度160-180cP，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以大米发酵液符合化妆品质量要求。
对本实施例制得的大米发酵液的主要成分包括蛋白质、粗多糖、总酚进行检测。对本实施例制得的大米发酵液进行成分分析，可知，对于本实施例中编号为1的实验组，所制得的大米发酵液中含蛋白质0.25g/L、粗多糖0.082g/L、总酚0.078g/L。
实施例2性能评价实验。
本实施例继续从实施例1(编号1的实验组)所得大米发酵液中提取纯化得到大米多肽(即大米发酵抗氧化肽)，然后以已知氨基酸序列(Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe)的具有抗氧化活性的大米多肽作为对照，对其清除自由基能力进行分析，对其抗氧化性能进行评价。
一、大米发酵抗氧化肽的提取和纯化
对实施例1制得的大米发酵液中多肽进行提取与纯化，其中使用乙醇来提取蛋白，并用离子交换剂SP Sepherose Fast Flow作为分离介质分离出大米多肽。具体方法包括：
(1)首先在发酵液种加入体积分数为60％的乙醇，醇沉蛋白，提取得到粗多肽(RFP)。
(2)之后采用离子交换剂SP Sepharose Fast Flow作为分离介质分离多肽：将活化的SP Sepharose Fast Flow凝胶湿法装柱(1.6*20cm)，自然沉降，沉降完成后用去离子水平衡12h，备用。取粗多肽配制为4g/L的多肽溶液，上样量2mL；上样前过0.22mm孔径聚醚砜滤膜，除去不溶物。分别用去离子水、0.1mol/L和1mol/L的NaCl溶液在2mL/min的流速下进行洗脱，洗脱液每种收集30管，每管约为10mL。检测洗脱液的蛋白质浓度，以吸光度值为纵坐标，洗脱体积为横坐标，作洗脱曲线。合并相同峰组分。再生：用2.0mol/L NaCl清洗填料，流速2mL/min。
纯化曲线见图1，0-300mL时洗脱液为超纯水，300-600mL时洗脱液为0.1mol/mLNaCl，600-900mL时洗脱液为1mol/L NaCl。由洗脱曲线可知，有3个洗脱峰，第一洗脱峰在130mL开始出现，第二峰则在470mL左右出现，第三个峰在710mL时出现，分别收集。考虑到第二个峰含量较低，高浓度盐溶液为层析柱的再生条件，因此第三个峰会有大量杂质，故仅选用第一组分进行后续实验。将收集的组分透析后冻干，得到纯化大米发酵多肽组分命名为RFP I。
二、大米多肽结构分析及检测
对纯化后的多肽进行分子量的检测及测序，首先通过反向高效液相色谱法测定多肽分子量，之后再委托百泰派克公司进行蛋白/多肽鉴定。
其中高效液相色谱的条件为：
色谱柱：TsK gel 2000SWXL 300mm×7.8mm；
流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7)+0.3mol/L NaCl溶液；
检测波长：UV 220nm；
流速：1ml/min；
柱温：25℃。
标准样品：将牛血清蛋白(Mr 67000)、B12(Mr 1335)和氧化型谷胱甘肽(Mr 614)配成混合标准溶液，每种物质在混合液中的含量均为5mg/ml。
样品制备：以流动相为溶剂将大米多肽配成5mg/ml，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后准备进样。然后对照多肽标准曲线，根据回归方程计算多肽样品的分子量。
图2中的A为三种标准样品的高效液相色谱(HPLC)图谱，三种标准样品分别为牛血清白蛋白(Mw67000)，维生素B12(Mw1335)，氧化型谷胱甘肽(Mw614)，由于使用的柱子型号为TSKge1 2000SWXL(凝胶柱)，所以根据凝胶渗透层析原理，分子量大的物质先被洗脱下来，从图中可以看到洗脱峰出现时所对应的洗脱时间分别为6.476min,9.643min,10.009min。图2中的B，以洗脱出峰时间为横坐标，以相对分子质量的对数值为纵坐标做标准曲线。得到回归方程：y＝-0.3814x+8.2968，R 2＝0.9996，线性良好。
取RFP，RFP I两个组分进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析，其洗脱曲线如图3所示，其中，A为RFP的洗脱曲线，B为RFP I的洗脱曲线。从图中可以看出，RFP为未纯化组分，有9个峰，其分子量分别为9.81×103Da、5.51×103Da、1.27×103Da、656.78Da、459.54Da、319.478Da、148.06Da、66.56Da、34.40Da，其对应的峰面积分别为0.31％、2.40％、0.24％、18.06％、15.20％、24.70％、9.96％、7.74％、20.46％；RFP I为纯化的第一组分多肽，有6个峰，其分子量分别为702.27Da、505.06Da、358.60Da、172.51Da、82.51Da、44.76Da，其对应的峰面积依次为22.25％、20.30％、29.18％、8.72％、4.82％、14.72％，氨基酸的平均分子量为128，纯化收集的组分RFP I为5氨基酸以下的小分子肽。
由下文表2中的RFPⅠ多肽测序结果可知，各成分含量从上到下依次降低。RFPⅠ是多肽的混合物。RFPⅠ是10肽以下的小分子肽，含量最多的多肽氨基酸序列为Pro-Leu-Leu(PLL)。已有研究表明，Tyr(Y)具有酚羟基结构，能提供质子猝灭自由基，与Tyr邻近的Asp(D)和Glu(E)的羧酸根具有吸电子作用，使Tyr酚羟基上氧电子云密度减弱，更有利于质子的释放，增强了Tyr的质子供体效应。RFPⅠ中，YNDGDAPIVA、YNDGDAPIV、YNEGDAPVVA 三种肽段的端为具有Tyr，并且邻近Tyr存在Asp和Glu，由此可以推断，YNDGDAPIVA、YNDGDAPIV、YNEGDAPVVA在RFPⅠ中具有较强的抗氧化功能。当肽链的端位为疏水性氨基酸Leu(L)时，使抗氧化肽与脂肪酸的相互作用增强，可以提高肽链对脂质自由基的捕捉能力。RFPⅠ中PLL、LLLP、LLSPF，这3种肽段的端为具有Leu，因此可以推断，PLL、LLLP、LLSPF在RFPⅠ中发挥了较强的抗氧化能力。因此，RFPⅠ的抗氧化能力，可能与下文表2中的YNDGDAPIVA、YNDGDAPIV、YNEGDAPVVA、PLL、LLLP、LLSPF，6种多肽有关。
表2 RFPⅠ的多肽测序结果
序列Sequence 长度Length 分子量Mass(Da)
PLL 3 341.23146
YNDGDAPIVA 10 1033.4716
LLLP 4 454.31552
YNDGDAPIV 9 962.43453
LLSPF 5 575.3319
VRVF 4 519.31692
FYNDGDAPIV 10 1109.5029
YNEGDAPVVA 10 1033.4716
三、大米多肽的抗氧化性能检测
1.总抗氧化能力测定(ABTS自由基清除实验)
将RP、RFPⅠ配置成5g/L的溶液，其中，RP为已知氨基酸序列(Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe)、具有抗氧化活性的大米多肽，阳性对照为还原性谷胱甘肽(下同)，通过总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)测定大米多肽的抗氧化性能。
由图4可知，当RFPⅠ和RP的质量浓度为5g/L时，RP的总抗氧化能力相当于0.497mM的Trolox溶液，RFPⅠ的总抗氧化能力相当于0.589mM的Trolox溶液，表明两种多肽均有一定的总抗氧化能力(还原型谷胱甘肽在此浓度范围内的总抗氧化能力相当于1.095mM的Trolox溶液)，并且RFPⅠ比RP的总抗氧化能力高，是RP总抗氧化能力的1.185倍。
2.羟自由基清除实验
取0.5mL 0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶于试管中，依次加入1mL 0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH＝7.4)和0.5mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4)，混匀后，加入0.5mL 0.01％双氧水(H2O2)，于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值所得数据为损伤管吸光度A损伤，未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5mL0.01％双氧水操作方法同损伤管可测得未损伤管的吸光度值A未损伤样品管以样品代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得样品管中的吸光度A样品，按照下式计算样品对OH的清除率.
清除率I(％)＝100％*(A样品-A损伤)/(A未损伤-A损伤)
通过对羟自由基清除实验，做出实施例1制得的大米发酵液对羟自由基清除作用曲线，见图5。在样品浓度为2-10g/L范围内，RP和RFPⅠ的对羟自由基的抑制率随着浓度的升高而逐渐增加并且趋于平稳。RP对羟自由基的抑制率在12.85％-74.73％之间，RFPⅠ的对羟自由基的抑制率在28.22％-83.09％之间，还原型谷胱甘肽(图5中未示出)对羟自由基的抑制率在96.15％-97.91％之间，变化较小。由图5可得，RP对羟自由基的IC50为6.73g/L，RFPⅠ对羟自由基的IC50为4.41g/L，还原型谷胱甘肽对羟自由基的IC50为0.20g/L(图5中未示出)。
3.超氧阴离子清除实验
在一系列的试管中加入2.8mL0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液(一定要调到pH8.2)然后加入0.1mL不同浓度的样品溶液，混合均匀，于25℃水浴中保温10min；然后加入25℃水浴预温的3mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混匀后迅速加入干燥的石英比色皿中，在325nm下每隔半分钟测定一次OD值，反应4.5min结束。以0.1mol/L，pH8.2的Tris-HCL缓冲液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品，作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按照下式计算样品对O2·的清除率。
清除率I(％)＝100％*(V对照-V样品)/V对照，式中：
V对照:对照组邻苯三酚自氧化速率(△OD/min)
V样品:样品组邻苯三酚自氧化速率(△OD/min)
通过对超氧阴离子清除实验，做出实施例1制得的大米发酵液对超氧阴离子自由基清除作用曲线，见图6。在质量浓度为2-10g/L范围内，RP和RFPⅠ的对超氧阴离子自由基的抑制率随着浓度的升高而逐渐增加并且趋于平稳。RP对超氧阴离子自由基的抑制率在9.16％-20.34％之间，RFPⅠ的对超氧阴离子自由基的抑制率在11.30％-22.07％之间，还原型谷胱甘肽对超氧阴离子自由基的抑制率在92.15％-96.91％之间，变化较小(图中未示出)。在质量浓度为2-10g/L范围内，RFPⅠ对超氧阴离子自由基的清除能力要强于RP对超氧阴离子自由基的清除能力。
对比例
另选用三种乳杆菌对大米进行发酵，菌名称分别为：类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)编号为No.CICC20241，高加索酸奶乳菌(Lactobacilluskefiri)编号为No.CICC20261，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)编号为No.CICC20261，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。发酵条件如下：把扩培培养基里的菌液接种到大米培养基(即大米发酵底物，即将大米粉与水按质量比为1:10混合、灭菌、冷却后所得)中，菌液体积与大米培养基质量的比为1ml:5g，并且在摇床180r/min进行发酵处理，发酵温度为45℃，发酵时间为24h。
通过检测发酵液中的活性物质含量及体外抗氧化功效评价对菌种进行筛选，通过表3可知，植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum)相比其他三种乳酸菌发酵产物的多肽、多糖、多酚含量较优。
表3实施例1与对比例菌种发酵效果比对
Figure BDA0003154904480000111
最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种大米发酵物的制备方法，其特征在于，包括：
大米发酵底物制备步骤：将大米粉与水按比例调配后，进行灭菌处理，冷却后制得大米发酵底物；
发酵步骤：将植物乳杆菌接种至所述大米发酵底物，进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到大米发酵液。
2.根据权利要求1所述的大米发酵物的制备方法，其特征在于，所述大米发酵底物制备步骤中，所述大米粉和水的质量比为1:1-1:20；优选为1:10-1:20。
3.根据权利要求1或2所述的大米发酵物的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的大米发酵物的制备方法，其特征在于，用于接种的菌液的制备方法包括：将所述植物乳杆菌接种于合适的培养基进行活化、纯化、扩大培养所得，所述菌液的OD值为0.5-1.0；所述菌液的体积和所述发酵底物的质量比为1:1mL/g-1:5mL/g；优选为1:2mL/g-1:5mL/g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的大米发酵物的制备方法，其特征在于，所述大米粉的制备方法包括，首先将大米烘干至恒重，然后用粉碎机粉碎后过100目筛；优选地，烘烤温度不超过60℃。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的大米发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，所述发酵处理的温度为37-45℃，时间为6-36h；优选地，发酵处理在摇床中进行，转速为150r/min-180r/min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的大米发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的压力为0.2-0.4Mpa，温度为100-121℃，时间为15-30min；
优选地，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min，离心时间为20min-40min。
8.一种大米发酵物，其特征在于，采用如权利要求1-7中任一项所述的方法制备的大米发酵液或大米发酵干粉。
9.一种大米发酵抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括：
醇沉步骤：在如权利要求1-7所述制备方法制得的大米发酵液中加入一定体积分数的乙醇，醇沉蛋白，提取粗多肽；
分离步骤：采用离子交换法进一步从所述粗多肽中分离得到大米发酵抗氧化肽；
优选地，所用乙醇的体积分数为30-80％。
进一步地，所述分离步骤包括：
将活化的SP Sepharose Fast Flow凝胶湿法装柱，自然沉降，沉降完成后用去离子水平衡12-24h，备用；
取醇沉后得到的所述粗多肽配制多肽溶液，过滤除去不溶物，上样后分别用去离子水、NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液。
10.一种大米发酵抗氧化肽，采用如权利要求9所述的制备方法制成；优选地，所述大米发酵抗氧化肽为10氨基酸以下的小分子肽；更优选地，为5氨基酸以下的小分子肽。
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