CN114948833B - 可用于化妆品的黄花菜发酵物及其制备方法、应用 - Google Patents
可用于化妆品的黄花菜发酵物及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了一种可用于化妆品的黄花菜发酵物及其制备方法，制备方法包括：将黄花菜粉与适量的水混合经灭菌处理、冷却后得到发酵底物；往所述发酵底物接种乳酸菌或酵母菌进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到黄花菜发酵液。本公开提供的两种黄花菜发酵原浆pH＝4.3‑4.5，适合人体皮肤，且对人体的安全性高，可直接用作化妆品；两种黄花菜发酵物可以作为化妆品天然植物原料用于化妆品，相比水提物，对皮肤具有较强的抗氧化、抗炎、美白功能，同时还具有良好的人体安全性。
Description
技术领域
本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及一种可用于化妆品的黄花菜发酵物及其制备方法、应用。
背景技术
黄花菜(学名：Hemerocallis citrina Baroni)又名萱草、金针菜、柠檬萱草、忘忧草，属百合目百合科多年生草本植物。黄花菜在我国已有2000多年的栽培历史，经长期自然及人工选择，形成了丰富的品种资源。
黄花菜不仅可以作为观赏花卉，还是具有药用价值和食用价值的植物，是蔬菜中的四大珍品之一。黄花菜含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂类、脂肪、胡萝卜素、糖类以及丰富的微量元素。食用黄花菜可以滋润皮肤，增强皮肤的韧性和弹力，使皮肤水嫩饱满、光滑柔软，防止皮肤老化，祛除色斑，保持皮肤白嫩细腻。尤其对于因精神紧张、压力过大而引起的神经紊乱、内分泌失调而出现的黄褐斑，有很好的缓解作用。黄花菜的花蕾及根等部位中含有类黄酮类、蒽醌类、萜类、生物碱类、甾体、皂苷以及酚酸类等多种生物活性成分，并能表现出抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、改善睡眠及镇静、抗菌、抗炎和护肝等方面的生物活性功能。
目前市场上含有黄花菜成分的化妆品，都是在化妆品基础配方内添加一定比例的萱草花提取物(别名黄花菜提取物)，其添加量较低，同时受提取条件限制，提取物中所含物质成分有限，不能充分发挥黄花菜的功效。目前，采用发酵黄花菜的方法已经应用到食品领域，但尚未发现采用发酵黄花菜应用于化妆品领域的研究，而且现有技术中黄花菜发酵产品的发酵周期较长，且发酵步骤繁琐，造成发酵过程中能耗较大，产品成本较高。有必要继续研究效果更为优良的黄花菜提取物及制备方法。
发明内容
在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
鉴于现有技术的上述缺陷，本公开的目的是提供一种可用于化妆品的黄花菜发酵物及其制备方法、应用，利用乳酸菌或酵母菌对黄花菜进行发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了传统提取方法造成的活性成分流失，得到的发酵产品具有良好的安全性和抗氧化、抗炎功效。
根据本公开的第一个方面，提供了一种可用于化妆品的黄花菜发酵物的制备方法，包括：
将黄花菜粉与适量的水混合经灭菌处理、冷却后得到发酵底物；
往所述发酵底物接种乳酸菌或酵母菌进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到黄花菜发酵液。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述黄花菜粉和水的用量比为1:100g/ml-1:40g/ml(比如1:90g/ml、1:80g/ml、1:70g/ml、1:60g/ml、1:50g/ml等)。如果如用水量太多制备的发酵液可能活性成分浓度太低，如用水量过少则发酵前水溶液中会某些物质比如酸类浓度太高，影响菌的生长，对发酵不利。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述乳酸菌为植物乳杆菌，其他乳酸菌亦可，但效果不及植物乳杆菌。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述酵母菌为黄酒酵母，其他酵母菌亦可，但效果不及黄酒酵母。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述黄花菜粉的粒度为过50目筛。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，用于接种的乳酸菌菌液或酵母菌菌液通过将菌种依次活化、纯化、扩培所得，其OD值为0.5-1.0，所述乳酸菌菌液或酵母菌菌液和所述发酵底物的体积比为1:5-1:20(比如1:6、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18等)。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述乳酸菌发酵液发酵处理的温度为37-45℃(比如38℃、40℃、42℃、44℃等)，时间为6-16h(比如7h、8h、10h、12h、14h、15h等)，酵母菌发酵液发酵处理的25-30℃(比如26℃、27℃、28℃、29℃等)，时间为36-60h(比如40h、45h、48h、52h、56h、58h等)；更优选地，所述发酵处理在摇床中进行，设定转速为150r/min-180r/min(比如155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、175r/min)。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理的压力为0.2-0.4Mpa，温度为100-121℃(比如102℃、105℃、110℃、115℃、118℃等)，时间为15-30min(比如18min、20min、22min、25min、28min等)。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为4500r/min-5500r/min(比如4600r/min、4800r/min、5000r/min、5200r/min、5400r/min等)，离心时间为20min-40min(比如25min、30min、35min等)。
上述黄花菜发酵物的制备方法中，作为一种优选实施方式，还包括：对所述黄花菜发酵液进行干燥处理，最终得到黄花菜发酵干粉；更优选地，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥等。
根据本公开的第二方面，还提供了一种采用上述方法制备的发酵产品，包括发酵液、发酵干粉等。
根据本公开的第三方面，还提供了上述发酵产品在制备化妆品中的应用；优选地，所述化妆品可以是面膜、精华液、爽肤水、乳液等。
按照本公开的方法制得的黄花菜发酵物具有良好的抗炎、抗氧化的作用，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，制备包括但不限于：面膜、精华液、爽肤水、乳液等化妆品中。
目前，市面上有作为化妆品原料的黄花菜提取物，但对其提取方法披露较少，且黄花菜提取物添加在化妆品中，所含物质成分有限，不能充分发挥黄花菜的功效。黄花菜发酵产品的应用领域主要集中食品领域，对于化妆品领域的研究应用几乎没有。现有技术中，黄花菜发酵产品的发酵周期较长，且发酵步骤繁琐，造成发酵过程中能耗较大，产品成本较高。
本发明的方案是分别采用乳酸菌和酵母菌发酵黄花菜的制备方法，以黄花菜为发酵底物，乳酸菌和酵母菌为发酵菌种进行发酵，发酵结束进行灭菌、分离处理取上清液，得到两种黄花菜发酵液，可以用作化妆品原料。本发明过程简便，操作简单，得到的黄花菜发酵物作为化妆品原料具有较好的抗炎、抗氧化、美白能力以及安全性。
本公开与相比现有技术具有如下有益效果：
(1)分别采用乳酸菌和酵母菌发酵的方式，以黄花菜为底物经过灭菌处理，接入相应量菌在恒温恒湿箱中进行发酵，其发酵过程中步骤简便，操作简单，能耗较小，可以节约成本。
(2)本公开所采用的发酵法，分别采用乳酸菌和酵母菌对黄花菜进行发酵，在对黄花菜有效成分提取过程中，不添加任何有机试剂，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，提高植物的天然活性，避免了其他提取方法造成的活性成分流失。
(3)本公开提供的两种黄花菜发酵原浆pH＝4.3-4.5，适合人体皮肤，且对人体的安全性高，可直接用作化妆品。
(4)本公开提供的两种黄花菜发酵物可以作为化妆品天然植物原料用于化妆品，对皮肤具有较强的抗氧化、抗炎、美白功能，同时还具有良好的人体安全性。
附图说明
图1示出了实施例3中黄花菜发酵液抗炎性能测试结果；
图2示出了实施例4中黄花菜发酵液抗氧化功效测试结果；
图3示出了实施例5中黄花菜发酵液美白功效测试结果；
图4示出了实施例6中鸡胚绒毛尿囊试验结果；
图5示为实施例6中红细胞溶血实验中的溶血曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中黄花菜粉为市售晒干后的黄花菜花，购自北京同仁堂，粉碎后经过筛分(过50目筛)去除了尺寸较大的颗粒。
下述实施例中乳酸菌为植物乳杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC20261；酵母菌为黄酒酵母，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC21392；所用培养基为MRS培养基；菌种活化、纯化、扩培的培养温度28-37℃。
实施例1乳酸菌发酵制备黄花菜发酵物
本实施例采用乳酸菌发酵制备黄花菜发酵物；具体制备步骤如下：
(1)菌种活化：从保藏的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，使保持更高的生活力。
(2)菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。
(3)菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在适宜温度的摇床中培养，至其OD值＝0.6时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度。
(4)发酵底物制备：将黄花菜粉与水按1g:100ml的比例配制成黄花菜粉培养基，即发酵底物。
(5)乳酸菌发酵液制备：把扩培培养基里的菌液接种到黄花菜粉培养基中，菌液与发酵底物的体积比为1:15，并且在摇床中发酵，转速为180r/min，发酵温度为37℃，发酵时间为16h。取出料体，110℃灭菌30min，放凉后离心(4800rpm、30min)，在超清台中紫外照一些样品瓶杀菌备用。离心后，弃掉沉淀，留上清液，得到乳酸菌黄花菜发酵液置入样品瓶备用。
对本实施例制得的黄花菜发酵液进行理化性质分析。其外观为粘稠液体、颜色为浅棕红色；pH值4.4，粘度160P，可溶性固含物含量1.7％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以黄花菜乳酸菌发酵液符合化妆品质量要求。
实施例2黄酒酵母发酵制备黄花菜发酵物
本实施例采用黄酒酵母发酵制备黄花菜发酵物；具体制备步骤如下：
(1)菌种活化：从保藏的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，使保持更高的生活力。
(2)菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。
(3)菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在适宜温度的摇床中培养，至其OD值＝0.5时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度。
(4)发酵底物制备：将黄花菜粉与水按1g:100ml的比例配制成黄花菜粉培养基，即发酵底物。
(5)酵母菌发酵液制备：把扩培培养基里的菌液接种到黄花菜粉培养基中，菌液与发酵底物的体积比为1:15，并且在摇床中发酵，转速为180r/min，发酵温度为28℃，发酵时间为48h。取出料体，110℃灭菌30min，放凉后离心(4800rpm、30min)，在超清台中紫外照一些样品瓶杀菌备用。离心后，弃掉沉淀，留上清液，得到酵母菌黄花菜发酵液置入样品瓶备用。
对本实施例制得的黄花菜发酵液进行理化性质分析。其外观为微粘稠液体，颜色为浅棕色；pH值4.3，粘度160cP，可溶性固含物含量1.5％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以黄花菜酵母菌发酵液符合化妆品质量要求。
实施例3黄花菜发酵液抗炎功效分析
对上述实施例中得到的黄花菜发酵液进行抗炎功效分析。
一、采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎性HaCat细胞因子TNF-α、IL-6、COX-2的浓度。
简而言之，从24孔板上收集培养上清，测量方法使用制造商提供的(南京建成生物工程研究所，所用检测盒型号分别是TNF-αH052-1，IL-6H007-1-1，COX-2H200，COL-1A005-1-2)，包括：
1.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
2.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
3.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟(具体时间参照说明书)。
5.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
8.温育：操作同3。
9.洗涤：操作同5。
10.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
11.终止：每孔加终止液50μl，终止反应。(此时蓝色立即转黄色)
12.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
13.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
二、qRT-PCR检测炎性HaCat细胞因子TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的相对表达量。
1.按照总RNA抽提试剂和反转录试剂盒中(碧云天生物技术有限公司R0011、D7168L)的要求进行RNA的提取和反转录试验。
2.根据美国国家生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)发布的序列基因，用Primer Express软件设计出目的基因的特异性引物(包含管家基因β-actin)，如表1所示。
3.按照TransStart R Top Green qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司AQ131-01)要求，以反转录出的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR分析。
结果参见图1，从图中可以看出，相较于水提液(水提液为发酵液的样品对照，其制备步骤同发酵液，但其中不接入乳酸菌或黄酒酵母)，黄花菜发酵液具有较强的抗炎能力。
表1 Real-Time PCR引物序列
实验例4黄花菜发酵液抗氧化功效分析
对上述实施例中得到的黄花菜发酵液进行抗氧化功效分析。
1.DPPH自由基清除
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
在所有试管中(T、T0、C、C0)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用95％乙醇，补足3mL，混匀。在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL，样品本底(T0)和溶剂本底(C0)用95％乙醇代替，轻轻摇匀，室温下静置5分钟。将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。
表2样品加液要求
| T-样品管 | T0-样品本底 | C-DPPH管 | C0-溶剂本底 | |
| 样品溶液(mL) | 1 | 1 | - | - |
| 水或95％乙醇溶剂(mL) | 2 | 2 | 3 | 3 |
| DPPH乙醇溶液(mL) | 1 | - | 1 | - |
| 95％乙醇(mL) | - | 1 | - | 1 |
| 平行次数 | 3/样 | 1/样 | 3/试验 | 1/试验 |
通过下式计算DPPH自由基清除率，式中：T-样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；T0-样品本底吸光值；C-DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；C0-溶剂本底吸光值：
2.羟基自由基清除
取0.5mL 0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶于试管中，依次加入1mL 0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，PH＝7.4)和0.5mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4)，混匀后，加入0.5mL 0.01％双氧水(H2O2)，于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值所得数据为损伤管吸光度A损伤，未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5mL0.01％双氧水操作方法同损伤管可测得未损伤管的吸光度值A未损伤，样品管以样品代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得样品管中的吸光度A样品，按照下式计算样品对OH的清除率。
清除率I(％)＝100％*(A样品-A损伤)/(A未损伤-A损伤)
3.TEAC法总抗氧化能力测定
Trolox当量抗氧化能力(TEAC)是电子转移型的抗氧化能力测定方法之一，通常是测定果蔬抗氧化能力的标准方法。
标准曲线绘制：用蒸馏水配制溶液稀释标准品。把10mM Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。
样品测定：96孔板的每个检测孔中加入200微升ABTS工作液，空白对照孔中加入10微升蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入10微升各种浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10微升各种样品。轻轻混匀。孵育2-6分钟后在734nm测其吸光值A734。结果参见图2。
4.相关细胞因子检测
酶联免疫吸附法(ELISA)检测HaCat细胞因子CAT，COL-1的浓度。方法同上文实施例3。
结果参见图2，其中，第一和第二幅图中是发酵液原液加水稀释成不同浓度所测得的自由基清除率变化曲线图，第三幅至第五幅是用水稀释的发酵液(浓度2％，根据发明人之前做过细胞毒性实验，该浓度的发酵液基本上无细胞毒性)作为样品进行测试的结果。从图2可以看出，相较于水提液，两种黄花菜发酵液具有较好的抗氧化能力，特别是水提液的总抗氧化能力不如酵母菌发酵液和乳酸菌发酵液。
实施例5黄花菜发酵液美白功效分析
对上述实施例中得到的黄花菜发酵液进行美白功效分析。
采用酪氨酸酶多巴速率氧化法进行体外酪氨酸酶活性测定。
各反应体系的物质加入量及顺序见表3。在加入酪氨酸酶后，将反应体系置于37℃水浴中保温10min，再加入0.98g/L的L-多巴溶液，混匀，反应3min后于475nm处测定吸光值。
参见下式计算酪氨酸酶活性抑制率。
I＝[(A－B)－(C－D)]/(A－B)*100％
式中，A-对照组于有酪氨酸酶体系反应3min时的吸光值；
B-对照组于无酪氨酸酶体系反应3min时的吸光值；
C-样品组于有酪氨酸酶体系反应3min时的吸光值；
D-样品组于无酪氨酸酶体系反应3min时的吸光值；I-酪氨酸酶活性抑制率(％)。
表3反应液组成(mL)
胞内酪氨酸酶活性抑制试验：将对数生长期间的B16细胞，接种于6孔细胞培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。加入终浓度为2％的样品，样品用DMEM稀释。未加样品组做为细胞对照组，每组3个复孔。培养48h后，弃上清液，PBS洗涤1次，每孔加入100μL细胞裂解液，用刮刀刮取收集细胞，收集后取上清离心。取上清液50μL至96孔板，加入1％左旋多巴50μL，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。测量475nm处吸光度值。按下式算细胞反应体系下酪氨酸酶的相对活性。
A细胞＝(OD测定孔－OD空白对照)/(OD细胞对照组－OD空白对照)*100％
式中，A细胞-细胞反应体系下酪氨酸酶相对活性，％；
OD样品-含有待测样反应体系的吸光度；
OD空白对照-不含任何物质的空板吸光度；
OD细胞对照-不含待测样反应体系的吸光度。
结果参见图3，可以看出相较于水提液，两种黄花菜发酵液具有较好的美白功效。
实验例6黄花菜发酵液安全性功效分析
对上述实施例中得到的黄花菜发酵液进行安全性功效分析。
一、鸡胚绒毛***试验(HET-CAM)
鸡胚绒毛***试验(HET-CAM)是一种经典的眼刺激性体外评估方法，适用于对化妆品产品或原料的评价。绒毛***(CAM)是位于鸡胚周围的呼吸膜。本试验利用孵化中期的CAM血管膜***完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与CAM接触，作用一段时间之后通过观察绒毛***毒性效应指标(如：出血、凝血和血管融解)的变化，组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。这些指标反映了血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及绒毛***蛋白质变性等现象及其受损程度。
采用终点评价法进行的试验，应计算终点评分(ES)。根据鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度；每个样品做六组平行试验，并将各血管反应分值相加，以总分值最高的血管反应得分作为最终分值以该组中评分最高的值作为反应ES值。根据ES数值按表4对受试物眼刺激性进行分类。
表4 HET-CAM终点评估法的眼刺激性预测模型
受试物包括：阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和两种黄花菜发酵液(原液，设置6个平行)。鸡胚绒毛***试验结果见图4，从图中可以看出，样品作用其前后均无出血现象，再根据评分可知黄花菜发酵液无眼刺激性。
对阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和黄花菜发酵液加样前后的CAM进行形态学观察和打分，得到表5如下，其中编号1、2、3、4、5、6分别为样品的平行。
表5黄花菜发酵液鸡胚绒毛***试验实验记录
二、红细胞溶血实验
红细胞溶血实验(Red blood cell test，RBC)，是兔眼刺激实验(Draize test)的替代方法之一。红细胞被认为是研究生物膜效应最好的生物来源，操作性强且同质性好。RBC实验的基本原理是通过检测红细胞中血红蛋白的漏出量及蛋白质的变性程度来评价化学品对眼组织的刺激性。国际上也广泛地将RBC实验用于化妆品产品及原料等化学品的眼刺激性研究。
本实验的具体步骤如下：
1.RBC的前处理
(1)血液的获取和运输
屠宰场取新鲜兔血盛装于聚乙烯塑料容器中，按1：9加入抗凝剂柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21-22℃。30分钟内运于实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1小时。
(2)RBC的分离
1)分装稀释：收集新鲜血液(已用柠檬酸抗凝剂处理)用PBS溶液稀释(血液：PBS＝4：10体积比)；
2)离心去杂：在室温下，用1500×g离心上述稀释液10min，离心后的上清液和淡黄色的白细胞层小心地吸掉，然后添加PBS重复上述洗涤离心步骤2-3次(第2次离心时打开酶标仪预热15min)。
3)RBC悬液配制：最后一次离心后，将沉淀的细胞用PBS稀释至浓度约为2％红细胞悬液(约2mL沉淀+98mL PBS)，轻轻摇晃均匀。
4)RBC浓度校准：取0.5mL上述细胞悬液于10mL EP管中，加入蒸馏水稀释至5mL，混匀反应1分钟，用酶标仪在541nm处测量(PBS为空白对照，用红细胞悬液调吸光度)，理想的吸光值应为0.5(±5％)。将处理好的RBC悬液密封于4℃储存。
2.溶血曲线的测定
(1)将黄花菜发酵液PBS稀释而成体积浓度为10％、20％、40％、60％、80％、100％的样品溶液，然后将各浓度梯度样品溶液与RBC悬液按3：1的比例添加(750μL样品+250μLRBC)，混匀。
(2)将受试物RBC混合液在室温下摇床孵育60min。
(3)将各EP管置于离心机中，10000rpm/min速度离心1分钟，终止孵育。
(4)取上清液测量其在540nm处的吸光度值。每个浓度做三个平行，结果取平均值。
(5)同时测定对照组：
阴性对照(零溶血)：750μL PBS+250μL RBC，设阴性对照的溶血率为0％；
阳性对照：750μl 0.1％SDS水+250μL RBC；
完全溶血对照：750μL水+250μL RBC，设完全溶血对照的溶血率为100％。
3.数据处理
将各组在560nm波长下测得的吸光度OD值与浓度梯度曲线，取线性区作回归线，并将560nm***性对照与阳性对照OD值的差值带入回归线方程，得到H50(以在测试体系中的浓度表示)。
计算公式如下：
红细胞溶血实验结果如下。
溶血曲线见图5，由图5可以得知上述步骤制得的黄花菜发酵液的溶血率低于水提液。
最后还需要说明的是，在本公开中，如有诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。
Claims (11)
1.一种用于化妆品的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，包括：
将黄花菜粉与适量的水混合经灭菌处理、冷却后得到发酵底物；
往所述发酵底物接种乳酸菌进行发酵处理，然后灭菌、分离处理取上清液，得到黄花菜发酵液；
所述乳酸菌为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC20261；
所述黄花菜粉和水的用量比为1:100 g/ml-1:40 g/ml；所述乳酸菌发酵处理的温度为37-45℃，时间为6-16h。
2.根据权利要求1所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，所述黄花菜粉的粒度为过50目筛。
3.根据权利要求1或2所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，用于接种的乳酸菌菌液通过将菌种依次活化、纯化、扩培所得，其OD值为0.5-1.0，所述乳酸菌菌液和所述发酵底物的体积比为1:5-1:20。
4.根据权利要求1所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵处理在摇床中进行，设定转速为150 r/min-180r/min。
5.根据权利要求1、2、4中任一项所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的压力为0.2-0.4Mpa，温度为100-121℃，时间为15-30min。
6.根据权利要求1、2、4中任一项所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，所述分离处理采用离心方法。
7.根据权利要求6所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，所述分离处理的离心转速为4500r/min -5500r/min，离心时间为20min-40min。
8.根据权利要求1、2、4、7中任一项所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，还包括：对所述黄花菜发酵液进行干燥处理，最终得到黄花菜发酵干粉。
9.根据权利要求8所述的黄花菜发酵物的制备方法，其特征在于，所述干燥处理采用喷雾干燥或真空冷冻干燥。
10.一种用于化妆品的黄花菜发酵物，其特征在于，采用如权利要求1-9中任一所述方法制备的发酵产品。
11.一种化妆品，其特征在于，包含如权利要求10所述的黄花菜发酵物。
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